Appunti integrati di biologia molecolare

Gli acidi nucleici

La biologia molecolare nasce nel 1952 con lo scatto fotografico di Rosalind Franklin alla struttura del DNA, di quell’evento.

Prima si sapeva solo cosa fossero gli acidi nucleici e i vari componenti:

• 1869, Johan Miescher, riesce a isolare gli acidi nucleici, definendo la nucleina.
• Determinano l’ereditarietà.
• 1902, Sutton, ipotizza che i cromosomi. Precedentemente, si sapevano le caratteristiche dei componenti (gruppi fosfato, pirimidine, ecc.).
• 1943, Avery, mischiando ceppi di batteri virulenti e non, capisce che è il DNA a portare l’informazione genetica.
• 1949, regole Chargaff, intuisce composizione del DNA.
• 1952, foto Franklin, struttura a elica con basi associate.
• 1953, Watson e Crick, ipotizzano α elica e successivi studi a riguardo.

La storia del DNA e RNA

I primi esperimenti sugli acidi nucleici rivelarono due tipi di molecole: il DNA più stabile e resistente agli acidi e l’RNA. DNA e RNA venivano trovati insieme nelle cellule procariotiche ed eucariotiche, mentre nei virus era trovato solo uno dei due. Nel 1928 Frederick Griffith osservò che un ceppo non contagioso di Streptococcus pneumoniae si trasformava in virulento se mescolato con un lisato inattivato dal calore del ceppo virulento. Nel 1943 Avery osservò che era il DNA la sostanza trasformante.

Nel RNA/DNA vengono distinte due conformazioni del nucleoside: Syn e Anti, entrambi possono avere modificazioni come l’aggiunta di gruppi fosfato. Nella formazione del polimero il legame fosfodiesterico si forma tra il carbonio alfa e il C3 della base successiva: si forma una lunga catena che rappresenta la struttura primaria del RNA/DNA. Le catene di DNA e RNA risultanti contengono sequenze specifiche di A, C, G, T, U e mostrano una direzione intrinseca con una estremità della catena dove il primo nucleotide presenta un ossidrile libero (OH) al carbonio in posizione 3 dello zucchero (Estremità 3’) e all’altra estremità l’ultimo nucleotide presenta un gruppo fosforico (PO4) al carbonio in posizione 5 dello zucchero (Estremità 5’).

Importante è l’appaiamento delle basi CG, TA o UA, per ragioni stechiometriche si avrà che CG formano 3 ponti a H mentre TA solo 2; da ciò deriva il fatto che il dimero CG sia più stabile e più forte energeticamente rispetto alla coppia TA.

Date due catene di RNA/DNA orientate in direzione opposte (antiparallele), se dotate della sequenza complementare si possono associare stabilmente grazie all’accoppiamento tra le basi: le due catene si dispongono secondo una struttura (denominata secondaria) ad elica. La conformazione delle catene dipende inoltre dalla quantità di sali associati e dal grado di idratazione; l’assenza di doppi e tripli legami tra i nucleotidi, permette la formazione di 3 tipi diversi di conformazione della struttura a doppia elica:

• A, ambiente ricco di acqua.
• α elica biologica, B, forma stabile. Ha uno spessore di 2 nm, una distanza tra due basi di 0.34 nm e un giro di elica corrisponde a 10 basi cioè a circa 3.4 nm.
• Z, forma disidratata, è inaccessibile ad ogni enzima, in soluzione alcolica rimane quindi intatta.

Struttura e topologia del DNA

Oltre alla struttura primaria (sequenza nucleotidica covalente), le catene di RNA/DNA si possono organizzare in strutture secondarie (struttura tridimensionale stabile) e in strutture terziarie (macrostrutture come il cromosoma metafasico, ripiegate).

