Appunti di Biologia molecolare

Scienze biologiche, Unibo FMBiologia molecolare

Cenni storici

Un gene è una sequenza di DNA che codifica per un RNA. Nei geni che codificano per proteine, l’RNA a sua volta codifica per una catena proteica. Il DNA è il materiale genetico. La trasformazione batterica fornì la prima prova sperimentale del fatto che il DNA è il materiale genetico, attraverso la dimostrazione che il DNA estratto da un ceppo batterico è in grado di modificare le proprietà genetiche di un secondo ceppo. La purificazione del principio trasformante dimostrò che si trattava di acido deossiribonucleico.

Il concetto di transfezione (corrispettivo della trasformazione batterica) è stato testato anche nelle cellule eucariote: io fornisco un frammento di DNA a delle cellule, queste lo assumono e lo fanno loro, diventa quindi parte del loro genoma. Questo verrà duplicato. Se, per esempio, una cellula è priva del gene TK non può produrre timidina chinasi e muoiono in assenza di timidina. Se lo aggiungo, mediante transfezione, alcune cellule assumono il gene TK. I discendenti di questa cellula si impilano a formare una colonia, perché anche in assenza di timidina (manca nel terreno) la riescono a sintetizzare.

Il nucleotide, unità funzionale del DNA e dell’RNA, è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero pentoso (ribosio o deossiribosio) a cui si lega una base azotata. Di queste, A e G sono purine mentre C, T (solo DNA) e U (solo RNA) sono pirimidine. Il DNA è formato da due filamenti con orientamento opposto. Lo zucchero si lega grazie ai C5 e C3 ai fosfati (precedenti e successivi nel polinucleotide) mediante legami fosfodiesteri. Le basi dei due filamenti sono rivolte all’interno ed instaurano legami H (sono tanti, quindi stabilizzano la struttura, ma sono deboli, facili da staccare per permettere la duplicazione del DNA, che avviene sempre in direzione 5’→ 3’). G instaura 3 legami H con C mentre A ne instaura 2 con T. Il numero di pirimidine e di purine, più precisamente di A-T e C-G è sempre lo stesso: queste sono basi complementari e, secondo la regola di Chargaff, di A e T vi sarà lo stesso numero (così come per C e G).

Nel DNA B destrorso ogni 34 Å la doppia elica fa un giro completo; ogni base dista 3,4 Å da quella adiacente (ogni 10 nucleotidi l’elica fa un giro). Lo spessore della doppia elica, ovvero il suo diametro, è pari a 20 Å. Ogni coppia è sfasata rispetto a quella successiva di 36°. Nell’impilare le basi si formano due solchi, un solco maggiore (di 22 Å) e uno minore (12 Å). L’ossatura di zuccheri-Pi forma una sottospecie di guaina esterna, carica negativamente. Le proteine interagiscono con il DNA, che neutralizzano la carica negativa del DNA stesso.

Superavvolgimento

La doppia elica di DNA può avvolgersi su se stessa e cambiare la sua conformazione globale, o topologia, nello spazio. Il DNA può essere lineare o circolare. Per essere impaccato in un volume molto più piccolo di quello che occuperebbe se fosse sciolto, il DNA viene superavvolto. Questo comporta dei cambiamenti topologici.

• Se viene superavvolto in senso orario (quindi nello stesso senso dell’avvolgimento della doppia elica) avremo un certo tipo di stress, stiamo cercando di avvitarlo su se stesso, sono superavvolgimenti positivi: compattiamo localmente la doppia elica in modo tale che la rotazione completa dell’elica non avvenga dopo 34Å ma prima (ci sono più coppie di basi per giro).
• Se viene superavvolto in senso antiorario (senso opposto) l’effetto sarà l’opposto (ci sono meno coppie di basi per giro).

Di solito nella cellula troviamo DNA con superavvolgimento negativo o sottoavvolgimento, perché è più facile aprirlo e lavorarci. L’effetto di questo superavvolgimento è di generare una regione in cui i due filamenti sono separati. Il superavvolgimento avviene solo in molecole di DNA chiuse, senza estremità libere (questo avviene nelle molecole circolari). Una soluzione al superavvolgimento è l’effettuare un taglio, detto “nick”, transitorio e poi riformazione dei legami, che ci permettono di rilasciare un giro del superavvolgimento.

