Biotecnologie genetico-molecolari - modulo

Biotecnologie

Modulo: genetico-molecolari

Prof.ssa Fortina Silvia Raccis

A.A. 2022/2023

Premessa

Metodologie genetico-molecolari

Conoscere e saper applicare le metodologie genetico-molecolari nell’ambito alimentare e microbiologico è importante perché sono in uso nei moderni laboratori di controllo qualità, ricerca, sviluppo e innovazione. Sono indispensabili per una risposta rapida e sicura: gli alimenti veicolano microrganismi indesiderati o patogeni. Il laboratorio di controllo qualità deve disporre di metodi rapidi per dare una risposta coerente con i tempi di produzione e distribuzione.

Lo sviluppo di nuovi processi di produzione in cui sono coinvolte specifiche colture starter deriva dallo studio di nuove colture e delle loro potenzialità, questo consente l’innovazione di processo e di prodotto.

Cellula procariota come modello di studio e applicazione

La cellula procariota è semplice, è dotata di cromosoma batterico costituito da un’unica molecola di DNA a doppio filamento, circolare, con più di un milione di basi nucleotidiche in sequenza. Distesa in tutta la sua lunghezza la molecola raggiunge la dimensione di 1 mm, infatti se non fosse superavvolta non ci starebbe. Per questo motivo (una sola molecola di DNA) è aploide.

Inoltre possiede del DNA extracromosomale, che prende il nome di DNA plasmidico, o semplicemente plasmidi. Ha una dimensione minore rispetto al DNA cromosomale. I plasmidi possono replicarsi autonomamente (non in concomitanza del DNA cromosomale) e permanere nella cellula batterica per numerose generazioni. Per farlo però, necessita enzimi e proteine che vengono sintetizzati dalla cellula ospite. Le informazioni che veicolano non sono essenziali per la sopravvivenza della cellula, sono bensì addizionali e possono servire all’adattamento in un ambiente che ha subito variazioni rispetto al precedente.

Alcuni plasmidi possono integrarsi nel cromosoma, in tal caso prendono il nome di episomi e, in queste condizioni, non si replicano più in modo autonomo, ma in sincronia con il cromosoma stesso. Grazie a questo processo permette una variabilità genetica che può essere tramandata alle cellule figlie. Un episoma può separarsi dal cromosoma e tornare a replicarsi autonomamente sotto forma di plasmide. Questo accade quando l’episoma è presente nella cellula per molto tempo ma non è utile, e viene eliminato per risparmiare energia.

I plasmidi codificano per fattori di virulenza batterica:

• Produzione di pili, tossine, adesine, batteriocine
• Fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza
• Plasmidi: F (sessuali o coniugativi), Plasmidi “criptici”: funzionalità non nota

Una cellula può acquisire o può perdere un plasmide, in presenza o assenza di una pressione selettiva. Il processo di diffusione della resistenza è causato dalla diffusione del plasmide da una cellula all’altra. Per questo motivo i plasmidi vengono definiti come elementi genetici mobili.

Teoria dell’endosimbiosi

Dalle evidenze scientifiche è noto che mitocondri e cloroplasti contengono DNA e ribosomi correlabili a quelli dei batteri. È stato stabilito che i regni oggi esistenti provengono da una cellula ancestrale procariota. Facendo fatica a sopravvivere, una cellula procariota è entrata dentro l’altra assumendo la funzione di mitocondrio, dando vita a una cellula eucariota. Infatti, attualmente, il mitocondrio possiede un DNA e ribosomi che hanno le stesse caratteristiche dei batteri.

L’ambiente seleziona gli organismi che si adattano meglio, questo porta ad avere tanti microrganismi diversi per la presenza dei tanti habitat esistenti. L’evoluzione viene studiata grazie all’individuazione di orologi molecolari, come il ribosoma 16S presente in tutte le cellule esistenti. Il numero di variazioni che ha subito nei miliardi di anni, può fornire una misura della distanza evolutiva tra due cellule. Un ribosoma è formato da due subunità, ciascuna definita da un coefficiente di sedimentazione (unità Svedberg). Si attiva quando le due subunità si uniscono e scorre mRNA.

La cellula scambia materia ed energia con l’ambiente, si riproduce e si evolve, quindi è soggetta a processi di ricombinazione genetica (unidirezionali, parziali e occasionali).

