Appunti Biologia molecolare ed epigenetica

Appunti biomolecolare

A causa del loro polimorfismo: distrofia miotonica, atassia, sindrome dell’X fragile, associate a ripetizioni di triplette non nella regione codificante ma al 5’ UTR o 3’ UTR. Questo ci mostra come si possano avere, nel caso del 5’, promotori più o meno efficienti ma anche regioni in 3’ modificate dove di norma si ha la regolazione della stabilità del messaggero. Pertanto, i difetti associati ai microsatelliti possono dare proteine alterate nella sequenza o proteine espresse in modo abnorme.

Capitolo 1

Complessità biologica del genoma

La cellula cerca sempre un modo di fare le cose tramite il concetto di “economia e sopravvivenza”: la strada più semplice ed economica è la via di ogni risposta cellulare.

Inoltre, ogni fenomeno deve essere valutato attraverso la considerazione dello spazio e del tempo: “due proteine possono regolarsi tra loro in vitro ma non trovarsi mai in vivo perché racchiuse in compartimenti separati”.

Se andiamo a vedere a livello di dimensione genomica e di numero di geni in vari organismi ci rendiamo conto che complessità dell’organismo, dimensione genomica e numero di geni non sono tra loro correlati precisamente: si parla piuttosto di densità genica, di un rapporto tra lunghezza del genoma e numero di geni.

Ad esempio, la G-thaliana ha un genoma 30 volte più piccolo di sapiens, 125 Mb vs 3200 Mb, ma ha un numero di geni pari a 25k, l’uomo 30-40k. Ecco che la nostra affermazione acquista ancora più senso. I batteri hanno 1 gene ogni 950 basi.

Il numero dei geni è correlato al numero delle proteine? No, anche stavolta. Esistono meccanismi come lo splicing alternativo che permettono al numero di proteine presenti nell’organismo di lievitare rispetto alla quantità dei geni codificanti. Ad esempio, in sapiens abbiamo 19k geni codificanti ma 80/100k proteine.

Il genoma umano

Il genoma umano è formato da:

• 1. DNA intergenico 2000 Mb composto da:
• Ripetizioni intersperse.
• LINE.
• SINE.
• LTR.
• Trasposoni.
• Altre regioni intergeniche: sequenze di DNA ripetute in tandem che caratterizzano telomeri e centromeri e che possono rappresentare instabilità genomica.
• Microsatelliti: identificazione individuale ma anche associazione a patologie note.
• Varie.

2. DNA genico e geni correlati 1200 Mb composto da:

• Geni.
• Sequenze correlate.
• Pseudogeni.
• Frammenti genici: geni in altri geni come il gene per la neurofibromatosi di tipo 1, che ha al suo interno 3 geni con introni ed esoni propri.
• Introni.
• UTR.

Morbo di Huntington

Morbo di Huntington: malattia neurodegenerativa sistemica ereditaria autosomica dominante, figli al 50% positivi alla malattia indipendentemente dal sesso.

È stata inizialmente studiata in Venezuela dove si vide un aumento dei casi del 20%. Venne scovato il gene per l’huntingtina correlato alla ripetizione della tripletta CAG per glutammina.

Quello che si forma è una poliglutammina a causa di una rilettura della tripletta. In un soggetto sano, questa ripetizione va da 6 a 35, in un soggetto malato da 35 in su e più sono ripetute le triplette e più la malattia sembra essere grave.

Con l’aumentare della lettura della tripletta si ha la struttura della proteina che diventa sempre più disordinata, un disordine 3D che porta ad un rilascio compromesso dei neurotrasmettitori nel sistema nervoso.

È stato visto, inoltre, che questo gene era presente già in ameba, anche se con una blandissima ripetizione di triplette.

Questo ci mostra che, via via procedendo con l’evoluzione, il sistema si è ottimizzato aumentando il numero di triplette lette, fino ad insorgere conseguenze patologiche qualora si avesse una ripetizione maggioritaria.

Lo slippage della polimerasi, scivolamento, è causato da zone instabili in cui la DNA polimerasi non procede linearmente ma torna indietro e rilegge la tripletta, portando ad averne in più.

Inoltre, si può verificare un aumento del numero di triplette passando di padre in figlio e, dove magari il genitore non ha la malattia, la sviluppa il figlio che differisce di una singola tripletta.

Capitolo 2

Bisogna sempre valutare le mutazioni non solo sotto l’aspetto negativo ma anche considerandole come possibili vantaggi selettivi positivi, come nel caso del tumore vista con gli occhi della cellula tumorale che vuole sopravvivere.