Replicazione

La struttura del DNA porta tutta l’informazione necessaria per perpetuare la propria sequenza. La sua replicazione è semiconservativa: il doppio filamento viene aperto (forcella di replicazione) e ciascuno fungerà da filamento stampo. Avviene ad opera di enzimi. L’enzima DNA polimerasi resta saldamente legato allo stampo per aumentare l’efficienza di funzionamento senza commettere errori. Fare troppi errori significa determinare mutazioni. L’RNA polimerasi, per esempio, deve rimanere attaccato al DNA dall’inizio alla fine, non può dissociarsi e riattaccarsi perché altrimenti vengono commessi errori. Più l’enzima è processivo, più la replicazione sarà fedele.

Le endonucleasi partecipano al turnover degli acidi nucleici, degradando quelli vecchi o danneggiati e sostituendoli. Queste riconoscono ed operano dei tagli su 1 o 2 filamenti in qualsiasi punto della doppia elica, sia del DNA che dell’RNA. Sono generalmente randomizzate. Due esempi sono la DNasi e la RNasi. Le esonucleasi sono delle nucleasi che attaccano una estremità del filamento e lo mangiucchiano nucleotide per nucleotide. Ognuna ha la sua direzionalità; alcune sono processive (tendenzialmente), altre randomizzate. Sono sempre le DNasi e le RNasi.

Dogma centrale della biologia

DNA → RNA → polipeptide (doppio filamento di nucleotidi) (singolo filamento di nucleotidi) (sequenza di aminoacidi)

Trascrizione → Traduzione

Trascrizione inversa ← RNA

Il genoma può essere a singola o doppia elica di DNA o di RNA. (RNA che interagisce con altro RNA con basi complementari) o intra-molecolare (interagisce con se stesso) dell’RNA influenza più o meno la sua trascrizione. L’appaiamento o blocca la traduzione di un dato gene oppure ne favorisce l’espressione: altera quindi l’espressione (favorita o sfavorita) e la struttura. Come separo i due filamenti? Tramite un processo detto denaturazione, che prevede che la molecola “finita” (se fosse infinita ci sarebbero altri problemi) sia portata ad ebollizione. Con l’innalzamento della temperatura ottengo due filamenti di DNA a singolo filamento. Lasciando il campione raffreddare, avviene la rinaturazione, ovvero i due filamenti si riappaiano. Questo lo posso fare tutte le volte che mi pare.

Come faccio a capire se l’ho denaturato? Tramite l’assorbimento. Ogni nucleotide ha un suo spettro di assorbimento specifico e lo spettro del DNA è la loro media. Il DNA è trasparente nel visibile ma se andiamo nella lunghezza d’onda dell’infrarosso (a partire dai 320 nm) possiamo misurare l’assorbanza. L’assorbanza ha un picco a circa 260 nm, seguito da un abbassamento tra 220 e 230 nm. Una soluzione di DNA nativo, ovvero a doppio filamento, ad una concentrazione di 0,04 mg/ml ha un’assorbanza (o densità ottica, OD) di circa 1 a 260 nm.

• L’assorbanza del DNA a doppio filamento fino ad 80° resta più o meno la stessa, poi sale rapidamente e raggiunge un valore massimo. Il punto di mezzo (a metà del rapido aumento della curva sigmoidale) è la temperatura di melting: temperatura alla quale la metà della popolazione delle mie molecole è completamente denaturata e l’altra metà non lo è ancora completamente. Aumentandola anche di poco la temperatura oltre questo valore, rapidamente procede la denaturazione.
• L’assorbanza del DNA a singolo filamento ha un andamento lineare (anche in questo caso ho assorbanza nelle ordinate e temperature nelle ascisse). Inizialmente ha formato una struttura intermolecolare, poi con l’aumentare della temperatura si disgrega e l’assorbanza aumenta linearmente fino a raggiungere un valore massimo.

Se voglio sapere se un gene è espresso oppure no posso sfruttare la tecnica dell’ibridazione, che consiste nel misurare la quantità di filamenti appaiati che si forma dopo l’aggiunta di acidi nucleici a singolo filamento. Denaturo il mio DNA e lo immergo nel filtro di nitrocellulosa (blocca DNA a singolo filamento, RNA a singolo filamento e proteine), poi denaturo il DNA marcato radioattivamente e mischio il “dischetto” di nitro e il DNA radioattivo. Il contatto delle basi con la nitrocellulosa formano legami e non si possono più spostare. Identifico il DNA complementare poiché è quello legato al filtro. Non c’è bisogno che siano completamente complementari per ibridare: se sono simili si forma un duplex imperfetto.

