Appunti di bioinformatica del prof Di Muccio

Lez 1. 9/2 La bioinformatica

La bioinformatica, e più in generale la biologia computazionale riguarda l’uso di strumenti informatici per studiare dati biologici. La bioinformatica classica si concentra soprattutto sulle sequenze nucleotidiche: come vengono analizzate, conservate nei database e utilizzate dagli informatici per cercare informazioni biologiche.

L’idea di base è semplice: ogni gene o proteina può essere rappresentato come una stringa di lettere (nucleotidi o amminoacidi). Per capire le relazioni tra organismi o tra geni, si confrontano le stringhe cercando i migliori allineamenti, cioè le corrispondenze ottimali tra sequenze. Da questi confronti si possono costruire alberi filogenetici, che rappresentano le relazioni evolutive tra organismi. Per farlo:

• Si sequenziano genomi o geni di diversi organismi;
• Si confrontano le sequenze con algoritmi di allineamento;
• Si ottengono informazioni sulla loro somiglianza e divergenza;
• Si integra tutto in un modello filogenetico.

Un aspetto interessante è il folding delle proteine: a partire dalla sequenza di amminoacidi, si può provare a predire la struttura tridimensionale, un problema computazionale molto rilevante per comprendere funzione e interazioni. La bioinformatica non si limita ad analizzare sequenze, ma si occupa anche di decodificare le strutture secondarie a partire dalle sequenze stesse.

Nanofluidica e nanopori

La nanofluidica è il campo in cui le dimensioni diventano così piccole che il microscopio tradizionale non arriva più a osservare. Per studiare questi sistemi servono quindi tecniche computazionali, come simulazioni atomistiche e modellazioni su scala nanometrica (nanoscala) inferiore alla lunghezza d’onda di qualunque luce visibile. I nanopori sono canali microscopici che hanno trovato applicazione commerciale nei sequenziatori portatili di DNA, prodotti a partire dal 2015 da Oxford Nanopore.

1. Una proteina di membrana viene immobilizzata nel nanoporo, abbastanza larga da permettere il passaggio di un singolo filamento di DNA.
2. La corrente elettrica viene misurata attraverso il nanoporo mentre il DNA passa, generando un segnale che varia a seconda della base nucleotidica che transita nel poro.
3. Questi segnali vengono poi elaborati dal dispositivo per decodificare la sequenza del DNA.

Il dispositivo è estremamente compatto: basta collegarlo al computer tramite USB, aggiungere il campione di DNA e il sistema cattura i filamenti singoli nei nanopori, separandoli da altre componenti.

Lez 2. 10/2 Definizione generale della bioinformatica

La bioinformatica è la disciplina che studia l’informazione biologica attraverso strumenti computazionali. Si occupa di raccogliere, organizzare e analizzare grandi quantità di dati sperimentali, integrando biologia, informatica, matematica e statistica. In generale, applica metodi informatici alla ricerca biologica e biomedica, estendendosi oggi anche ai settori sanitario, comportamentale ed ecologico.

Le sue basi concettuali risalgono agli anni ’50, con lo studio del codice genetico. Nel 1953 James Watson e Francis Crick, grazie ai dati di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, descrissero la struttura a doppia elica del DNA.

L’appaiamento complementare delle basi (A-T, G-C) spiegò come l’informazione genetica potesse essere replicata e trasmessa, ponendo le basi per considerare il DNA come un sistema di codifica dell’informazione.

La bioinformatica in senso moderno nasce quando questi dati diventano digitali e richiedono strumenti informatici per essere gestiti. Tra gli eventi chiave vi fu il sequenziamento dell’insulina da parte di Frederick Sanger, che dimostrò che le proteine hanno una sequenza definita di amminoacidi.

Un ruolo centrale fu svolto da Margaret Oakley Dayhoff, che nel 1962 sviluppò uno dei primi programmi in FORTRAN per l’analisi di sequenze proteiche. Pubblicò l’“Atlas of Protein Sequence and Structure”, introdusse il codice a una lettera per gli amminoacidi e contribuì alla nascita delle prime banche dati biologiche, anticipando i moderni database molecolari.

La disponibilità di sequenze biologiche rese possibile uno studio quantitativo dell’evoluzione. Nacque così la bioinformatica evoluzionistica, che fornisce una base molecolare alla teoria dell’evoluzione attraverso il confronto di sequenze. Con l’aumento delle sequenze disponibili emerse un problema cruciale: come confrontare due o più sequenze biologiche tenendo conto di mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni (gap).

