Domande biotecnologie genetico molecolari

Domande genetica

Cellula microbica

La cellula microbica è una cellula aploide semplice dove le funzioni sono svolte con la membrana cellulare che regola l’entrata e l’uscita di componenti, la respirazione o la fotosintesi, le modificazioni di proteine o molecole. Il genoma è semplice, si ha un cromosoma con circa 1 milione di paia di basi con il DNA a doppio filamento con una doppia elica organizzato in forma circolare CCC, ovvero è in forma super-avvolta grazie a proteine di superficie nella zona nucleare. Nel DNA cromosomale sono contenute tutte le informazioni necessarie per la vita della cellula.

Nelle cellule microbiche inoltre possono essere presenti plasmidi, ovvero del DNA addizionale extra-cromosomale in forma CCC ma in dimensioni molto minori che si stacca casualmente dal DNA cromosomale e ha così vita propria, quindi è in grado di auto-replicarsi; i plasmidi sono elementi genetici mobili portatori di informazioni aggiuntive per la sopravvivenza in habitat particolari. Quando i plasmidi sono integrati nel DNA cromosomale sono detti episomi. Le informazioni portate dai plasmidi possono essere per fattori di virulenza, formazione di pilli per aderire all’ospite, codifica per adesine, batterocine e per l’antibiotico-resistenza. I plasmidi possono essere acquisiti o persi e quindi essere veicoli di trasmissione.

Guardando l’evoluzione, la cellula ancestrale primordiale era una cellula semplice fatta di RNA che poi si è evoluta in diversi ambienti secondo la teoria dell’endosimbiosi secondo cui due cellule procariote si sono unite a formare una cellula eucariote con mitocondri o cloroplasti con un DNA proprio che testimoniano l’inserimento di una cellula piccola che si è specializzata all’interno di quella più grande. In questo modo, è stato possibile costruire l’albero filogenetico con bacteria, archea ed eukarya grazie al confronto delle sequenze comuni in tutti i microrganismi, ovvero una macromolecola informazionale che dal progenitore ha subito poche variazioni, ossia l’RNA ribosomiale 16S che è presente nei ribosomi batterici. La lettera S sta per Stendberg che grazie all’ultracentrifugazione ha valutato la densità dei ribosomi scoprendo che sono formati da due subunità, dove in quella più piccole si ha l’RNA 16S che è un orologio molecolare. Il gene che codifica per questo RNA 16S è usato per molte tecniche genetico-molecolari per la sua variazione ridotta per poter comparare le diverse specie e fare una classificazione tassonomica.

Processi di ricombinazione genica

Quando la cellula si trova nelle condizioni idonee per lo sviluppo il suo scopo è la riproduzione per colonizzare l’ambiente; se ci sono difficoltà ambientali si possono verificare processi di ricombinazione per garantire l’evoluzione batterica ma la frequenza è bassa perché gli esiti possono essere negativi o positivi e sono uni-direzionali, ovvero avvengono da una cellula donatrice a una ricevente con un controllo limitato.

La trasformazione è l’acquisizione di DNA libero dall’esterno senza un contatto reale proveniente da una cellula lisata; questo può avvenire solo in batteri naturalmente trasformabili con geni per lo stato di competenza per consentire l’assorbimento del DNA libera se si presentano condizioni ambientali non favorevoli. Si tratta di una serie di geni che codificano per proteine ed enzimi che consentono la trasformazione: l’adsorbimento prevede il legame tra parete e DNA esterno, poi delle nucleasi rompono i legami H e creano un filamento singolo che può entrare nella cellula grazie a proteine di trasporto; intervengono poi proteine per impedire l’avvolgimento e poi la proteina REC-A riconosce le sequenze omologhe tra il DNA cromosomale e quello esogeno trovando un sito di integrazione per l’inserimento. Se non si ha omologia, il DNA esogeno viene degradato, mentre se viene integrato l’esito non è noto in quanto potrebbe portare a variabilità, a un esito negativo o nullo. Questo processo viene utilizzato in laboratorio per l’inserimento di un plasmide linearizzato per inserire un’informazione.

