Biotecnologie genetico-molecolari modulo di fermentazioni industriali (con domande d'esame)

Fermentazioni industriali

Modulo: Industriali

Prof.ssa: Rollini Silvia Raccis

A.A.: 2022/2023

Processi biotecnologici

I processi biotecnologici sono importanti a livello industriale, perché danno la garanzia di:

• Riproducibilità: se messi nelle stesse condizioni, è possibile ottenere lo stesso risultato;
• Qualità adeguata a soddisfare i requisiti normativi di sicurezza per il consumo umano.

Alcuni degli stimoli più significativi all’espansione dello sfruttamento dei microrganismi:

• Grande disponibilità di ingredienti a basso costo, idonei come substrato per lo sviluppo microbico. Il settore agroalimentare produce residui (melassi, liscivi solfitici, residui da amido di mais e N-alcani), spesso costosi da smaltire, che possono essere usati come ingredienti per la crescita di microrganismi;
• Scarsità di processi per l’ottenimento di prodotti ad elevato valore aggiunto: l’acido citrico veniva inizialmente estratto da agrumi (Italia top producer), successivamente in Belgio viene messo a punto un processo produttivo con Aspergillus niger;
• Inserimento nel mercato di nuovi prodotti: produzione di antibiotici, enzimi, nutraceutici, proteine eterologhe (sintetizzante da microrganismi che non sono principali produttori).

Alimenti e prodotti alimentari ottenuti da microrganismi

Alcuni vantaggi dell’impiego di microrganismi in processi controllati:

• Produzione continua, indipendente da eventi esterni quali stagionalità ed eventi climatici avversi;
• L’interdisciplinarità necessaria all’ottimizzazione di processo spesso spinge lo scale-up.

A volte, nell’evoluzione di un processo biotecnologico, potrebbe essere utile tentare un approccio di miglioramento genetico della produttività, sul ceppo allo studio. Saranno quindi necessarie le figure del genetista e/o del biologo molecolare. L’obiettivo è quello di rendere più attraente dal punto di vista economico il processo! Le autorità di controllo raramente approvano l’impiego di organismi geneticamente modificati nel settore alimentare. I consumatori spesso hanno preclusioni importanti (a volte senza valide basi scientifiche) verso i prodotti ottenuti di OGM. Inoltre, l’innovazione biotecnologica non sempre garantisce il successo commerciale.

Le biotecnologie sono un rischio?

È necessaria un’efficace azione di alfabetizzazione scientifica sulle potenzialità e i rischi delle biotecnologie, in modo da creare un confronto aperto e democratico. Sviluppare normative che indirizzino verso una buona pratica di impiego delle biotecnologie, mirata al progresso scientifico e al benessere della umanità tutta, in grado di:

• Tutelare i diritti individuali;
• Evitare qualsiasi discriminazione sociale;
• Rispettare l'ambiente e la biodiversità;
• Valorizzare le ricadute economiche in termini sia di prospettive di sviluppo imprenditoriale, sia di nuove opportunità lavorative;
• Coniugare i valori del mercato con quelli di un’etica della salute mondiale.

Le biotecnologie sono collegate al concetto di economia circolare: viene inteso come un processo che tende a usare i residui/scarti costruendo dei cicli di produzioni alternativi, sempre nello stesso settore. Lo scarto è substrato di produzione di nuovi materiali che poi possono tornare al consumatore.

La competizione tra processi

La produzione biotecnologica è sempre in competizione con la produzione per sintesi chimica. Una molecola (come l’etanolo) può essere prodotta per sintesi microbiologica e per sintesi chimica. Nessuna delle due può essere definita migliore rispetto all’altra: generalmente quando le molecole sono piccole strutturalmente è più facile la sintesi chimica (propilene, etilene), all'esatto opposto per molecole complesse come proteine o antibiotici, la via migliore sono i microrganismi. Si sfrutta il fatto che il microrganismo sia in grado di sintetizzare questi composti.

Requisiti per l’ottenimento di un bioprodotto

• Al fine di ottenere l'attività metabolica ottimale è necessario un controllo rigoroso della composizione del terreno colturale, della temperatura e del pH;
• Mantenimento della sterilità: un altro microrganismo non può consumare i nutrienti utili al microrganismo di nostro interesse;
• Controllo dell'idrodinamica del bioreattore: mantenimento omogeneità della brodocoltura per un adeguato rifornimento di aria e di nutriliti.