Nel 1970, Needleman e Wunsch introdussero un algoritmo di programmazione dinamica per l’allineamento globale delle sequenze, che rappresenta una pietra miliare tuttora utilizzata come riferimento teorico.

La rivoluzione del sequenziamento del DNA

Nel 1977, Frederick Sanger sviluppò il metodo di sequenziamento del DNA che rese possibile ottenere sequenze nucleotidiche in modo relativamente rapido e standardizzato; questo evento segnò l’inizio della genomica moderna.

Negli anni successivi aumentarono rapidamente le sequenze disponibili, nacque l’esigenza di archiviare e condividere i dati, si svilupparono infrastrutture computazionali dedicate. Negli anni ’80 furono creati i grandi database pubblici di sequenze: GenBank, EMBL-EBI, DDBJ. Nel 1991, il CERN rese pubblico il World Wide Web, facilitando enormemente la diffusione dei dati scientifici. Nello stesso periodo ebbe inizio il Progetto Genoma Umano, che culminò nei primi anni 2000 e rappresentò una svolta epocale per la bioinformatica. Con l’avvento delle tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS) (dal 2005 in poi), la produzione di dati biologici è cresciuta in modo esponenziale. Oggi la bioinformatica comprende: genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica, epigenomica. Tutte queste discipline rientrano nel concetto di scienze omiche che producono big data biologici.

Banche dati biologiche: primarie e secondarie

Le banche dati primarie contengono dati grezzi: sequenze di DNA; sequenze proteiche; strutture depositate senza interpretazione estesa. Es. GenBank, PDB (Protein Data Bank).

Le banche dati secondarie rielaborano i dati primari: eliminano ridondanze; correggono errori; aggiungono annotazioni funzionali, strutturali ed evolutive.

Es. UniProt, rappresenta un database integrato, a metà tra primario e secondario.

Le annotazioni includono: funzione biologica; localizzazione cellulare; interazioni proteiche; modificazioni post-traduzionali. Queste informazioni derivano dalla letteratura scientifica revisionata (peer review) e sono essenziali per trasformare il dato grezzo in conoscenza biologica utilizzabile.

Una banca dati diventa un database quando è associata a un sistema di interrogazione e strumenti di ricerca e analisi. Es. PubMed è una banca dati bibliografica; UniProt, PDB e NCBI sono database biologici strutturati.

Solo una frazione delle proteine note ha una struttura tridimensionale risolta sperimentalmente tramite cristallografia a raggi X e microscopia elettronica criogenica. Negli ultimi anni, modelli predittivi come AlphaFold (sviluppato da DeepMind) hanno rivoluzionato la predizione strutturale, fornendo modelli ad alta accuratezza, sebbene principalmente per monomeri.

Es. Gene INDY

Per trovare informazioni su un gene come INDY, il punto di partenza più naturale è spesso Wikipedia, non perché sia una fonte definitiva, ma perché è molto utile per orientarsi. Cercando “INDY gene” o “I’m Not Dead Yet gene”, si trova una descrizione generale: si tratta di un gene inizialmente studiato in Drosophila melanogaster, coinvolto nel metabolismo energetico, in particolare nel trasporto del citrato, e che esistono omologhi anche nell’uomo.

Nella pagina di Wikipedia sono presenti collegamenti ai database biologici ufficiali; si trova una sezione con gli identificativi del gene e della proteina, tra cui il link a UniProt. Cliccando sul link di UniProt, si apre la pagina dedicata alla proteina codificata dal gene INDY (nell’uomo chiamata SLC13A5).

La prima cosa che si nota è che la proteina ha un accession number, un identificatore univoco che garantisce che si sta parlando esattamente di quella proteina e non di una descrizione generica. Su UniProt si trova una descrizione chiara della funzione biologica: la proteina è un trasportatore di citrato e svolge un ruolo chiave nel metabolismo energetico. Questa informazione non è un riassunto divulgativo, ma deriva da studi sperimentali pubblicati.

Proseguendo nella pagina, si può vedere com’è fatta la proteina dal punto di vista strutturale, quanti amminoacidi la compongono, se è una proteina di membrana (e nel caso di INDY lo è), quante regioni transmembrana possiede e se sono presenti domini funzionali specifici. Se esistono strutture tridimensionali risolte sperimentalmente, UniProt rimanda direttamente al Protein Data Bank; in alternativa posso trovare modelli predetti, per esempio tramite AlphaFold.