La cellula svolge diverse funzioni vitali, ha i seguenti scopi:

• Adattarsi e sopravvivere in un dato habitat: questo comporta esprimere quelle specifiche caratteristiche fenotipiche che consentono alla cellula di utilizzare un substrato o adattarsi ad un cambiamento ambientale
• Vivere e riprodursi colonizzando un determinato habitat: riprodursi affinché la propria progenie sia in grado di colonizzare un dato habitat, comportando la costituzione di nuove cellule figlie dotate dello stesso patrimonio genetico della madre. La cellula procariota non è in grado di riprodursi sessualmente, infatti si riproduce attraverso il processo di divisione/scissione binaria, sono in grado di mantenere la loro progenie nel tempo ma devono trovare le condizioni favorevoli alla riproduzione: hanno bisogno di tanta energia perché da una cellula se ne formano due uguali. Non sempre però le cellule che derivano da una cellula madre sono uguali, perché possono avvenire dei processi che modificano il corredo genetico della cellula figlia; queste modificazioni sono date ricombinazione genica o modificazione
• Evolversi: laddove le condizioni ambientali sono tali da ridurre drasticamente le possibilità di sopravvivenza, possono succedere dei fenomeni di ricombinazione genetica allo scopo di acquisire qualche caratteristica fenotipica utile (ricordiamo che i batteri non sono in grado di compiere una riproduzione sessuale), cambiare per una cellula figlia significa quindi modificare o acquisire nuove informazioni

Processi di ricombinazione genica

Sono i principali meccanismi con cui la cellula cerca di evolversi. La ricombinazione genica è una evoluzione batterica. Sono processi che vengono compiuti in natura dalla cellula ad una frequenza molto bassa, solo quando la cellula si trova in difficoltà con la propria sopravvivenza, questo perché l’esito di questi processi di variabilità non sono noti a priori. L’esito di questi processi di ricombinazione non è noto alla cellula, che rischia di mettere in atto questi meccanismi sperando che questi possano migliorare la sua vita e non peggiorarla. Sostituiscono quella che è la tipica riproduzione sessuale che avviene tra le cellule eucariote, con lo scopo di aumentare la variabilità.

I processi di ricombinazione genica sono:

• Unidirezionali: i batteri hanno bisogno di modificare il proprio DNA cambiando una piccola porzione del DNA cromosomale che deriva da una cellula donatrice e che viene acquisito da una cellula ricevente
• Parziali: la cellula non può acquisire porzioni troppo grandi perché la cellula è molto semplice e non è in grado di acquisire il patrimonio genetico completo di un’altra cellula
• Occasionali: avvengono solo quando la cellula deve cambiare per resistere ad un dato ambiente. Questi processi in natura avvengono con una frequenza molto bassa in quanto la cellula non sa se il processo porterà a risultati positivi o negativi
• Trasformazione: acquisizione di DNA esterno (libero) che avviene senza contatto diretto tra le due cellule
• Coniugazione: trasferimento di DNA attraverso un contatto tra due cellule
• Trasduzione: trasferimento di DNA mediata da un batteriofago detto anche fago che è in grado di infettare solo alcune cellule batteriche

Trasformazione

La trasformazione è il processo più semplice, che prevede un contatto casuale tra una cellula e del DNA esterno che deriva da una cellula che si è lisata (morta) e ha fatto uscire il suo codice genetico. È un processo guidato: la cellula deve entrare in uno stato di competenza (codificato da geni cromosomici deputati all’acquisizione di questo DNA vagante per farlo entrare nella cellula, indotto da condizioni ambientali) che però la cellula non attiva sempre a causa della teoria dell’economia cellulare per cui la cellula non fa nulla se non necessario.