Le fasi

• Recupero del prodotto (spesso diluito) dal terreno colturale (spesso complesso);
• Purificazione del prodotto in funzione del grado di purezza desiderato;
• Prodotto isolato in forma stabile;
• Recupero dei costi e processo economico;
• Minimo rischio per il personale e per l’impianto.

Metaboliti

Metaboliti primari e secondari e rapporti con lo sviluppo microbico

Le cellule utilizzano il substrato, il microrganismo cresce, la biomassa aumenta di numero e di peso. Contemporaneamente produce, mentre cresce, composti classificati come metaboliti primari, ad esempio l’acido lattico dei batteri lattici. Un microrganismo mentre cresce produce un metabolita primario, ma a un certo punto dello sviluppo si attivano nuove vie metaboliche producendo anche un metabolita secondario. È il caso della produzione di antibiotici. Il microrganismo consuma substrato per fare cellule e metaboliti primari. A un certo punto il metabolismo primario viene modificato strutturalmente per diventare un altro prodotto, ovvero un metabolita secondario (ad esempio le statine).

Capacità biochimiche dei microrganismi

Le capacità biochimiche dei microrganismi sono vastissime, ciò consente di ottenere un’ampia gamma di nuove molecole in processi microbiologici. I microrganismi lavorano a temperature mesofile o termofile, ma non estreme. Si distinguono inoltre microrganismi aerobi o anaerobi, sfruttati per accumulare diversi componenti. Gli anaerobi, come i batteri lattici, sono i più facili da coltivare su larga scala perché escono senza richiedere aria.

• I prodotti finali del metabolismo anaerobico vengono spontaneamente accumulati (acidi lattico, butirrico, propionico).
• Per quanto riguarda invece il metabolismo aerobico, intervenendo con opportune strategie si possono ottenere accumuli di intermedi metabolici, provenienti ad esempio dalla glicolisi, dal ciclo di Krebs e dalla catena di trasporto degli elettroni.

• Costituenti cellulari sintetizzati in eccesso rispetto alle esigenze fisiologiche, accumulati all'interno o all'esterno della cellula (acidi organici, aminoacidi, nucleotidi e loro derivati, lipidi, vitamine);
• Metaboliti accumulati all'esterno della cellula: non è sempre possibile attribuire un significato metabolico e una funzione (antibiotici, alcaloidi, polisaccaridi).

Il metabolismo microbico è costituito da due fasi:

• Catabolica: degradazione, sfrutta il substrato per ottenere ATP;
• Anabolica: biosintesi di nuovi componenti cellulari.

Le reazioni sono regolate da meccanismi di controllo che hanno lo scopo principale di indirizzare l'intero metabolismo verso lo sviluppo cellulare. Il microrganismo infatti non produce di più rispetto alle necessità metaboliche, a meno che non si cambino le condizioni di processo (temperatura o carenza/eccesso di substrato).

Metabolismo anaerobico: processi catabolici e anabolici

Nel metabolismo anaerobio si ha generazione di bassi livelli di energia (ATP). Il substrato viene in larga misura utilizzato nella fase catabolica per la formazione di limitati livelli di energia utilizzati nella fase anabolica.

I batteri lattici hanno un metabolismo microbico molto semplice: mediante glicolisi ottengono piruvato a partire dal glucosio, con accumulo di potere riducente. Per ossidarlo, i batteri lattici scaricano gli idrogeni sull’acido piruvico ottenendo acido lattico. Per ogni glucosio trasformato, un batterio lattico ottiene solo 2 ATP, di conseguenza non ha molta energia per la fase anaerobica. Per questo motivo gli anaerobi non crescono tanto, ma accumulano il prodotto finale del metabolismo.

Metabolismo aerobico: processi catabolici e anabolici

Una quota limitata di substrato è utilizzata per il catabolismo, con conseguente possibilità di sostenere la fase anabolica a livelli elevati. L’energia generata (ATP) è significativamente superiore rispetto a quella ottenibile dal metabolismo anaerobico (produce fino a 38 molecole di ATP, contro le 2 dell’anaerobio). L'energia prodotta è molta a parità del consumo di substrato, ciò significa che un microrganismo anaerobio riesce a produrre più cellule perché ha a disposizione più energia.

Il NADH (potere riducente) è riossidato per trasferimento degli elettroni all’ossigeno che funge da accettore terminale.