Un’altra parte importante è la sequenza amminoacidica: UniProt fornisce la sequenza completa, che può essere scaricata in formato FASTA. Questa sequenza è il punto di partenza per qualunque analisi bioinformatica successiva: allineamenti, studi evolutivi, predizione di struttura secondaria o modellazione tridimensionale.

Nel caso delle proteine umane, UniProt spesso riporta anche informazioni sull’espressione nei diversi tessuti e sulle patologie associate. Es. Per SLC13A5 vengono riportati collegamenti con disturbi neurologici ed encefalopatie, insieme alle mutazioni note che alterano la funzione della proteina.

In fondo alla pagina, UniProt elenca tutti i riferimenti bibliografici da cui derivano le annotazioni. Questo rende il database uno strumento scientifico completo: non solo dice cosa fa una proteina, ma permette di risalire agli esperimenti originali.

Predizione strutturale per omologia con Swiss-Model - passaggio ad AlphaFold

Prima dell’arrivo di AlphaFold, uno degli strumenti più importanti e utilizzati per la predizione della struttura delle proteine era Swiss-Model, sviluppato in Svizzera. Per molti anni ha rappresentato uno standard di riferimento nella bioinformatica strutturale. Swiss-Model si basa su una tecnica chiamata homology modelling. L’idea alla base è piuttosto intuitiva: se si conosce la sequenza di una proteina ma non la struttura tridimensionale, la prima cosa che si può fare è cercare nel database altre proteine simili per sequenza, appartenenti magari a organismi diversi, ma di cui la struttura è già stata risolta sperimentalmente. Se si trova una proteina con un’identità di sequenza dell’80%, e di quella proteina si conosce la struttura 3D, si può assumere che anche la proteina di interesse abbia una struttura molto simile. A partire da questa informazione, Swiss-Model ricostruisce un modello tridimensionale per omologia.

Swiss-Model non serviva solo a costruire strutture “da zero”, ma era (ed è tuttora) molto utile per completare strutture sperimentali incomplete. Spesso nelle strutture risolte con cristallografia o microscopia elettronica mancano dei tratti: nei file PDB questi segmenti assenti sono indicati con dei “trattini”. In questi casi Swiss-Model permetteva di ricostruire le regioni mancanti, sfruttando strutture simili già note. Il risultato era un modello che, per il 95-99%, coincideva con la struttura sperimentale, ma che aveva il vantaggio di essere completo, senza “buchi”. Questo era particolarmente utile quando si doveva modellare o studiare una regione mancante nella struttura sperimentale: invece di usare il dato incompleto, si poteva usare il modello ricostruito.

Con AlphaFold non solo si ottiene modello completo, ma anche una stima della sua affidabilità, fornita direttamente dal software. AlphaFold utilizza un codice colore per indicare la confidenza della predizione:

• Le regioni in blu sono quelle con alta affidabilità, spesso corrispondenti a strutture secondarie ben definite come α-eliche e β-foglietti;
• Le regioni in rosso indicano bassa confidenza, tipicamente loop flessibili, regioni disordinate o terminali proteici.

Questo è fondamentale perché il software non si limita a “dare una struttura”, ma indica anche di quali parti ci si può fidare e quali vanno interpretate con cautela. Ad esempio, i loop o i terminali N- e C- sono spesso rossi perché sono regioni molto flessibili: AlphaFold può proporre una conformazione plausibile, ma segnala chiaramente che quella forma potrebbe non essere stabile nella realtà.

Per questo motivo, quando si studia una proteina, UniProt è il primo database da consultare; qui si trovano funzione biologica, sequenza amminoacidica, domini strutturali, eventuali mutazioni note, link alle strutture sperimentali (PDB) o ai modelli predetti (AlphaFold). Tutte queste informazioni rappresentano una base solidissima per qualunque studio successivo. L’altro grande database fondamentale è RCSB PDB (Protein Data Bank). Qui sono raccolte tutte le strutture tridimensionali risolte sperimentalmente, tramite cristallografia a raggi X, NMR o microscopia elettronica. Ogni struttura ha un codice identificativo univoco e può essere esplorata in 3D direttamente dal browser. Questo permette di: visualizzare la proteina nella sua forma reale, analizzare amminoacido per amminoacido, confrontare la sequenza con la struttura, studiare siti catalitici o di legame.

Importanza della biologia strutturale

La biologia strutturale è fondamentale per la comprensione della funzione biologica. Per moltissimi sistemi si conosceva la funzione da decenni, ma senza la struttura mancava il quadro completo.