La cellula può dirigere l’inizio del processo ma non è a conoscenza dell’esito: potrebbe essere una modifica favorevole o sfavorevole. La prima cosa che deve fare la cellula quando percepisce dai recettori superficiali che c’è un DNA esterno è attivare proteine e enzimi:

• Proteine di trasporto specifiche per far superare la barriera citoplasmatica
• Nucleasi: la cellula preferisce acquisire un DNA a singolo filamento e non doppio, perciò degrada parte del DNA esterno trasformandolo da doppio a singolo filamento
• Proteine stabilizzanti specifiche che si legano al frammento per evitare che il DNA acquisito si ripieghi su sé stesso e lo portano nella zona del DNA superavvolto
• Proteine recA: funzione di lettura, ovvero cerca e verifica che ci siano sequenze omologhe di DNA esogeno e DNA cromosomale per integrarsi

Se la proteina trova il sito di inserimento, usa enzimi specifici che tagliano il DNA cromosomale e permettono l’inserimento del DNA esogeno. La cellula ricevente incorpora il DNA del donatore. La ricombinazione avviene tra il DNA del donatore e il DNA del ricevente e si crea una cellula geneticamente trasformata. Solo il DNA omologo sarà integrato nel cromosoma sostituendo uno dei due filamenti del DNA del ricevente; il DNA che non verrà integrato sarà degradato. Quando il singolo DNA è riuscito ad entrare, si lega a delle proteine per evitare che si riavvolga, tenendo il filamento il più lineare possibile per facilitare l’integrazione nel DNA cromosomale.

La proteina RecA che legge il DNA esterno e quello cromosomale, cerca un sito di integrazione per il DNA esogeno, ovvero una regione costituita da basi nucleotidiche che sono uguali al filamento esterno, in modo che ci siano zone omogenee in cui il filamento esterno possa essere integrato. Possono verificarsi due situazioni, una tra queste è un esito positivo in cui il DNA si riesce ad integrare e quella frazione di DNA contiene delle informazioni tali da migliorare le cellule che sono rimaste intatte e possono essere espresse, la cellula avrà acquisito delle caratteristiche in più che permetterà la sopravvivenza. Nel caso di un esito negativo:

• Se non vengono individuate zone omogenee il DNA esterno non può integrarsi e quindi la cellula non si trasforma, specifici enzimi degradano il filamento e usa le basi nucleotidiche per una sintesi di una molecola nuova
• Il DNA esogeno non porta nessuna informazione utile per la sopravvivenza, oppure perché il DNA esogeno si è inserito all’interno di un gene che si è inattivato
• Quando il filamento viene cambiato per favorire l’inserimento, il taglio può avvenire a livello di una informazione vitale per la cellula: esito negativo per la cellula
• Limite maggiore: il DNA esterno deve trovare una regione omologa per inserirsi all’interno, di conseguenza non funzionerà

Anche i plasmidi possono ritrovarsi liberi nell’ambiente circostante la cellula competente e venire inglobati in essa. Può avvenire anche attraverso i plasmidi e possono essere integrati all’interno di una cellula ospite, è un fenomeno raro in natura ma sfruttato in laboratorio nelle tecniche di ingegneria genetica nel trasferimento di informazioni utili. Il vantaggio dell’uso di plasmidi in un processo di trasformazione guidata è quello di non aver bisogno di siti di integrazione (non necessita di regioni omologhe per integrarsi nel DNA cromosomale della cellula ospite), ma può rimanere come entità autoreplicante libera nel citoplasma (non si utilizzano dei plasmidi episomi perché avrebbero bisogno di siti di inserimento).

Coniugazione

Alcune cellule sono dotate di un’estroflessione che consente alla cellula che la possiede di contattare una cellula simile e formare un ponte coniugativo che permette un passaggio dalla cellula F (donatrice, dotata di plasmide chiamato fattore della fertilità) ad una cellula F (ricevente). Nel caso dei Gram negativi la coniugazione avviene tramite il pilo sessuale, possiedono il Plasmide F (plasmide coniugativo o sessuale) che porta le informazioni per produrre il pilo F o pilo coniugativo. Il pilo si attacca all’altra cellula formando un ponte coniugativo che permette a due cellule di entrare in contatto. Nei Gram positivi questo processo non avviene.

