Appunti di Bioinformatica

Bioinformatica

La bioinformatica è una scienza multidisciplinare che integra conoscenze di tipo informatico, chimico, matematico e biologico. Ha lo scopo di collezionare ed elaborare in modo sistematico ogni informazione relativa ai dati biologici per ottenere la massima resa dalle ricerche sperimentali e per sviluppare queste ultime in modo più mirato. Se io ho una conoscenza approfondita del dato, allo stesso tempo posso in maniera efficiente programmare gli esperimenti che devono essere fatti.

Grazie alla bioinformatica è possibile avere uno sguardo d'insieme su tutte le conoscenze scientifiche su un dato argomento e da questo partire per ulteriori osservazioni. La bioinformatica nasce ovviamente quando si iniziò ad avere dati che dovevano essere analizzati in silico (la locuzione è usata per indicare fenomeni di natura chimico-biologica riprodotti in una simulazione matematica al computer, invece che in provetta o in un essere vivente).

Appena si sono ottenute le prime sequenze di DNA e proteine servivano persone che analizzassero tali sequenze. Già presente negli anni '60, "esplosa" con l'avvento del sequenziamento massivo (Next Generation Sequencing, NGS). Cioè quando da poche sequenze, si è passati ad avere sequenze di interi genomi in pochissimo tempo, le banche dati si sono sovraffollate di sequenze di genomi.

La pandemia ha messo in luce l'analisi delle sequenze e dei dati e l'importanza del ruolo della bioinformatica. Il fatto che siamo arrivati così velocemente a un vaccino è grazie al fatto che possiamo sequenziare molto velocemente il genoma di un organismo o di uno pseudorganismo (virus). La stessa divisione in varianti del COVID-19 o l'analisi di chi è più disposto a sviluppare sintomi gravi o lievi sono il risultato dell'uso massivo dell'analisi computazionale. Si riescono a processare talmente tante sequenze in poco tempo che la bioinformatica sta regolando le nostre vite.

Dati biologici e applicazioni cliniche

Quando si parla di dati di origine biologica mi posso riferire ad aspetti più clinici, quindi ad esempio dati di sequenziamento derivanti da pazienti con una certa malattia e il confronto con pazienti sani, o il sequenziamento di un ceppo batterico multi-resistente, o di sequenziamento di genoma/trascrittoma e così via.

Ruolo del bioinformatico

• Colui che crea nuovi strumenti informatici per l'analisi scientifica e per la gestione dei dati;
• Non è un utilizzatore di programmi per analisi di dati biologici, quello che ci aspettiamo da un bioinformatico è qualcosa in più, saper colmare le lacune che programmi già esistenti hanno oppure inventarne di nuovi;
• Deve conoscere (almeno) un linguaggio di programmazione, si ottiene una grandissima mole di dati e non sempre ci sono programmi che permettono di estrapolare quello che ci serve;
• Profonda partecipazione nel disegno sperimentale;
• Non usa (solo) Windows;
• Deve essere multi-disciplinare;
• Basi di conoscenza di come funziona un computer;
• Utilizzo della “riga di comando” (command e non del “punta e clicca”).

Bioinformatica vs biologia computazionale

Sviluppatori/Bioinformatici: coloro che si occupano di creare nuovi strumenti informatici per l'analisi scientifica e di aspetti gestionale dei “Big Data”. Strumenti utilizzati: linguaggi di programmazione. Particolare attenzione alla utilizzabilità dei tool/software.

Biologi computazionali: coloro che utilizzano gli strumenti bioinformatici per ottenere dati e da questi indirizzare l'analisi sperimentale (e viceversa). Strumenti utilizzati: linguaggi di programmazione, programmi già scritti, banche dati. Particolare attenzione al significato biologico dei dati ottenuti e ai trend biologici osservati.

La biologia computazionale confina molto con la biologia dei sistemi, cioè quella parte della biologia che consente di utilizzare i sistemi biologici nella loro interezza.

Principali applicazioni in bioinformatica

• Analisi di sequenza;
• Annotazione del genoma;
• Analisi della letteratura;
• Analisi dell'espressione genica;
• Analisi della normativa;
• Analisi dell'espressione proteica;
• Analisi delle mutazioni nel cancro;
• Vaccinologia inversa;
• Genomica comparata;
• Biologia evolutiva computazionale;
• Biologia dei sistemi;
• Modellazione di sistemi biologici;
• Analisi delle immagini ad alto rendimento.

Cosa vedremo in questo corso?