Bisogna perciò avere un approccio trasversale nello studio della materia.

Se chiediamo a vari professionisti cosa sia un gene essi ci risponderanno in maniera diversa in base ai loro studi. La definizione molecolare è che un gene è una sequenza che viene trascritta generando famiglie di prodotti.

Negli eucarioti il gene comprende:

• Sequenze regolatrici, promotore, enhancer, silencer.
• Sequenze trascritte, intro/eso.

Per vedere l’organizzazione genica ci si basa sulla tecnica del bendaggio che permette di osservare la distribuzione causale e con diversa densità dei geni.

Queste due caratteristiche, soprattutto la distribuzione casuale, sono riconducibili ad una mancanza di studi che spieghino il fenomeno; perciò, gli attribuiamo una distribuzione a caso.

La non omogeneità, invece, è stata dimostrata: 1-38 geni per Kb.

Un altro modo per classificare i geni è attraverso la marcatura con fluorocromi che prevede l’utilizzo di molecole coniugate per formare isocore.

Un’altra caratteristica dei genomi è la compattezza dato che esistono milioni di coppie di basi. Ad esempio, il cromosoma 22 dell’uomo ha 48 milioni di coppie di nucleotidi. Compattato è lungo 2 µm mentre disteso è 1,5 cm.

Gene Ontology

Gene Ontology: ci permette di identificare gruppi di geni secondo la loro funzione attraverso nomenclatura basata su attività collegate. I geni umani sono classificati:

• 1. Processi biologici.
• 2. Componente cellulare.
• 3. Funzione molecolare.

Si può vedere che nella funzione molecolare abbiamo:

• 5600 geni per proteine coinvolte in interazioni non covalenti con altre proteine, recettori. A loro volta si dividono in:
• Interazioni proteina-proteina.
• Interazioni proteina-acidi nucleici.
• 5100 geni per l’attività catalitica, enzimi, che a loro volta si dividono in:
• Idrolasi.
• Trasferasi.
• Il resto.

Tramite queste analisi si possono fare comparazioni tra organismi diversi per vedere dove risiedono le differenze ma soprattutto le uguaglianze.

Ad esempio, la thaliana ha geni per il metabolismo addirittura superiori a quelli dell’uomo, nonostante l’uomo sia un organismo più complesso rispetto all’Arabidopsis, un’erbetta.

Entrambi, invece, hanno un livello molto simile di geni correlati alla trascrizione e alla traduzione o addirittura ai segnali intracellulari.

Capitolo 3

Come si localizzano, come si classificano e come si può attribuire una funzione ad uno specifico gene?

Una delle modalità per cui è possibile classificare i geni è quella che tiene conto delle sequenze conservate: sequenze mantenute nell’evoluzione tali e quali, come le sequenze consenso.

Un esempio è la sequenza a -35 dal promotore batterico, la sequenza TTGAGA.

Questi motivi vengono scovati attraverso la sequence logo: processo bioinformatico che mette 1-12 sequenze in analisi e mostra la dimensione delle lettere delle basi proporzionate al grado di conservazione.

Quest’analisi viene poi confermata o smentita dall’analisi del trascrittoma e dal sequenziamento.

Nascono così le banche dati che servono per l’analisi di omologia delle sequenze: si cercano similarità o identità tra geni sequenziati sia nella sequenza che nella funzione, nella correlazione con malattie, cosa accade con la loro mutazione e via dicendo.

All’interno di una pagina possiamo avere una serie sequenziale di informazioni che corrispondono a vari aspetti di quella determinata sequenza/gene/proteina e si vengono a formare i FLAT FILE che si basano chiaramente sui singoli record di ogni argomento.

In ogni record abbiamo parole chiave che ci permettono di individuare i campi di quel record nel database.

Ogni banca dati funziona attorno ad un elemento biologico centrale, chiamato entry, cioè la raccolta dei dati di questo elemento.

Ci sono, inoltre, sistemi di retrievial o di recupero come SRS, Entrez, DBGET che servono per effettuare ricerche mediante vari metodi, come text search, copia-incollando la sequenza di interesse, cercando sequenze simili.

SRS è un sistema di recupero che comprende banche dati bibliografiche, Medline, malattie mendeliane, OMIM, sequenze genomiche, GenBank, e la classificazione degli organismi, Taxonomy.

Quando si interroga questo sistema ci si esprime spesso in formato FASTA, digitando > con una stringa di testo per descrivere la sequenza di interesse e, a capo, la sequenza stessa.

Identificazione e isolamento dei geni

Come si identificano ed isolano i geni?

• Attraverso l’approccio classico genetico.
• Attraverso l’approccio con genetica reverse.
• Attraverso l’uso di libraries di DNA o cDNA.

Il passaggio a cDNA garantisce uno studio più accurato in quanto il cDNA perde le zone introniche di cui ancora non conosciamo abbastanza e che rischiano di offuscare la reale sequenza di interesse.

Utilizzando anche un approccio bioinformatico possiamo definire delle regioni consenso, AG GT, che permettono di avere una visione chiara di dove finisce l’esone e dove inizia l’introne, e di dove finisce l’introne ed inizia l’esone.

Tra le regioni consenso più conosciute abbiamo le isole CpG nella zona del promotore genico. Si trovano anche negli introni.

Sono zone solitamente non metilate se si tratta di geni housekeeping, costitutivi e sempre trascritti, in quanto la metilazione è un metodo di silenziamento.

Nel caso della metilazione di CpG la citosina diventa 5-metil-citosina e può poi trasformarsi in timina per deaminazione spontanea. In questo caso, si ha il silenziamento, la non trascrizione dell’isola che viene perduta.

Questa metilazione, insieme alla metilazione di altre componenti come le regioni per il PoliA dell’RNA, è implicata nella regolazione dell’espressione genica.

Un’altra sequenza importante è ATG che, una volta trascritta diventa AUG ed è il codone di inizio.

Esistono dei fattori di sicurezza, ovvero ATG può essere trovata ripetuta in modo tale che se dovesse avvenire una modifica della regione in cui ATG è presente, non si leggerebbe la prima ATG ma la seconda o la terza. Si garantisce la funzionalità del gene.

Intrappolamento di esoni

Tornando alle metodiche che possono essere utilizzate: intrappolamento di esoni.

Si dimostra l’esistenza di regioni di giunzione esone-introne. Inoltre, si può caratterizzare un frammento di DNA, descrivendolo se ha esoni o meno, e possiamo capire se codifica qualcosa oppure è semplicemente una zona regolatrice.

Abbiamo:

• Un vettore plasmidico con due sequenze note.
• Siti di restrizione unici caratteristici del plasmide.
• Una sequenza di DNA non nota.

Tagliamo il plasmide nei siti di restrizione e vi inseriamo il DNA non noto. Avremo a questo punto un vettore con 2 sequenze note e 1 sequenza non nota.

Si fa trasfezione delle cellule di mammifero e si fa trascrivere. Avverrà lo splicing.

• Se nella mia sequenza non ho esoni, troverò le due sequenze note attaccate.
• Se nella mia sequenza ho esoni li troverò nel mezzo alle due sequenze note.

Si fa una reverse-PCR per retrotrascrivere a cDNA e poi si sequenzia la sequenza non nota.

Questo metodo è utile nel caso di patologie di cui non si sa la causa, oppure serve per identificare mutazioni, alterazioni abbinate ad un determinato fenotipo.

Positional cloning e chromosome walking

Il positional cloning è una tecnica utilizzata spesso per la definizione di un gene malattia. Il primo gene scoperto tramite questa metodica è stato il gene CGD, malattia cronica granulomatosa.

È una strategia per clonare un gene attraverso la definizione via via più precisa della sua posizione in mappe genetiche e fisiche, fino all’identificazione della corrispondente sequenza di DNA e/o di cDNA.

Si basa sull’idea che se una certa malattia ricorre in un nucleo familiare attraverso le generazioni, ci deve essere alla base un gene mutato la cui trasmissione è responsabile della malattia.

Si utilizzano marcatori specifici sul genoma e si allineano le sequenze lette per localizzare il gene mutato.

In seguito, si utilizza il chromosome walking, si cammina sul cromosoma per sequenziare e identificare la regione precisa del gene.

Questa passeggiata si fa prima marcando il cromosoma con precursori radioattivi e/o fluorocromi. Si va a sequenziare la regione che non si ibrida con una library di DNA scelto.

La libreria genomica mi conterrà frammenti di varia grandezza che danno una rappresentazione ordinata del tratto di genoma di mio interesse, una mappa dei geni trascritti.

In seguito, utilizzerò un’altra sonda e via via sequenzierò tutta la zona non nota, camminando lungo il cromosoma per mezzo di questi frammenti che via via si sovrappongono a quello precedente.

Tecniche più recenti mi permettono di saltare da una zona all’altra del cromosoma, mettendoci meno tempo rispetto al chromosome walking.