Ruolo dell’acido citrico nell’anabolismo

Il ciclo TCA è fondamentalmente un processo catabolico produttore di energia. Tuttavia, alcuni intermedi possono essere dirottati per assolvere funzioni anaboliche. Pertanto, il ciclo TCA è un ciclo anfibolico, ossia capace di produrre energia ma anche di formare intermedi che possono essere utilizzati per la sintesi di glucidi, lipidi, proteine e altri composti azotati. Il citrato è uno dei primi composti che si formano.

Considerazioni sugli aspetti metabolici

I prodotti del metabolismo anaerobico sono principalmente costituiti da metaboliti generalmente finali spontaneamente accumulati (anche in livelli significativi) e cellule in misura limitata. I prodotti finali del metabolismo aerobico sono principalmente costituiti da cellule, anidride carbonica e acqua senza che si abbiano significativi accumuli di intermedi metabolici (per ottimizzare il suo metabolismo). Con opportune procedure è possibile ottenere ceppi in grado di fornire elevati livelli di metaboliti non spontaneamente accumulabili.

La conoscenza dei meccanismi enzimatici è fondamentale per poter alterare il metabolismo microbico e regolare i processi fermentativi. L’impiego di un terreno sbilanciato può produrre effetti che possono portare all’accumulo di metaboliti. È quindi importante capire quale tipo di via metabolica usa il microrganismo. Una volta capito, si può provare a lavorare sugli enzimi impiegati (numero o velocità) nella via metabolica o sulle condizioni colturali, per cercare di spingere il microrganismo ad accumulare intermedi metabolici. Non è necessario modificare il suo DNA, ma si può fare sbilanciando le condizioni del substrato, facendolo vivere in condizioni poco ottimali.

Sintesi degli enzimi

Si distinguono due tipologie:

• Enzimi costitutivi: sono sempre formati, quindi in questo caso si può modificare solo la loro performance;
• Enzimi inducibili: sono sintetizzati solo in presenza di un induttore (elemento presente nel terreno colturale). Su questi enzimi si può indurre la sintesi stressando il microrganismo, o regolarne l'attività.

La concentrazione di metaboliti è funzione dei sistemi di controllo dell’attività enzimatica:

• Inibizione: si agisce sull’attività enzimatica;
• Repressione: si agisce sulla sintesi dell’enzima.

Il caso più semplice si trova nella via metabolica lineare. Solitamente, nei microrganismi si ha un meccanismo di regolazione per inibizione da accumulo di prodotto finale. Quindi in questo caso P inibisce E1. Per ottenere accumulo di P si dovrebbe togliere l'inibizione del primo enzima, in modo da stimolare il microrganismo a continuare la produzione di P. P può anche reprimere la sintesi di uno o più enzimi di questa via metabolica. I meccanismi di inibizione e repressione agiscono in sinergia nel controllo delle vie metaboliche.

Il caso più complicato è quello di una via metabolica ramificata perché prevede meccanismi di controllo complessi, è possibile che le due vie siano regolate in modo diverso in base alla necessità. Infatti, i metaboliti prodotti in una via ramificata non sono generalmente necessari in livelli analoghi e quindi sono sintetizzati in diversa concentrazione. P1 + P2 agiscono su E1 con un’azione di inibizione o di repressione (o di entrambe). Inoltre c’è un’inibizione sul primo enzima della catena (E1) esplicata da elevati livelli di uno solo dei prodotti (P1 o P2). Inibizione dei singoli prodotti (P1 e P2) sul primo enzima della rispettiva via metabolica dopo la ramificazione (E2 e E3). Si tratta quindi di un meccanismo che permette l’accumulo di uno dei due prodotti in funzione delle esigenze della cellula.

Meccanismi per evitare il fenomeno di inibizione

Modificazione della permeabilità cellulare

Per evitare il fenomeno dell’inibizione, è possibile effettuare una modificazione della permeabilità cellulare favorendo la fuoriuscita di un metabolita sintetizzato e accumulato all’interno della cellula, in modo che la cellula non percepisca l’accumulo. Un esempio è quello dell’acido glutammico.