Geni e proteine

Genoma → cromosoma → gene

Il genoma è formato dall’insieme di tutti i cromosomi. Il cromosoma è una molecola molto lunga di DNA e contiene molti geni. Ciascun gene fa parte di una sequenza continua di DNA ed è un’unità indipendente di espressione. Ha un inizio e una fine ed è l’unità funzionale dell’ereditarietà: può codificare per dell’RNA o per delle proteine. Una sequenza codificante viene letta a gruppi di 3 nucleotidi (codoni), ciascuno dei quali rappresenta un aminoacido. Il codice genetico assegna il significato dell’aminoacido al codone. Il codone è dunque una tripletta di nucleotidi organizzati sul mRNA che codifica per un aminoacido. Quindi, la relazione fra una sequenza di DNA e la sequenza del polipeptide corrispondente è definita codice genetico. Il codice si legge sequenzialmente (senza interruzioni e sovrapposizione di nucleotidi, quindi ogni nucleotide fa parte di un solo codone) e il polipeptide che si ottiene è in direzione N-t C-t.

Il gene è in grado di fornire tutta l’informazione necessaria per specificare una catena polipeptidica attiva. Le proteine di una cellula svolgono le attività catalitiche e strutturali che sono responsabili del suo fenotipo. Il DNA contiene, oltre alle sequenze codificanti, anche sequenze di controllo che sono riconosciute da molecole (di solito proteine) regolatrici. Insieme, sequenze codificanti e di controllo, costituiscono l’informazione genetica.

Per essere certi che un codone trascriva una proteina procedo con la sperimentazione. Con la sostituzione di un nucleotide, si altererebbe soltanto il codone in questione, gli altri rimarrebbero invariati. Se mutagenizzassimo (inserzione o delezione di basi) un codone, questo muterebbe, così come quelli successivi. La mutazione in questione prende il nome di mutazione frameshift. Queste mutazioni sono indotte dalle acridine: si legano al DNA e distorcono la struttura, provocando l’aggiunta o l’omissione di basi durante la replicazione.

La combinazione di doppi mutanti con due aggiunte o due omissioni di basi continuano a presentare fenotipo mutante mentre la combinazione di un’aggiunta e un’omissione di base si sopprimono a vicenda (una fa da soppressore all’altra mutazione). Quando si costruiscono tripli mutanti, solo le combinazioni di 3 aggiunte o 3 delezioni mostrano il fenotipo normale, le altre restano mutanti: questo ci fa capire che il codice genetico è letto a triplette.

Cornici di lettura

Consideriamo questa sequenza di basi... A C G - A C G - A C G - A C G - A C G Ci sono solo 3 possibili cornici o fasi di lettura (consistono nei modi possibili di tradurre una sequenza in proteina secondo il punto di partenza):

• Parto con la prima base: ACG ACG ACG ACG ACG
• Parto con la seconda: CGA CGA CGA CGA CG
• Parto con la terza: GAC GAC GAC GAC G

Se partissi con la quarta riotterrei il primo caso (ACG ACG ACG ACG). ORF o cornice di lettura aperta è una cornice di lettura che consiste esclusivamente di triplette codificanti per aminoacidi. La sequenza presenta un codone di inizio (AUG) e termina con uno di terminazione (UAA, UGA, UAG). La regione di codifica aperta è solo una e corrisponde ad una sola delle fasi di lettura. La regione corrisponde a quella più ampia compresa tra un codone d’inizio e uno di stop. A monte della sequenza di inizio possono esservi sequenze di un promotore o giunzioni di splicing degli introni. La cornice di lettura chiusa o bloccata è una sequenza che non può avere la funzione di codificare un polipeptide per via della presenza di frequenti codoni di stop. Si può analizzare ogni possibile cornice di lettura per determinare se è aperta o se è chiusa. Di solito, soltanto una delle 3 possibili cornici di lettura è aperta in ogni singolo tratto di DNA.