La coniugazione è un trasferimento di DNA con il contatto tra due cellule diverse; avviene più frequentemente nei batteri gram-negativi che possiedono un plasmide coniugativo, ovvero il plasmide F che codifica per il pilo F che consente il contatto tra donatrice e ricevente con un ponte coniugativo. La cellula con il plasmide è detta F+, mentre quella senza F-; il pilo è una struttura cava per il passaggio del filamento del plasmide con il rolling circle e il tempo di contatto consente il passaggio dell’intero filamento trasformando la cellula F- in F+. Questo processo non porta a variabilità genetica. Tuttavia, se il plasmide F ha un sito di riconoscimento sul DNA cromosomale diventa episoma, portando a una cellula HFR, ovvero ad alta frequenza di ricombinazione. Il contatto tra due cellule F+ e F- causa lo srotolamento del plasmide F dal punto oriT e il contatto avviene per un tempo breve portando al passaggio del plasmide e di una porzione discreta di DNA cromosomale della cellula donatrice. La cellula ricevente può diventare HFR+F+ se viene acquisita una frazione del DNA e l’intero plasmide ma più spesso diventa HFR+F- in quanto viene acquisita una piccola parte del DNA cromosomale e una frazione del plasmide, quindi si ottiene una cellula ad alta frequenza di ricombinazione ma F-. Questo dipende in base al plasmide coniugativo e alla posizione oriT, ovvero il sito di inserimento che causa uno srotolamento diverso e dalle condizioni esterne. Nel caso dei gram-positivi si può avere la produzione di fermoni che consentono il contatto e si forma così un ponte. La coniugazione è il principale meccanismo di trasferimento genico orizzontale per l’antibiotico resistenza.

La trasduzione è il trasferimento di DNA mediato da un fago che ha sbagliato il ciclo precedente, detto fago trasducente. Il fago è un virus con una struttura binaria complessa con una coda, una testa dove le fibre della coda consentono l’adesione a un ospite; il genoma è situato nella testa come DNA o RNA e sono parassiti intracellulari obbligati che sfruttano l’acido nucleico non posseduto. Sono caratterizzati da una specificità dell’ospite a cui aderiscono esternamente; nel capside è contenuto il lisozima che degradata la parete cellulare dell’ospite e inserisce così il genoma virale che ha due destini: con il ciclo litico si ha una riproduzione immediata delle particelle virali con lo sfruttamento dei meccanismi di replicazione della cellula, quindi avviene l’assemblaggio delle particelle virali nuovi che poi causano la lisi della cellula ospite. Se si verifica un errore, si ha un fago errante e si parla di trasduzione generalizzata: dopo l’introduzione del genoma virale, si ottengono particelle fagiche con il capside che contiene un frammento del DNA cromosomale degradato, avviene la lisi della cellula e poi l’infezione di un’altra cellula dove quindi viene iniettato il genoma virale insieme alla parte del DNA cromosomale e se si ha un sito di inserimento questo viene acquisito. Con il ciclo lisogenico si ha un fago temperato che instaura un ciclo non mortale che integra il genoma vitale a quello cromosomale, avvengono la replicazione e la trasmissione alle cellule figlie del genoma virale; quando si ha un evento esterno, avviene il distacco del DNA fagico che instaura il ciclo litico portando alla formazione di tante particelle. Se il fago compie un errore, si ha una trasduzione specializzata, ovvero avviene un errore nella escissione e il genoma virale integra piccole parti del DNA cromosomale che poi vanno a colpire altre cellule bersaglio; si verifica il ciclo lisogenico e la cellula bersaglio ha la possibilità di riconoscere il genoma virale, bloccarne l’espressione e la frazione del DNA cromosomale può essere integrato e dare variabilità.

Replicazione del DNA, trascrizione, traduzione

Il DNA è costituito da basi azotate che sono purine, ovvero adenina e guanina, e pirimidine, ovvero citochinina, tiamina e uracile, poi residui di desossiribosio e molecole di fosfato; si formano due filamenti antiparalleli di direzioni opposte, ovvero 5’3’ e 3’5’ dove si ha un 3’ OH libero, tenuti insieme da legami H tra le basi nucleotidiche complementari che sono due per AT e tre per CG. Si ottiene una rotazione a doppia elica.