La struttura secondaria tridimensionale degli acidi nucleici discende dalle proprietà chimiche dei nucleotidi: le basi pirimidiniche e puriniche sono molecole coniugate quindi planari o quasi planari (purine), idrofobiche e scarsamente solubili in acqua a pH neutro e sono appaiabili secondo l’orientamento A-T e C-G stabilizzato dai legami idrogeno specifici. Due filamenti di DNA (single stranded DNA-ssDNA) dalla sequenza complementare a temperature e concentrazioni di sali (forza ionica) opportune, tendono quindi ad appaiarsi in maniera antiparallela che consente di massimizzare la formazione di legami idrogeno fra le basi. Appaiati in direzione antiparallela i due filamenti assumono la configurazione dalla minima energia libera che in soluzione acquosa e con la forza ionica opportuna è la struttura della doppia elica (double stranded DNA helix-dsDNA) destrorsa (osservando dal 5’ al 3’ i filamenti si avvolgono in senso orario).

Sulla doppia elica si distinguono un solco (groove) maggiore e un solco minore molto importanti per le interazioni con le proteine.

La transizione della forma A e B è dovuta al differente ripiegamento dell’anello furanosico del ribosio: quattro dei cinque atomi dell’anello sono coplanari, mentre un quinto (C2 o C3) è sfasato: se il C2 o il C3 si dispone dallo stesso lato di C5 la conformazione è endo (forma B), se è dal lato opposto è eso (forma A).

La flessibilità dell’elica si deve alla rotazione intorno a 7 legami per monomero:

• χ del legame glicosidico tra la base e lo zucchero.
• γ del legame C4-C5 dello zucchero.
• δ del legame C4-C3 dello zucchero.
• α e β del ponte fosfodiesterico al C 5’ dello zucchero.
• ε e ζ del ponte fosfodiesterico al C 3’ dello zucchero.

Le basi appaiate non sono perfettamente complanari ma ruotate leggermente l’una rispetto l’altra. Questo permette di aumentare l’impilamento delle basi (stacking) lungo un filamento.

L’elica B si può curvare senza alterazioni della struttura locale consentendo al DNA di assumere forme circolari e di avvolgersi in strutture terziarie. Il DNA può anche formare dei ripiegamenti bruschi dovuti a specifiche sequenze di basi come AAAA o dal legame ad una proteina.

Il DNA può denaturarsi ad esempio aumentando la temperatura, così facendo le molecole di acqua si scontrano violentemente tra loro separando il doppio filamento: la temperatura alla quale la doppia elica si separa nei due filamenti si definisce melting temperature (Tm). Raffreddando lentamente la soluzione dei singoli filamenti, al raggiungimento della annealing temperature (Ta), i filamenti complementari si riassociano e si riformano le doppie eliche. L’assorbanza a 260 nm del DNA a singolo filamento è maggiore di quella del DNA a doppia elica.

La topologia del DNA è lo studio di come si modifica la catena (una figura) quando ne viene deformata la struttura senza alterarne l’integrità. Quando una molecola di DNA è fissata alle estremità o è richiusa su sé stessa (DNA circolare), si può avere un superavvolgimento. Si definisce linking number (Lk) il numero di volte in cui un filamento si avvolge su di un altro: è una proprietà che rimane costante e può essere un numero intero positivo o negativo a seconda dell’orientamento delle sovrapposizioni. Si definisce twist number il numero complessivo di volte in cui un filamento ruota intorno ad un altro più il numero di superavvolgimenti.

Replicazione del DNA

Il legame fosfo-estere è un legame chimico estere molto forte, che si forma tra un gruppo fosfato ed un ossidrile nucleofilo in cui viene eliminata una molecola di acqua. La reazione avviene con l’attacco del gruppo ossidrile (3’) sul fosforo α (5’) di un nucleotide trifosfato. La reazione è esoergonica e avviene abbastanza spontaneamente grazie alla dissoluzione del pirofosfato in monofosfato (per riavere il pirofosfato servirebbe molta più energia). La polimerizzazione degli acidi nucleici è energicamente favorita e avviene solo all’estremità 3’: al 5’ non può avvenire perché vi è un solo fosfato.

La replicazione del DNA avviene secondo un modello semi-conservativo e ciò è stato scoperto da Meselson e Stahl nel 1957: fecero un esperimento con E. Coli marcati con ¹⁵N (marcava proteine/DNA) e poi centrifugarono i campioni su gradiente di cesio, cioè con centrifughe ad altissima velocità dove il Cs sedimentava con il campione avente la stessa densità (replicazione in 20 minuti).