Geni batterici

Nei batteri c’è una corrispondenza lineare tra il gene codificato nel DNA e la sequenza della proteina: i geni batterici sono colineari con i loro prodotti. Gene e prodotto sono colieari se la sequenza dei nucleotidi del gene corrisponde esattamente alla sequenza degli aminoacidi del polipeptide. Ciascun gene di virus e batteri è un tratto di DNA con una lunghezza pari a 3x il numero degli aminoacidi del polipeptide: a 3 nucleotidi corrisponde 1 aminoacido. Nella maggior parte dei casi c’è una corrispondenza tra la sequenza amminoacidica e la frequenza di ricombinazione: ad una mutazione nel DNA corrisponde una mutazione nella medesima posizione nella proteina. In alcune regioni (hot spots di ricombinazione) la frequenza con cui avviene ricombinazione è maggiore.

Con l’espressione del gene in proteina, il DNA viene utilizzato per sintetizzare l’mRNA. I 2 filamenti di DNA sono detti uno codificante o senso (l’mRNA è uguale a questo filamento) e stampo o antisenso (l’mRNA è complementare a questo filamento). L’enzima che trascrive RNA è l’enzima RNA polimerasi. Questo utilizza un filamento di DNA come stampo, prende nucleotidi dall’ambiente e sintetizza così una sequenza complementare di RNA. L’RNA ha quindi la stessa sequenza del filamento codificante del DNA ed è complementare al filamento stampo. Il processo per cui l’informazione di un gene è usata per sintetizzare un RNA o un polipeptide si chiama espressione genica: la prima fase è la trascrizione (DNA → RNA) mentre la seconda è la traduzione (RNA → proteina) mediata da rRNA e tRNA.

Il gene comprende l’intera sequenza rappresentata nell’mRNA (vi sono sequenze regolatrici a monte e a valle che non vengono tradotte) mentre la proteina definisce la regione codificante dell’RNA. Quest’ultimo, ad una estremità (la 5’) presenta un “leader” o 5’ UTR e all’altra (la 3’) una “coda” o 3’ UTR che non vengono trascritti (UTR ovvero “untrascritted region”). Se viene mutato il leader, il ribosoma non sa più a cosa legarsi perché non riconosce più la sequenza.

• Nei batteri, non essendoci compartimentazione, trascrizione e traduzione sono accoppiati e avvengono nella stessa regione. L’RNA polimerasi si lega al DNA e comincia la trascrizione; l’RNA prodotto viene subito tradotto dai ribosomi che si attaccano all’estremità 5’.
• Nei sistemi eucarioti si ha trascrizione nel nucleo e traduzione nel citoplasma. Per i geni più semplici, il trascritto è già l’mRNA. Per quelli più complessi, il pre-RNA va incontro a maturazione e splicing prima di uscire dal nucleo. Gli introni vengono trascritti ma poi eliminati tramite splicing. Questo è un processo mediante il quale gli introni, regioni che non portano informazioni relative ai prodotti proteici, vengono tagliate via.

Le proteine agiscono in trans mentre i siti nel DNA agiscono in cis. Una tappa cruciale nel percorso che ha portato alla definizione di gene è stata la comprensione che tutte le parti di un gene devono essere presenti su un tratto continuo del DNA. I siti che si trovano nello stesso DNA sono detti in cis, mentre i siti localizzati su due molecole diverse sono detti in trans. Quindi due mutazioni possono essere in cis o in trans. Il test di complementazione usa questo concetto per determinare se due mutazioni sono nello stesso gene.

Il sito di controllo è contiguo alla regione codificante. A questo si lega una proteina regolatrice perché possa avvenire la produzione di RNA.

• Se la mutazione colpisce il sito di controllo, la proteina regolatrice non vi si lega, quindi non vedo quel dato fenotipo perché non abbiamo la produzione di RNA. Se vi sono due alleli di cui uno con sito di controllo mutato, uno produrrà RNA, l’altro non riesce per via della mutazione.
• Se la mutazione colpisce la proteina regolatrice, questa non si legherà a nessun sito di controllo. Non avremo nessuna sintesi di RNA, da parte di nessuno dei due ipotetici alleli.

Se una mutazione è trans-agente, deve esercitare i propri effetti attraverso un qualche prodotto diffusibile (per esempio manca la proteina regolatrice), il quale agisce su numerosi bersagli all’interno della cellula. Se una mutazione è cis-agente, deve influenzare direttamente le proprietà del DNA contiguo (sito di controllo), il che significa che non è espresso sotto forma di RNA o di proteina. Influenza soltanto la regione codificante a cui è connessa, ovvero non influenza la capacità dell’allele omologo di essere espresso.

Geni interrotti

Le sequenze di DNA che costituiscono un gene interrotto sono di due tipi: