Appunti completi del corso Strutture biomimetiche e bioartificiali

Strutture bioartificiali e biomimetiche

Lezione 1: introduzione

Rigenerazione: generazione di un nuovo tessuto funzionalmente e strutturalmente analogo al tessuto o organo malato o danneggiato.

Medicina rigenerativa: ogni terapia volta ad indurre la rigenerazione di tessuti o organi a seguito di malattie o lesioni, rigenerazione ottenuta tramite terapia genica, terapia cellulare o ingegneria dei tessuti, o entrambe.

Un biomateriale è un materiale all’interfaccia con sistemi biologici per indagare, curare, aumentare o sostituire un tessuto, un organo o una funzione del corpo oppure una sostanza che è stata ingegnerizzata per prendere una forma che, da sola o come parte di un sistema complesso, sia utilizzata per orientare, mediante il controllo di interazioni con componenti del sistema vivente, il corso di una procedura terapeutica o diagnostica.

Parlando di strutture bioartificiali e biomimetiche si intende:

• Bioartificiali: materiali da selezionare per andare a meglio sostituire il tessuto e avere le caratteristiche più adeguate al tessuto scelto, non sono tutti universali.
• Biomimetiche: cercano di imitare il tessuto naturale, quindi serve trovare degli approcci ingegneristici che arrivino a meglio mimare la funzione del tessuto stesso.

Gli altri approcci si stanno sviluppando negli ultimi anni con i modelli in vitro, che dovrebbero permettere la riduzione dell’uso sperimentale animale.

Esame: attività di gruppo in aula con voto in trentesimi. Devo superare la prima parte dell’esame con almeno 7 punti. Si può fare anche un orale integrativo per 1/2 punti in più.

Metodi di caratterizzazione di scaffold, strutture 3D, matrici per la medicina rigenerativa

Non interessa come funziona la tecnica, ma ci serve sapere quando e quali informazioni posso ricavare usando quella determinata tecnica.

Analisi morfologica: ci serve capire cosa trarre dalle immagini al microscopio. È come la aspettavamo? Ci sono tante tecniche di analisi, ad occhio nudo, con microscopi ottici o elettronici, che man mano arrivano a lunghezze sempre minori. Ho:

• Microscopio ottico: ci permette di vedere tutti gli aspetti biologici, come studiare le cellule. Quello a fluorescenza/confocale usa molecole che sono fluorofori che assorbono la luce di uno specifico colore e li eccita in uno stato di energia. È un microscopio, quello confocale, più adatto su strutture 3D perché fa analisi su diversi piani a differenza di quello a fluorescenza. Oltre a questi si ha quello stereo, con grandi lenti di ingrandimento. Prima si aveva solo un sistema di lenti, qui molto di più simile ai nostri occhi che ci dà la tridimensionalità.
• Microscopio a fluorescenza/confocale: usa molecole che sono fluorofori che assorbono la luce di uno specifico colore e questo assorbimento li eccita in uno stato di energia. Questa energia viene poi riemessa come luce di una maggiore lunghezza d’onda. È un microscopio, quello confocale, più adatto su strutture 3D perché fa analisi su diversi piani a differenza di quello a fluorescenza.
• Microscopio ottico stereo: due microscopi monoculari separati ciascuno con il proprio set di lenti, con grandi lenti di ingrandimento. Prima si aveva solo un sistema di lenti, qui molto di più simile ai nostri occhi che ci dà la tridimensionalità.
• Microscopio elettronico a scansione: con un fascio elettronico che colpisce il mio oggetto, mi serve lavorare sottovuoto, si deve trattare l’oggetto da analizzare. Viene utilizzato per esaminare le caratteristiche fisiche con dimensioni tra i micron e i nanometri. Il campione deve essere conduttivo per poter creare il vuoto. Quelli di ultima generazione permettono di analizzare i campioni senza dover andare sottovuoto. Quando il fascio colpisce il campione ci sono tre effetti importanti poi analizzati:

1. Elettroni retrodiffusi: mi dice come è composto il materiale. Il fascio elettronico colpisce il campione e alcuni elettroni interagiscono con il nucleo dell’atomo. Vedo delle tonalità di grigio (BSE) che dicono che la superficie che sto analizzando ha diversi elementi dati dal diverso segnale emesso. Come nomino i colori? Uso il terzo segnale emesso, i raggi X.
2. Elettroni secondari: il fascio elettronico colpisce il campione e alcuni elettroni interagiscono con gli elettroni presenti nell’atomo, si ha repulsione tra gli elettroni. Mi danno informazioni sulla morfologia/topografia del campione.
3. Raggi X: riesco a dare un nome a ciascuna di quelle macchie di grigio viste prima. Mi fa realizzare delle analisi puntuali sulle aree del campione.

Per vedere il campione al SEM dovrei lasciarlo all’aria ma perde la sua morfologia quindi si fa un trattamento di fissaggio della componente biologica. Si usa la gluteraldeide (pH = 6.8 – 7.4) che reticola le catene di collagene, per fissare il collagene del materiale in una determinata morfologia. Dopo il fissaggio si va in frigorifero, poi lavaggio e disidratazione. Una volta reticolata insieme alla gluteraldeide vado a disidratare il campione. Per eliminare l’acqua e sostituirla con etanolo faccio diversi passaggi per mantenere la sua struttura.

Con il SEM ottengo:

• Immagini ad alta risoluzione della topografia superficiale.
• Microanalisi elementare e caratterizzazione di particelle.
• PRO: rapida, ad alta risoluzione di immagini, rapida identificazione degli elementi presenti, modalità di basso vuoto permette l'imaging di campioni isolanti e idratati.
• CONS: restrizioni nella dimensione che possono richiedere il taglio del campione.

Caratterizzazione chimico/fisica

Serve una caratterizzazione chimico fisica oltre alla morfologia, vedere le caratteristiche intrinseche dei materiali. Scopo: determinare per quanto tempo la struttura rimane stabile e dopo quanto tempo inizia a degradare, valutazione della variazione di peso, valutazione della variazione dimensionale. Per fare questo, immergo i campioni in un ambiente di prova come acqua distillata o fisiologica.

Importante è anche la temperatura perché a diverse T i materiali hanno comportamenti differenti. Oltre alla T anche quanto cambia il peso. La prova di stabilità pesa il campione a diversi tempi differenti nell’esempio. Servono anche altre analisi che:

• Ci danno info sul comportamento termico dei materiali.
• Calcolare i pesi molecolari.

Queste due analisi si fanno e servono sempre? Serve capire quali sono necessarie in tutti i casi, servono magari in progettazione di un materiale nuovo per capire se le T sono esatte e i pesi servono di più delle caratterizzazioni termiche per capire se ci sono state variazioni durante il processo di lavorazione. Serve verificare se una variazione del peso molecolare fa variare anche la distribuzione di peso totale. La DSC, calorimetria differenziale a scansione, permette di avere delle informazioni sulla transizione termica dei materiali, misura il calore assorbito o liberato durante il riscaldamento o il raffreddamento di un provino di materiale metallico o polimerico rispetto ad un campione di riferimento (crogiolo vuoto) e la GPC invece misura le informazioni dei pesi molecolari.

Si ha inoltre l’analisi cromatografica: il campione da analizzare, generalmente in soluzione, viene fatto passare attraverso un riempimento (fase stazionaria) con diversa affinità con i componenti della miscela da analizzare, la soluzione da analizzare viene trasportata attraverso la colonna mediante il flusso continuo di un opportuno solvente (eluente o fase mobile).

Caratteristiche meccaniche

Importanti sono anche le prove meccaniche nei periodi di analisi, di trazione e compressione, oppure termo-dinamico-meccaniche e reologiche (per comportamento visco-elastico). Servono per capire per esempio quanto ci mette un materiale a degradare. Ci serve capire se il materiale ha le caratteristiche adeguate nel posto in cui andrà a lavorare, serve che mimi l’ambiente fisiologico e anche la temperatura.

Lezione 2: polimeri biodegradabili sintetici

I polimeri biodegradabili

I materiali polimerici sono:

• Omopolimeri: Parlando di materiali sintetici biodegradabili si avvicina ai materiali reticolati, tutte le catene esterne laterali hanno conseguenze sulla struttura dei materiali e influenzano il loro comportamento.
• Copolimeri: mette insieme unità diverse in catena e ottengo materiali con caratteristiche diverse da quelle di partenza. Progetto copolimeri che meglio soddisfano i requisiti richiesti per la generazione. La differenza tra uno e l’altro sta nel modo in cui le stesse molecole si legano tra di loro. Sono importanti quelli a blocchi, ripetizione di polimeri e poi affianco catene di un altro polimero sfrutta le caratteristiche tutte uguali di una catena vicine per ottenere caratteristiche specifiche del materiale. A seconda della percentuale che uso avrò caratteristiche diverse. Legami covalenti.
• Miscela/blend: rispetto ad un copolimero è come se mettessi insieme due materiali ma le interazioni che ci sono, sono di tipo debole. Vantaggiosi per la velocità del processo, invece la chimica del copolimero è più complessa.