La polimerizzazione dei nucleotidi a 37°C avverrebbe troppo lentamente, vuol dire che vi sono enzimi nel processo (α); diverse e sono responsabili dell’aggiunta, 1956 Kornberg scoprì la DNA-polimerasi esse sono grazie a un consumo di energia, di un nucleotide alla volta sulla catena di DNA in crescita. Le polimerasi aggiungono nucleotidi a un filamento già esistente (primer) che presenta quindi legami fosfodiesterici. Gli elementi necessari per la replicazione sono:

• DNA stampo (template).
• dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
• Primer.
• DNA polimerasi.

L’intero processo inizia da un punto ben preciso detto origine di replicazione, possono esserci più punti d’origine che lavorano quindi in simultanea.

Nel 1963 vennero svolti studi sulla replicazione sui fattori sessuali (plasmidi) dei batteri (E. coli). Per spiegare la regolazione dell’origine di replicazione del DNA dei fattori trasmissibili dei batteri, si pensava che l’origine di replicazione fosse associata alla membrana cellulare. Esperimenti di genetica permisero di identificare il modello del replicone (cioè l’intera regione di DNA replicata a partire da una singola origine di replicazione), esso è formato da:

• Il replicatore è definito come l’intero set di sequenze di DNA in grado di dirigere l’inizio della replicazione.
• L'iniziatore è una proteina che riconosce in modo specifico un elemento del DNA sul replicatore e attiva l'inizio della replicazione.

Oggi sappiamo che la replicazione a cerchio rotante del plasmide fattore F avviene a seguito della rottura di un singolo filamento nel sito ori T e polimerizzazione di un filamento nella cellula parentale e dell’altro filamento nella cellula figlia.

Negli eucarioti:

• Sono presenti molteplici origini di replicazione bidirezionali.
• La sequenza delle origini di replicazioni negli eucarioti superiori non è stata identificata.
• DNA extra-cromosomico si replica con bassa efficienza anche quando contiene regioni che agirebbero da origine di replicazione.
• La replicazione inizia in differenti siti contenuti in regioni estese oltre le 10 kbp.

Un modello alternativo a quello del replicone è stato proposto per le cellule di mammifero per cui la sintesi di DNA inizierebbe in modo casuale all’interno di regioni estese.

Questo meccanismo riflette la mancanza di specificità di legame del complesso iniziatore delle cellule di mammifero denominato ORC (origin recognition complex) che non mostra alcuna preferenza di legame per specifiche sequenze di DNA.

Le DNA polimerasi, il replisoma e i suoi componenti

La replicazione può essere divisa in tre parti: inizio, allungamento e termine.

La prima fase inizia dall’origine di replicazione (replicatore) in cui vengono riconosciute le sequenze da specifiche proteine (iniziatrici) dette ORC (origin recognition complex) le quali riescono a reclutare altre proteine formando l’intero complesso per la replicazione. Nei procarioti, il DNA-A si avvolge come un groviglio andando a facilitare una prima apertura della catena: il DNA-B (elicasi) si associa a regioni ricche in AT, successivamente il DNA-A viene rimosso garantendo quindi il legame tra il filamento e le polimerasi.

Negli eucarioti, il complesso ORC è formato da 6 proteine che si legano al DNA su più punti richiamando altre proteine (CDT1 e MCM, fattori prodotti nel ciclo cellualare) costituendo quindi il pre-replication complex (PreRC). Questo complesso, dopo fosforilazione da parte delle chinasi attivate durante la fase S del ciclo cellulare, insieme al legame con la DNA polimerasi costituisce il pre-initiation complex (PreIC) competente per la replicazione.

A questo punto interviene un enzima specifico, l’elicasi, che, grazie all’ATP, riesce a rompere i legami a H tra i nucleotidi separando pertanto i filamenti di DNA. Inoltre, il consumo di ATP favorisce una rotazione di 120° dell’elicasi e quindi anche del suo sito attivo, favorendo l’apertura e la separazione della doppia elica.