Es. La funzione del ribosoma era nota da tempo ma la struttura è stata risolta solo intorno al 2000. Solo allora si è potuto capire davvero come interagisce con l’mRNA e come avviene la traduzione a livello molecolare. Lo stesso vale per canali ionici, fondamentali per la trasmissione nervosa, recettori GPCR, bersagli di una grandissima parte dei farmaci e ATP sintasi, un vero e proprio motore molecolare.

La conoscenza strutturale ha avuto un impatto enorme soprattutto in farmacologia. Prima, lo sviluppo dei farmaci avveniva per tentativi; oggi invece è possibile un approccio razionale, basato sulla forma della proteina bersaglio. Questo è cruciale anche per problemi attuali come: lo sviluppo di nuovi antibiotici, la medicina personalizzata.

La rodopsina è stata una delle prime proteine di membrana eucariotiche di cui è stata risolta la struttura tridimensionale ad alta risoluzione. Questo è importantissimo, perché per decenni le proteine di membrana erano considerate quasi “impossibili” da cristallizzare: sono idrofobiche, stanno immerse nel doppio strato lipidico, tendono a denaturarsi fuori dalla membrana. La rodopsina appartiene alla grande famiglia dei GPCR (G-protein coupled receptors), cioè i recettori accoppiati a proteine G.

Questa famiglia è enorme (centinaia di recettori), è coinvolta in vista, olfatto, gusto, neurotrasmissione, ormoni ed è il bersaglio di una grandissima parte dei farmaci in commercio. La rodopsina è stata usata come modello strutturale per capire: l’architettura tipica dei GPCR, la presenza delle 7 α-eliche transmembrana, come un segnale esterno viene convertito in un segnale intracellulare. Per anni, tutto ciò che si sapeva strutturalmente sui GPCR derivava proprio dalla rodopsina. Quando è stata risolta la struttura della rodopsina:

• Si è potuto visualizzare per la prima volta una proteina di membrana con più eliche transmembrana,
• Si è capito come le eliche sono organizzate nello spazio,
• Si è iniziato a capire come avviene l’attivazione conformazionale del recettore.

Questo ha avuto un impatto enorme perché ha fornito un template strutturale per modellare altri GPCR, ha permesso l’uso di homology modelling (Swiss-Model), ha aperto la strada alla drug design razionale sui recettori di membrana. Con AlphaFold oggi si possono predire molte strutture di GPCR, ma la rodopsina resta un riferimento sperimentale fondamentale.

Per molti anni il grande problema era lo squilibrio tra tantissime sequenze disponibili e pochissime strutture risolte sperimentalmente. Per affrontare questo problema è nata la competizione CASP, in cui le strutture sperimentali non ancora pubblicate venivano usate come test per valutare i metodi di predizione. Per anni la predizione si è fermata intorno al 50-70% di accuratezza. Poi, con l’ingresso di DeepMind e AlphaFold, si è arrivati a valori intorno al 95%, segnando una vera e propria rivoluzione scientifica. Oggi AlphaFold non ha risolto definitivamente il problema del folding proteico, ma ha cambiato completamente il modo di lavorare in bioinformatica strutturale e ha aperto nuove opportunità di ricerca e di lavoro, soprattutto nel settore biotech e farmaceutico.

Lez 3. 17/2 Allineamento di sequenze

Quando si lavora con geni e proteine, il punto di partenza sono sempre le sequenze; le informazioni molecolari sono infatti codificate come successioni di nucleotidi (nel DNA e RNA) o di amminoacidi (nelle proteine). Queste sequenze si recuperano da database biologici specializzati, come UniProt per le proteine o GenBank per le sequenze nucleotidiche. Un altro database di riferimento è RefSeq che fornisce sequenze curate e non ridondanti.

In questi archivi si può cercare un gene per nome, organismo o parola chiave, ma ogni sequenza è associata a un codice identificativo univoco, chiamato accession number, che permette di distinguere con precisione un record dagli altri. Nei database nucleotidici, il prefisso del codice indica il tipo di molecola:

• NM_ identifica un RNA messaggero;
• NP_ la proteina codificata;
• NR_ RNA non codificanti;
• NC_, NW_, NT_ indicano sequenze genomiche complete o frammenti (contig/scaffold).

Le sequenze sono spesso fornite in formato FASTA, uno standard molto semplice: una riga iniziale che inizia con “>” contiene le informazioni identificative, seguita dalle righe con