L’RNA è un filamento singolo con l’uracile al posto della tiamina e il ribosio; ne esistono tre tipi: RNA messaggero serve per la trascrizione del DNA per portare il messaggio ai ribosomi; rRNA ribosomiale si trova nel ribosoma 70S nelle due subunità, ovvero 30S con l’RNA 16S e 50S con 23S; l’RNA transfer consente il legame dell’amminoacido con uno specifico anticodone, ovvero una tripletta di basi, ed è caratterizzato da una forma a quadrifoglio che si forma per la complementarietà delle basi. Il codice genetico viene letto come triplette o codoni e ogni tripletta corrisponde a uno specifico aa ma più triplette possono codificare per un singolo aa, quindi si parla di degenerazione del codice per evitare le mutazioni; in particolare, si ha la vacillazione della terza tripletta: le prime due basi sono specifiche per l’amminoacido, mentre la terza può variare ottenendo 64 triplette per 20 aa, dove 61 sono codoni di senso, 3 di arresto TAA, TAG, TGA e di inizio dove la più comune è ATG che codifica per una n-formil-metionina nelle cellule batteriche. Un gene è una sequenza continua nucleotidica con un inizio e uno stop che porta a un fenotipo; nel caso invece di ORF, open reading form, sono regioni codificanti ma con fenotipo sconosciuto.

La replicazione necessita di diversi enzimi: per il disavvolgimento è necessario avere un punto specifico detto oriT, ovvero l’inizio della replicazione; si hanno poi elicasi che formano la forcella e poi proteine di stabilizzazione per tenere i due filamenti separati. La DNA polimerasi copia il filamento ma necessita di un doppio filamento, quindi si devono avere primer/inneschi, e la sua azione si ha solo in direzione 5’3’ con il 3’OH libero: il filamento 5’3’ viene copiato in continuo, mentre 3’5’ viene detto ritardato dove si formano frammenti di Okazaki che poi vengono rimossi dalla DNA ligasi. Si tratta di un processo semi-conservativo in quanto le cellule figlie possiedono un filamento originale e uno ottenuto con la copiatura.

La trascrizione consente l’espressione genica per produrre un prodotto necessario alla cellula; l’enzima chiave è l’RNA polimerasi che crea un legame con il sito promotore a monte del gene per copiare il filamento e formare l’RNA messaggero. Poi si hanno i codoni di inizio e di sto e il sito termitatore che fanno terminare la trascrizione; il promotore è una parte non codificante in cui si hanno sequenze specifiche consenso dette box -10 TATAAT e box -35 TTGACA che rappresentano le condizioni ottimali per avere la massima efficienza per avere la massima efficienza del legame dell’RNA polimerasi nella subunità sigma e il sito promotore con la sequenza consensus e la distanza consensus. Tuttavia, ci sono anche promotori diversi a causa di mutazioni o la regolazione avviene attraverso proteine e quindi il processo è meno efficiente. Inoltre, tra il box -10 e l’inizio si ha una regione ricca in G e A detta RBS che è complementare alla regione del RNA ribosomale 16S per consentire il legame tra RNA messaggero e il ribosoma. I siti terminatori possono essere RO dipendenti dove si ha la presenza di una proteina RO che blocca la copiatura oppure RO indipendenti che hanno sequenze nucleotidiche ripetute e invertite che formano una forcina e portano all’arresto.

La traduzione avviene nei ribosomi dove si hanno due subunità che diventano attive quando l’RNA messaggero si lega alla regione RBS e avviene così la lettura dei codoni con il tRNA complementare all’anticodone del messaggero. Avviene il riconoscimento del sito peptidico e l’amminoacido e poi lo scorrimento portando alla formazione della proteina completa dove il primo amminoacido è una n-formil-metionina.

Operoni

Un operone è un insieme di geni raggruppati che vengono trascritti e regolati insieme per ottenere i prodotti che servono contemporaneamente; in questo modo, si risparmia energia in quanto si ha un unico promotore e terminatore. L’operone ribosomiale è usato come target per molti esperimenti e contiene i geni per la sintesi del rRNA 16S, 23S e 5S che sono necessari insieme; il gene 15S rRNA è presente nella subunità 30S e ha una lunghezza che è la metà del 23S. Il gene 16S e 23S sono separati da una regione intergenica/spaziatrice non codificante ma conservata.