Per materiale biodegradabile si intende ciò che deve essere completamente scisso attraverso meccanismi associati a organismi biologici e ai prodotti da essi secreti:

• In elementi primari ed innocui,
• Velocemente, in tempi relativamente rapidi,
• Con residui di decomposizione non tossici.

La rottura dei legami intramolecolari è data da enzimi o componenti biologiche e le catene macromolecolari si rompono. Ovviamente i prodotti che si generano non devono essere tossici. Per biodegradabilità si intendono tante cose:

• Bio-based: indica materiali o prodotti interamente o parzialmente derivati da biomassa: piante e vegetali, generalmente impiegato in relazione ai nuovi sviluppi nel campo delle bioplastiche, che utilizzano come materia prima biomasse (es., mais, canna da zucchero, cellulosa) in sostituzione dei derivati da fonti fossili come il petrolio. Non sono nati dalla catena del petrolio ma vengono ottenuti da piante vegetali o batteri, con fonte naturale (come acido polilattico estratto dalla canna da zucchero).
• Rinnovabili: materie prime rinnovabili: materie che per loro caratteristica intrinseca si rigenerano o non sono “esauribili” nella scala dei tempi “umani” e, per estensione, il cui utilizzo non pregiudica le risorse naturali per le generazioni future, fonti alternative.
• Biodegradabili: finiscono col dissolversi negli elementi che li compongono in condizioni ambientali naturali grazie all'azione di agenti biologici come batteri, piante, animali, sole e acqua. Queste sostanze si trasformano in nutrienti per il terreno, diossido di carbonio, acqua e biomassa; elementi non pericolosi per l'ecosistema. Tutti i materiali sono degradabili fattore determinante è la velocità con cui avviene il processo di biodegradazione.

Per misurare la biodegradabilità: prova standard UNI EN ISO, 14855-1:2013:

• Se il materiale si biodegrada del 90% in meno di 6 mesi può essere definito "biodegradabile" e venduto o utilizzato come tale. Si ha una norma che definisce come si deve disgregare per essere considerato biodegradabile.

Compostabile: materiale biodegradabile che possiede gli ulteriori requisiti di compostabilità secondo la norma EN 13432: a contatto con materiali organici per un periodo di 3 mesi, la massa del materiale deve essere costituita almeno per il 90% da frammenti di dimensioni inferiori a 2 mm (metodo standard EN 14045); il materiale non deve avere effetti negativi sul processo di compostaggio; bassa concentrazione dei metalli pesanti additivati al materiale; valori di pH entro i limiti stabiliti; contenuto salino entro i limiti stabiliti; concentrazione di solidi volatili entro i limiti stabiliti; concentrazione di azoto, fosforo, magnesio e potassio entro i limiti stabiliti. È diverso in tempi di tempo, i biodegradabili in un tempo e qui invece in base alla dimensione che ottiene. È una sottoclasse dei biodegradabili.

Riciclati: materiale realizzato utilizzando rifiuti derivanti dal post-consumo, nei limiti in peso imposti dalle tecnologie impiegate per la produzione del materiale medesimo. Materiali a fine vita che possono dar vita ad altri prodotti.

Riciclabili: materiali di scarto che possono essere utilizzati nuovamente in processi di produzione (es. vetro, carta e cartone, alluminio, alcune materiali plastiche e legno); dividere correttamente i rifiuti, attraverso una raccolta differenziata consapevole, permette di trasformare questi elementi di scarto in una risorsa, donandogli nuova vita, riducendo i materiali che finiscono in discarica.

Per la medicina rigenerativa ci interessano le bio-based e biodegradabili. Le bioplastiche sono un materiale plastico se è bio-fased, biodegradabile o presenta entrambe le proprietà.

Polimeri degradabili

Serve adattare la degradazione, capire in quanto tempo serve che si degradi per una determinata funzione, per ogni funzione bisogna capire il materiale adatto e la struttura per avere una velocità di degradazione nel tempo che si bilanci con la rigenerazione del tessuto. Si deve considerare anche:

• Geometria della struttura: che va di pari passo con la
• Porosità: queste due cambiano per il volume di superficie esposta.
• Ambiente: cambia il pH della posizione in cui si è quindi bisogna capire in che sito biologico il materiale andrà a lavorare, perché se vado in ambiente acido e questo influenza la velocità di degradazione del materiale, o anche il basico. Ma non solo l’aspetto chimico, anche gli stress meccanici presenti, devo tener conto di tutte le condizioni al contorno.

Requisiti per un materiale biodegradabile per la preparazione di scaffold e sistemi di delivery

Importante è che sia accettabile, shelf life, per evitare che perda le caratteristiche prima dell’impianto così che la sua degradazione non avvenga prima. Altra cosa importante è la sterilizzazione, che può influenzare le caratteristiche dei materiali, serve il metodo che meno le influenzi. Questi quindi sono:

• Non evocare una risposta infiammatoria non fisiologica o effetti tossici successivi all’impianto nel corpo umano.
• Accettabile shelf life.
• Prodotti di degradazione non tossici e in grado di essere metabolizzati dal corpo umano.
• Bilanciamento tra tempo di degradazione e processo di guarigione/rigenerazione dei tessuti.
• Proprietà meccaniche adeguate ad un'applicazione e alla variazione delle proprietà meccaniche durante la degradazione.
• Facilmente processabile.
• Sterilizzabile (variazione accettabile del peso molecolare).

Meccanismi di degradazione nel corpo umano

Nel corpo umano i materiali si degradano con due principali meccanismi:

• Uno idrolitico: polilattico nel corpo umano.
• Uno enzimatico: polilattico nel terreno.

Un materiale più idrofobico si degraderà più lentamente nel corpo, ha catene più lunghe che ci mettono di più a degradarsi. Il PM può influenzare anche perché serve un PM minore rispetto ad un materiale che si usa in zone più caricate. La degradazione può essere:

• Di massa: la geometria della struttura rimane costante, si impallidisce man mano e perde PM ma la geometria è inalterata.
• Di superficie: qui invece la struttura perda di dimensione oltre che di colore, cioè man mano la superficie si degrada e perdo anche il PM ma cambia anche la struttura. Le cellule non fanno in tempo a creare la nuova struttura man mano che si degrada e quindi cambia la conformazione si usa in alcune applicazioni come il rilascio di farmaci.

I polimeri sintetici rispetto a quelli naturali sono modificabili, posso cambiare anche per esempio il PM (versatilità). Quelli sintetici sono riproducibili e processabili.

Polimeri sintetici vs polimeri naturali

• Polimeri sintetici: Versatilità, riproducibilità, processabilità.
• Polimeri naturali: Degradabilità, idrofilicità, biocompatibilità.

Polimeri di sintesi

Si possono realizzare materiali con sintetici e naturali perché i sintetici possono avere caratteristiche meccaniche migliori ma quelli naturali delle caratteristiche biologiche migliori raggiungo migliori risultati. Rispetto alle proteine dell’ECM naturale hanno maggiore flessibilità nei sistemi di lavorazione, minori rischi immunologici. Incorporazione di agenti bioattivi nei polimeri di sintesi scaffold funzionalizzati, materiali ibridi combinazione dei vantaggi dei polimeri sintetici e naturali.

Poli alfa idrosaccaridi

PCL usato da solo ma a volte il PLA in combinazione con altri materiali. I poliesteri alifatici vanno incontro a degradazione per rottura legame estere e si generano prodotti fisiologici. Se la reazione è più rapida si ha un aumento dei prodotti di degradazione e questo genera autocatalisi (l’ambiente acido accelera ancora di più la degradazione) e il tessuto acido in cui è messo il tessuto genera attività infiammatoria. Non ci sono gruppi funzionali disponibili sulle catene macromolecolari limite di adsorbire componenti bioattive sulla superficie, tempi di degradazione troppo lunghi per alcune applicazioni, possibili strategie:

• Realizzare copolimeri.
• A-idrossiacidi + altri monomeri contenenti gruppi funzionali (es. gruppi amminici e carbossilici).

PLA è sia amorfo che semicristallino. La parte amorfa mi dà una degradazione più veloce e quella semicristallina mi tiene le caratteristiche del materiale più a lungo. Vedo caratteristiche da slides. La temperatura di transizione vetrosa è alta è quindi rigido. PCL è il più usato nella medicina rigenerativa.