Gain/loss of function

Dopo aver identificato dove si trova un gene e la sua sequenza è molto importante cercare di comprendere la sua funzione.

Questo procedimento permette di capire il ruolo di quel gene o della sua proteina overesprimendoli o eliminandoli.

Nel gain of function utilizzo l’overespressione mediante amplificazione, mutazione degli elementi regolativi, trasfezione, retrovirus o transgeni.

Posso anche mutare il mio gene per far sì che sia sempre espresso e quindi che io abbia delle proteine sempre attive, oppure renderlo costitutivo.

Nella loss of function, invece, induco mutazioni, utilizzo RNA per il silenziamento o CRISP Cas9 per editare.

Si hanno poi trasfezioni o microiniezioni o l’utilizzo di vettori virali.

Capitolo 4

Organizzazione della cromatina e della matrice nucleare

Uno dei modi in cui si ha l’organizzazione in una cellula è la compartimentalizzazione interna. Il materiale genetico è circondato dalla membrana nucleare e questo è un modo di regolazione dell’espressione genica.

La membrana nucleare è costituita dalla membrana esterna che è il continuo del RE e la membrana interna. Esse costituiscono l’involucro nucleare ma non sono continue in quanto è presente il poro nucleare.

Il nucleo può non trovarsi nella sua forma classica tondeggiante: ci possono essere delle alterazioni di componenti che portano a introflessioni ed estroflessioni, quindi ad un’irregolarità nucleare, soprattutto in alcune patologie. Si ha quindi perdita di regolarità del nucleo.

La regolarità, di norma, è data dalle lamine nucleari, molto importanti nella regolazione dell’espressione genica. Le lamine sono proteine che si associano alla membrana nucleare e danno forma e rigidità al nucleo necessaria per rappresentare un supporto meccanico al materiale genetico.

Sono presenti lamina A, B e C. Sono proteine di 50/60 kDa. Questa rotondità della struttura conferita grazie alle lamine è quella che permette al materiale genetico di andare incontro al rimodellamento.

Le lamine tendono ad assemblarsi in dimeri e testa/coda a formare un supporto rigido.

Può sembrare una struttura rigida ma, in realtà, la capacità di assemblarsi e disassemblarsi e di favorire uno scorrimento l’una nei confronti dell’altra favorisce la dinamicità di questo supporto.

Le lamine hanno interazioni con altre proteine: emerina, proteina transmembrana che aiuta le lamine ad ancorarsi alla membrana.

Funzionano come punto di ancoraggio, LBR lamen b receptor che funzionano con la stessa logica.

Si hanno anche contatti con la F-actina che prende rapporto con la struttura centrale grazie ad altre proteine, inoltre, si ha la collaborazione della spectrina, una proteina accessoria nel contesto citoscheletrico nucleare. Essa contribuisce a dare consistenza alla matrice.

Durante la divisione cellulare si ha il disassemblaggio della membrana nucleare che segue alla fosforilazione delle lamine. A causa dell’inserimento della carica del fosfato si allontanano le due lamine.

Questa fosforilazione si ha da parte del complesso ciclina/Cdk.

La defosforilazione delle lamine è un processo di regolazione reversibile che si contrappone alla regolazione irreversibile durante l’apoptosi. Durante essa le lamine sono i target della caspasi che però non fosforilano.

Malattie per perdita delle lamine e ancoraggio

Le laminopatie sono patologie rare da difetto molecolare della lamina A che muta e non fa interazione con altre lamine o con le emerine.

Tecniche che permettono di analizzare la struttura interna del nucleo

• Microscopia elettronica classica che permette di studiare la dinamicità degli eventi.
• Microscopia a fluorescenza che rivela aree del nucleo in attività.
• FRET: sfrutta la presenza di una molecola fluorescente donatrice e una accettrice.

Il donatore può essere eccitato da una determinata lunghezza d’onda che può poi riemettere energia. Questa energia riemessa va ad eccitare l’accettore.

Esso, poi, emette fluorescenza che viene visualizzata dall’operatore.

Questo passaggio eccitazione/emissione/eccitazione/emissione permette di valutare se due proteine o DNA e proteine tendono ad essere molto vicine, 100 Å.

Gli svantaggi di questa tecnica sono correlati agli spettri di emissione; si può avere rumore di fondo in quanto alcune componenti possono presentare autofluorescenza.

Si usa la FRET anche per marcare due gruppi della stessa molecola e quindi vedendo la modificazione.

• Distrofia musco.