L’operone lac in E. coli contiene tre geni necessari per l’utilizzo del lattosio: lacZ codifica per la beta-galattosidasi, lacY per una permeasi che trasporta il lattosio, lacA per una tranacetilasi e questi sono necessari contemporaneamente. Il processo di regolazione è regolato da proteine specifiche che formano legami H tra le basi del DNA e i gruppi R degli aa, ovvero un legame DNA-proteine in un punto specifico grazie al motivo HTH, ovvero helix-turn-helix. Ci sono diverse strategie di controllo della regolazione: costitutivo che dipende dalla natura del promotore che può essere forte con la distanza e le sequenze consensus o debole che è meno efficiente; oppure si possono avere proteine regolatrici che fanno un controllo di repressione come nell’operone lac: se il lattosio è assente non si ha bisogno dell’attivazione e per questo il promotore dell’operone lac non è forte: tra il sito promotore e il primo gene esiste un’altra regione non codificante ma che viene riconosciuta da una proteina regolatrice detta sito operatore; in questo caso, è un repressore perché quando il lattosio non è presente, la cellula sintetizza la proteina regolatrice che si lega a livello del sito operatore e impedisce alla RNA polimerasi di legarsi e procedere con la trascrizione. Quando il lattosio è presente si lega all’operatore perché ha maggiore affinità, quindi stacca la proteina e la RNA polimerasi può legarsi. Oppure si ha una repressione da catabolita o attivazione che si attua quando la cellula si trova in presenza di lattosio e glucosio: prima si usa il glucosio aumentando l’AMP ciclico che va ad attivare la proteina CAP attivatrice formando un legame con l’AMP ciclico e il complesso a livello del promotore lo rende più efficiente per la trascrizione perché il lattosio diventa l’unica fonte disponibile per la cellula.

Altri fenomeni di variabilità genetica

Un altro fenomeno che può portare a variabilità genetica sono gli errori nella replicazione in quanto questa avviene in poco tempo, circa 20-30 minuti ma la DNA polimerasi ha un’attività esonucleasica che consente di rimuovere i nucleotidi sbagliati. Tuttavia, ci possono essere comunque errori che causano un cambiamento della sequenza nucletodica e quindi variabilità.

Oppure, si possono avere mutazioni che sono un cambio casuale a causa di agenti mutageni che è stabile ed ereditabile alle cellule figlie; gli esiti possono essere letali, negativi o positivi. In particolare, si può avere una transizione, ovvero uno scambio tra purina e purina o piramidina e piramidina, oppure una transeversione, ovvero uno scambio purina e piramidina. Inoltre, si può parlare di mutazioni puntiformi quando avviene la delezione o inserzione di una base all’interno di una tripletta causando il cambiamento dello schema di lettura, quindi del frame-shift; in particolare, con un’inserzione si aggiunge una base nucleotidica e quindi si ha uno shift + 1 della lettura della tripletta, oppure con una delezione si toglie una base e quindi si ha uno shift -1. Questi eventi possono avere effetto diverso in base al punto in cui avviene la mutazione: se avviene sull’ultima base della tripletta avviene una mutazione silente; se avviene sull’ultima base di una tripletta di stop si ha una mutazione non senso in quanto si ha una proteina incompleta; se avviene sulla prima o seconda base si ottiene un amminoacido diverso e quindi una mutazione missenso e una proteina sbagliata.

Si hanno poi i trasposoni, ovvero segmenti di DNA mobili che possono essere semplici, ovvero con una sequenza di inserimento/inserzione con il gene che codifica per una trasposasi, e sequenze ripetute e invertite a monte e a valle; a causa di stimoli esterni, la trasposasi viene prodotta e stacca la sequenza e la sposta o la duplica e la sposta portando quindi a più copie di sequenza di inserzione lungo il genoma. Le IS hanno 100-500 bp e le sequenze IR 10-25 bp. Oppure si possono avere trasposoni complessi con due sequenze di inserzione uguali che delimitano una serie di geni che quindi possono essere spostati contemporaneamente quando vengono attivate le sequenze a monte e a valle. In questo caso, si può avere lo spostamento della resistenza a un antibiotico su un plasmide coniugativo che poi viene trasferito a un’altra cellula. L’effetto del salto è diverso in base a dove avviene l’inserimento: se è all’interno del gene, viene attivato; se avviene a livello del promotore debole questo può diventare forte perché le IR sono simili a quelle consensus, oppure si allontana il gene dal promotore che quindi diventa meno efficiente. Infine, si hanno gli enzimi di restrizione ER che sono endosesossribonucleasi o endonucleasi che riconoscono sequenze specifiche sul DNA e causano un taglio interno. Grazie a queste è possibile formare plasmidi modificati; inoltre, consentono di proteggere da eventi indesiderati come l’ingresso di un DNA virale che attiva il sistema di modificazione-restrizione portando alla degradazione. Ci sono diversi ER in base alle sequenze e al sito di taglio e sono diverse per ogni microrganismo.

Reazione di PCR