Blocco metabolico

Il microrganismo diventa incapace di sintetizzare il prodotto finale, i cui livelli controllano l’attività di un enzima con ruolo chiave sulla via metabolica. Nel caso in cui l’elemento di interesse sia D (un intermedio che normalmente viene trasformato e non accumulato), è necessario fare in modo che la trasformazione in E non avvenga. Bisogna quindi bloccare l'attività enzimatica dell’enzima responsabile. Tutte le prime reazioni procederanno perché P non si accumula e non si avrà l'inibizione del primo enzima. Per rimuovere i fenomeni di inibizione/repressione, si deve rendere il microrganismo insensibile alla presenza di livelli di prodotto che causano inibizione o repressione.

Accumulo metabolita non associato allo sviluppo

Il processo di sviluppo è suddiviso in due fasi:

• Trofofase: fase di sviluppo (fino all’esaurimento della fase logaritmica);
• Idiofase: fase di biosintesi (che inizia nella fase stazionaria).

Nei metaboliti primari, trofofase e idiofase coincidono. Perché ci sia accumulo devono esserci due condizioni:

• Impiego di un idoneo terreno colturale;
• Il microrganismo deve avere caratteristiche genetiche adatte.

Accumulo prodotti del metabolismo secondario

• Sintesi nella idiofase, di prodotti finali non essenziali per lo sviluppo del microrganismo, a partire da metaboliti primari (le vie metaboliche che producono i metaboliti secondari sono completamente diverse);
• Fase biosintetica attraverso vie metaboliche non utilizzate dalla cellula nella fase di sviluppo;
• Gli enzimi responsabili della biosintesi dei metaboliti secondari sono repressi durante la trofofase: si tratta quindi di enzimi inducibili, che lavorano solo in risposta a uno stimolo. Spesso si ha il problema di inibizione da prodotto;
• L’isolamento di ceppi meno sensibili all’inibizione da prodotto consente di ottenere ceppi in grado di fornire più alte rese di prodotto.

Metaboliti primari e secondari

Lo studio dei meccanismi legati all’accumulo di metaboliti primari è facilitato da molecole con comprensibile significato per la cellula microbica. Per quanto riguarda i metaboliti secondari, occorre un’indagine complessa a causa della complessità delle molecole. Per comprenderne la sintesi si usa la biogenesi.

Processi biotecnologici

L'EFB (European Federation of Biotechnology) ha definito la biotecnologia come uso integrato di biochimica, microbiologia e ingegneria allo scopo di perseguire l'applicazione tecnologica-industriale della capacità dei microrganismi, delle colture di cellule di tessuti o di loro parti o più semplicemente l'uso controllato di materiale biologico.

Messa a punto di un bioprocesso

Elementi essenziali

Un bioprocesso si suddivide in due fasi:

• Upstream: prevede lo sviluppo, il mantenimento e il controllo delle colture, per ottenere un prodotto definito e gestire una biotrasformazione;
• Downstream: comprende le operazioni effettuate a fine processo, tra cui il recupero, l’isolamento e la purificazione del prodotto.

Requisiti di processo

Nel caso dell’upstream, i requisiti di processo sono i seguenti:

• Controllo rigoroso composizione del terreno colturale (fonte di C, N e sali minerali adeguati), pH (capacità del terreno di tamponare) e temperatura (in base alle caratteristiche del microrganismo);
• Controllo idrodinamica del reattore: il microrganismo quando cresce modifica la viscosità del liquido, modificando a sua volta anche il liquido all'interno del reattore. Se è aerobio può modificare la solubilità dell'ossigeno;
• Mantenimento sterilità: le guarnizioni del fermentatore devono essere ben tenute, ed evitare l'entrata di altri microrganismi;
• Costi: quello del terreno colturale può incidere fino al 40% del costo totale. Quindi è necessario scegliere i substrati più idonei può ridurre molto i costi e di conseguenza aumentare i ricavi.

Per il downstream:

• Recupero del prodotto (spesso diluito) dal terreno colturale (spesso complesso);
• Sicurezza: non devono esserci rischi per gli operatori e per l’ambiente circostante all'azienda (rilascio di fumi tossici). È importante gestire i flussi in ingresso e in uscita.

A fine processo: downstream

Brodocoltura: sospensione di cellule o micelio in una fase liquida (terreno colturale residuo). A fine downstream, un microrganismo unicellulare si presenta come sospensione uniformemente torbida. I microrganismi miceliari invece, si presentano come pellet o micelio lasso. In questo caso il microrganismo tende ad aderire al fermentatore.

Recupero prodotto

Per recuperare il prodotto bisogna separare le cellule. Il primo passo è separare la biomassa dalla parte liquida.