La coniugazione può avvenire secondo due processi, il più semplice e poco efficiente, non porta la cellula F ad avere nuove informazioni. La cellula che contiene al suo interno il pilo F prende contatto con una cellula F e si forma il ponte coniugativo (pilo cavo all’interno). Attraverso il ponte passa uno dei due filamenti di cui è costituito il DNA plasmidico, attraverso un particolare meccanismo chiamato rolling-circle (srotolamento). Quando si forma il ponte coniugativo, il plasmide F si rompe in un punto di uno dei due filamenti e attraverso un meccanismo di rotazione circolare, uno dei due filamenti si srotola dal plasmide e passa attraverso il ponte coniugativo per raggiungere la cellula F . Quando tutto il filamento del plasmide è entrato nella cellula F si attivano in entrambe le cellule (donatrice e ricevente) dei meccanismi di replicazione del filamento complementare (enzimi). Proteine ed enzimi specifici vanno nelle due cellule F e F a ricostruire il filamento complementare e formare un nuovo plasmide F completo. Quindi la cellula F ha donato la capacità alla cellula F di diventare F acquisendo la capacità di produrre un filamento F e un ponte coniugativo. Il pilo F riporta pochissime informazioni (praticamente solo la capacità di produrre questo pilo F).

La coniugazione diventa efficiente come meccanismo di ricombinazione quando il plasmide F è presente nella cellula donatrice sotto forma di episoma. Il plasmide F non è presente libero nella cellula F bensì come episoma, ovvero inserito in un sito specifico del cromosoma batterico.

Il plasmide F ha poche caratteristiche informazionali, ma possiede 2 siti chiave:

• Punto OriT: l’origine di replicazione, viene tagliato per permettere al singolo filamento di passare alla cellula ricevente
• Sito di inserimento: viene riconosciuto a livello del DNA cromosomale per poter essere integrato

Questi due siti possono essere presenti in punti diversi del plasmide e questo può cambiare l’esito della coniugazione. Dipende da dove si trova il punto di rottura (oriT cioè l’inizio del srotolamento) e il sito di inserimento. Quando il plasmide si è inserito e ha l’origine dello srotolamento in un punto diverso rispetto a quello di inserimento, si integra nel DNA cromosomale in questo modo: quando la cellula F viene a contatto con una cellula F e si forma il ponte coniugativo che induce il plasmide a srotolarsi, ma essendo legato al DNA cromosomale, questo srotolamento porta a far passare attraverso il ponte coniugativo tutto il plasmide assieme al filamento del DNA cromosomale a cui il plasmide F era legato come episoma. Questo vuol dire che se le cellule stessero in contatto per molto tempo potrebbe passare nella cellula F tutto il plasmide, o parte di esso, e tutto un filamento del DNA cromosomale. Questo però non avviene perché le cellule nel corso dell’evoluzione hanno imparato ad avere un tempo di contatto molto breve, perché la cellula non è in grado di ricevere tutto il DNA di un’altra. Il tempo di contatto breve fa sì che nella cellula ricevente passi il plasmide, o una frazione di esso, e una frazione soltanto del DNA cromosomale della cellula donatrice. Questo implica che la cellula ricevente non ha acquisito solo il plasmide F, ma ha anche delle informazioni che provengono dal DNA cromosomale di passare più informazioni) che può portare a variabilità genetica.

La formazione di cellule Hfr è un processo che consente di ottenere un maggior grado di variabilità nella cellula ricevente. Il ponte coniugativo induce il plasmide F a srotolarsi, il tempo di contatto è limitato. Il segmento IS3 consente l’inserzione (sequenza di inserzione che codifica per un enzima specifico, fa in modo che questa sequenza possa duplicarsi e saltare da una parte all’altra del cromosoma). Queste cellule prendono il nome di Hfr (alta frequenza di ricombinazione), l’esito della coniugazione sarà diverso:

• Hfr F: tutto il filamento del plasmide F è entrato, perché i due siti (quello di integrazione del DNA e quello di origine di srotolamento) erano nello stesso posto, di conseguenza l’intero plasmide ha cominciato a srotolarsi dall’inizio alla fine. Viene quindi acquisito sia tutto il DNA plasmidico, sia una parte del DNA cromosomale
• Hfr F: se tutto il filamento del plasmide F non è entrato, significa che lo srotolamento ha iniziato quando il plasmide era inserito in modo tale che il sito di srotolamento coincideva con metà della molecola circolare. In questo caso la cellula ricevente acquisterà una porzione del plasmide F e una porzione del cromosoma: è una cellula Hfr, ma F perché il contatto tra le cellule è un processo breve e non può passare tutto il DNA della cellula donatrice (se lo può usare si avrà variabilità, altrimenti ciò che è stato acquisito verrà degradato, tuttavia non sarà F quindi non sarà in grado di fare il pilo F e quindi non potrà fare a sua volta processi di ricombinazione).