Introdurremo la teoria e la pratica che sta dietro all'analisi dei dati in campo biologico. Oggi viviamo in un'era subito dopo l'era detta "OMICS" che ha invaso la biologia e la medicina intorno agli anni 2000. Ora ci troviamo nell'era post omica, cioè quell'era scientifica in cui si dà per scontato la possibilità di ottenere dati omici:

• Genomica (presenza/assenza di geni);
• Trascrittomica (espressione geni);
• Fenomica (possibilità di ottenere un profilo fenotipico).

Queste tecnologie generano dati difficilmente interpretabili senza un approccio computazionale, ad esempio:

• Sequenziamento massivo (Illumina HiSeq);
• Esperimento di trascrittomica (Microarray);
• Esperimento di fenomica (Biolog, Phenotype Microarray).

Una volta ottenuto però il mio genoma, cosa si fa? Mi trovo dinanzi a una serie di lettere che ovviamente hanno un senso, ma non è immediato leggere a cosa questo genoma porti. Ci poniamo una serie di domande:

• Quali sono i geni che contiene un organismo?
• Quanti di questi sono condivisi con organismi simili?
• Ci sono varianti che predispongono a certe malattie?
• Quali sono le potenzialità metaboliche dell'organismo?
• Come è strutturato e regolato il suo genoma?

Ci sono infatti tante sfumature che ogni organismo ha rispetto agli organismi modello che si studiano abitualmente. La prima cosa da fare è estrarre il DNA e sequenziarlo. Si raccoglie, cioè si gestiscono i dati che escono dalla macchina e poi si passa all'analisi del dato: cioè l'insieme dei geni che un organismo possiede.

Questo che informazione ci dà sulla vita e sulla biologia di quell'organismo? In realtà poche se non si confrontano e intrecciano queste informazioni con i genomi di altri organismi—> si calcola il cosiddetto pangenoma, cioè il numero di geni che una specie condivide con le altre; oppure si identificano cluster genici, cioè gruppi di geni che portano in una cellula una funzione specifica; oppure si fa una predizione delle interazioni che possono avvenire all'interno di una cellula.

Con l'identificazione dei cluster genici, si può arrivare ad esempio ad identificare i geni coinvolti nel metabolismo secondario: tipo in batteri o lieviti—> questi cluster spesso sono coinvolti poi nella produzione di composti biotecnologicamente molto importanti, cioè che portano alla produzione in seguito anche su larga scala di molecole di interesse clinico e farmacologico. Ad esempio, ultimamente, dal campionamento di un ceppo batterico delle profondità oceaniche, siamo arrivati a un farmaco, cioè a una molecola prodotta da questo ceppo, che è in fase molto avanzata per la cura di un certo tipo di cancro.

Per fare questo ci sono strumenti computazionali che consentono di buttare il genoma dentro questi database ed estrarre certe informazioni. Una volta sequenziato un genoma, avendo a disposizione genomi di altre specie simili, possiamo vedere se il pangenoma (cioè l'insieme dei geni di una specie) è aperto o chiuso: cioè, sequenziando altri ceppi di quella specie o specie simili, qual è la possibilità di scoprire nuovi geni.

Se il pangenoma è aperto, vuol dire che c'è alta variabilità—> sequenziando un altro organismo di quel gruppo tassonomico è molto probabile che si individuino nuovi geni con funzioni sconosciute; se il pangenoma è chiuso, pur sequenziando altri genomi, probabilmente riscoprirò gli stessi geni.

Ulteriori domande sul genoma

Altre domande che posso pormi una volta ottenuto il genoma:

• Quali sono i geni che vengono co-espressi in una particolare condizione?
• Ci sono gruppi di geni, ad esempio, che pur essendo in parti diverse del cromosoma, o su cromosomi diversi, o appartenenti a processi funzionali apparentemente distinti, vengono co-espressi—> cioè vengono espressi nello stesso momento o nella stessa fase cellulare.

Questi li posso identificare usando strumenti computazionali e mi possono dire se geni sconosciuti vengono co-espressi sempre (ho sempre l'espressione di un gene accompagnato all'espressione dell'altro), o funzionano in maniera concertata ecc.

Importante è quindi vedere se:

• C'è regolazione comune (stesso fattore trascrizionale)?
• O se partecipano allo stesso processo cellulare?
• O se sono geni costitutivi?

Per fare questo c'è un disegno sperimentale da seguire e da produrre, poi abbiamo estrazione dell'RNA, sequenziamento e data collection che possono essere automatizzati. La cosa che non può essere automatizzata (o che può esserlo ma richiede comunque l'interpretazione del ricercatore) è la parte di analisi dei dati.

Analisi del microbiota

Da chi è composto il microbiota di un campione biologico? Si va a vedere la composizione della flora microbica! Ecco cosa possiamo scoprire:

• Presenza di una flora microbica alterata?
• Specie marker di certe patologie?
• Sviluppo di probiotici.

Anche in questo caso si fa un disegno sperimentale in cui il bioinformatico deve giocare un ruolo cruciale e poi in base al distretto campionato si può analizzare come cambia nel tempo la flora microbica.

Previsioni e simulazioni in bioinformatica

Inoltre, grazie alla bioinformatica:

• È possibile prevedere il comportamento di un sistema biologico;
• Effetto di una mutazione all'interno di un genoma;
• Effetto di una variazione della regolazione;
• Identificazione di geni essenziali;
• Andamento di un ecosistema nel tempo.

Qui entrano in ballo strumenti matematici più avanzati:

• Scelta del sistema modello;
• Raccolta informazioni;
• Ricostruzione del modello;
• Simulazioni;
• Experimental validation.

Standard e formati di dati in bioinformatica

Come già detto, gran parte della bioinformatica riguarda l'analisi di sequenze, quindi di dati che provengono da sequenziamenti massivi o simili. L'analisi di sequenze del DNA o di proteine, quindi di sequenze nucleotidiche o aminoacidiche, rimane un aspetto centrale nel panorama della formazione e dell'utilizzo di strumenti computazionali. Per fare questo dobbiamo fare una sorta di astrazione: c'è bisogno di cominciare a considerare le sequenze di geni o proteine come delle stringhe—> parole più o meno lunghe composte da un alfabeto che prevede 4 lettere (basi azotate) o di 20 lettere (aminoacidi). Una sequenza la vedremo come un file di testo.

Cos'è un file di testo?

>geneTTCACAGCCATGTCCGGGATCTGGGTTCACTTGTCACTGATATTTATCTCTGTTTCTAGACCATTGTCTAAAGGTGAAAATGCCCACGTGGCTGGTATCAACTCTGAGGGGCTGAGATTGAATAAGAATATTACTGGAGCAAGTTCCTGCCAAGAAGGCCTATATCGTGAGCACCTGTTTTGCTGTCAGCCTTGTCCTCCTGGCAAACGTTTGCAAACGCGACGGAGATATGCCAGAATGTGTGCTCTGCTCGGAGGGGAACGAGTACACAGACAAGAGCCATCATTCTGACAAATGCATAAGATGTAGTGTCTGTGATGAAGAACATGGGCTAGAAGTGGAACACAACTGTACTCGGACCCAGAATACCAAGTGCAGATGCAAATCGAATTTTTTTTGTAACAGTTCTCCATGCGAACACTGTAACCCTTGCACCACGTGTGAACATGGAATCATTGAGAAGTGCACACCAACTAGCAACACCAAATGCAAAGGATCCAGATCTCACACAAACAGTTTATGGGCCCTCCTGATCCTCCTCCTCCTCATCCTAATATTTCTAATAATATACAAAGTGGTGAGACGTCGACGCAGGAATAAAAAGAATGGTAATTGCGTCTCTGCAGCCTCAAGTGATGAAGGGAGGCAACTGAATTTAACAGATGTTGACTTGGGTAAATATATCCCTAGTATTGCTGAACTAATGAAAATAACTGAAGTTAAAGAATTTGTTCGGAAGAATGGTATGGAGGAAGCCAAAATAGATGATATCATGCATGACAATCTCCATGAAACAGCTGAACAGAAGGTCCAACTGCTCCGCAAGTGGTACCAAAGTCACGGGAAGAAAAATGCATATTGTACATTGACTAAAAATCTCCCAAAAGCTCTTGCAGAGAAGATTTGTGACATAGTCCTGAAGGACATTACTAATGAACGTGAAAATGCAAACTTGCAAAATGAAAGTGAAAACCTGGTTTAAAGTGAAAAATAATTAACTCAGTTCTGAGAATATACTAAATATTCTAAATATGTTCA

Si tratta di un file che non ha niente dentro se non i caratteri che messi insieme hanno in questo caso la sequenza di un gene. Quando questi file di sequenza vengono scaricati, sono codificati in file di testo semplici—> è questo il tipo di struttura. Se compaiono ad esempio simboli o caratteri come in un file word, molti dei tool e dei programmi utilizzati per visualizzare e maneggiare queste sequenze non funzioneranno. Il file word inoltre pesa molto di più di un file di testo, e per sequenze molto lunghe questo può essere un problema—> si arriva ad avere una differenza enorme di peso tra un formato e l'altro.

Inoltre, entrambe le sequenze, sia nucleotidiche che AA, devono essere utilizzate e lette da diversi tool e programmi, devono poter essere scambiate da diversi laboratori di ricerca in parti opposte del mondo—> devono quindi adottare un formato standard. Il cosiddetto formato FASTA. È lo standard per l'archiviazione, la conservazione e lo scambio di file di sequenze aminoacidiche/nucleotidiche. È un semplice formato di testo che non deve avere nient'altro se non caratteri biologici e/o il nome della sequenza.

Come è rappresentato: Nella prima linea troviamo il segno >; Dopodiché tutto il resto della linea è lasciato per il nome della sequenza—> es. >gene. Solitamente le informazioni che troviamo su questa linea è da che organismo proviene la sequenza, la sua posizione sul cromosoma e se è nota, la funzione. Dalla seconda linea in poi inizia la sequenza, fino a un punto nel file. Se si ha un file semplice con una sola sequenza, ovviamente, fino alla fine della sequenza stessa. Se invece si ha un file definito MULTI-FASTA (più di una sequenza), la sequenza arriva fino a che non troviamo un altro >. Nella prima linea tipicamente troviamo quello che si chiama: identificativo della sequenza, cioè un codice che identifica univocamente quella sequenza nell'ambito ad esempio di un database. La prima linea è chiamata anche DEFINITION LINE. Per quello che riguarda questi codici all'inizio della sequenza, questi ci rimandano direttamente a un database.

Vediamo che ogni sequenza, in base al database da cui proviene, viene etichettata e targata in modo tale da risalire grazie a quel codice univocamente a quella sequenza. Ad ogni codice corrisponde quindi una e una sola sequenza. Però, ad una certa sequenza, corrisponde sicuramente uno e un solo codice? No! Questo perché la variabilità biologica può far sì che due sequenze siano identiche ma appartengano a organismi diversi—> hanno quindi identificazioni diverse. Tutte le sequenze vengono racchiuse in quelli che vengono definiti DATABASE, rese disponibili per tutti coloro che ne hanno la necessità.

Dai tipi di file che abbiamo visto per ora mancano però molte informazioni: Esistono altri formati di file che contengono più informazioni oltre alle sequenze (chi l'ha realizzata, quando ecc). Anche questo è un file di testo, si chiama GENBANK FORMAT. È un file molto più pesante di un file FASTA. File di testo che ci dà molte più informazioni per quanto riguarda la singola sequenza. Si visualizza in una parte sinistra in cui sono indicati dei campi e nella corrispettiva parte destra tutte le informazioni correlate a quel campo.

Ad esempio troviamo il LOCUS—> ci dice la posizione di quella sequenza nel cromosoma o nel genoma che sto analizzando. Anche in questo caso abbiamo il LOCUS TAG, un codice univoco che identifica quella sequenza; Altro campo importante è il CDS—> ci da informazioni su quel gene—> tipo dove è localizzato; Inoltre, se non si tratta ad esempio di una piccola sequenza, ma di una grande sequenza, tipo cromosoma intero, quest'ultima può essere suddivisa in FEATURE—> cioè in pezzi discreti che vanno da una posizione a un'altra e che corrispondono a unità funzionali che possono essere geni, promotori o altre regioni importanti del DNA.

Il campo LOCUS contiene una serie di diversi elementi di dati, inclusi il nome del luogo, la lunghezza della sequenza, il tipo di molecola, la divisione GenBank e la data di modifica. Ogni elemento è descritto di seguito.

ACCESSION: Identificatore univoco per un record di sequenza. Un numero di accesso si applica al record completo ed è solitamente una combinazione di una o più lettere e numeri, come una singola lettera seguita da cinque cifre (ad es. U12345) o due lettere seguite da sei cifre (ad es. AF123456). Alcune accessioni potrebbero essere più lunghe, a seconda del tipo di record di sequenza.

FEATURES: Informazioni sui geni e sui prodotti genici, nonché sulle regioni di importanza biologica riportate nella sequenza. Questi possono includere regioni della sequenza che codificano per proteine e molecole di RNA, nonché una serie di altre caratteristiche.

CDS: Sequenza di codifica; regione di nucleotidi che corrisponde alla sequenza di amminoacidi in una proteina (la posizione include i codoni di inizio e di fine). La funzione CDS include una traduzione di amminoacidi. Gli autori possono specificare la natura del CDS utilizzando il qualificatore "/evidence=experimental" o "/evidence=not_experimental".

Molto spesso ci troviamo di fronte a genomi interi, in cui la quantità di dati è notevole—> dobbiamo comprimere le informazioni e quindi per ogni singola sequenza non possiamo dargli tutto lo spazio che gli diamo in un file GENBANK, e così si utilizza il formato GFF (General Feature Format).