In questo processo intervengono anche le proteine SSB (single strand binding protein) che stabilizzano i filamenti appena dissociati. Ad elica aperta, intervengono le primasi, enzimi che vanno a sintetizzare un filamento di RNA complementare a un filamento: il primer serve per l’attività delle polimerasi che allungano il filamento legando un nucleotide trifosfato per volta ad un’estremità 3’ di un filamento preesistente (primer).

- Alcune caratteristiche dell'attività della primasi, come la tendenza ad iniziare con una base purinica e a sintetizzare primer di RNA di 5-10 nucleotidi, sembrano essere universali. Tuttavia, primasi procariotiche ed eucariotiche differiscono radicalmente nell'organizzazione strutturale e nel meccanismo di sintesi dell'innesco (primer). La primasi batterica è un singolo polipeptide, nelle cellule eucariotiche la primasi è un eterodimero di subunità catalitica o piccola (PriS) e subunità regolatrice o grande (PriL). Inoltre, nelle cellule eucariotiche la primasi è normalmente associata in uno specifico complesso costitutivo con DNA polimerasi A (Pol α) e sua subunità B. -In particolare, negli eucarioti le primasi (subunità p58 e subunità p49) si associano insieme alla polimerasi α nel complesso DNA Polymerase α/ Primase Complex, vero responsabile dell’inizio della sintesi del DNA.

L’azione del complesso DNA pol α/primasi termina abbastanza rapidamente e viene sostituito dall’attività pol δ della DNA che subentra (polymerase switch) e inizia la fase di allungamento del filamento. Il fattore di replicazione C lega il filamento ibrido RNA-DNA provocando il distacco del complesso DNA pol α/primasi. Quindi, la DNA polimerasi δ, veicolata dalla proteina clamp PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), si lega e continua la sintesi. La DNA pol α/primasi è l’unica polimerasi in grado d’iniziare la sintesi di una catena di DNA, tuttavia non possiede attività “proofreading” (la capacità di rimuovere nucleotidi erroneamente incorporati). Al contrario, la DNA pol-δ è in grado di riconoscere i nucleotidi erroneamente introdotti e di rimuoverli.

L’aggiunta del nucleotide al 3’ sul filamento, segue i passaggi:

• Il processo inizia con il legame dell’enzima DNA pol-α con il primer appaiato sul DNA stampo: si forma il complesso enzima-DNA.
• Il corretto nucleotide (dNTP) accede al sito della reazione.
• In presenza di cationi bivalenti (Mg²⁺) viene promossa la formazione del complesso ternario pol-DNA-dNTP.
• Il legame del dNTP induce un primo cambiamento conformazionale dell’enzima del complesso ternario.
• Il legame fosfodiestere viene formato tra il fosfato-α del dNTP in entrata e il 3'-OH del terminale del filamento da estendere (DNAn + 1) liberando pirofosfato (PPi) e uno ione H⁺.
• Ne segue un secondo cambiamento conformazionale dell'enzima.
• Ciò consente il rilascio finale del gruppo in uscita PPi.
• Un nuovo ciclo di incorporazione di un nucleotide si ripete fino a quando l'enzima si dissocia dal DNA (sintesi processiva).

Esistono diversi tipi di DNA-pol a seconda sia della funzionalità sia del dominio di appartenenza: nei procarioti le DNA pol sono raggruppate in 3 famiglie (I- polA, II-polB, III-polC) che si distinguono per grandezza, funzionalità, velocità di reazione, gli eucarioti invece presentano solo le prime due famiglie.

Durante la fase di allungamento, le polimerasi aggiungono nucleotidi all’estremità 3’ del primer. Si distinguono due filamenti: il filamento che ha l’estremità 3' libera in corrispondenza della forcella presenta una sintesi continua (leading strand), mentre l’altro filamento (lagging strand) procede in modo discontinuo e a ritroso, operando su segmenti relativamente corti di DNA a singolo filamento. Questi segmenti di DNA che vengono sintetizzati sono detti frammenti di Okazaki; il primer tra un segmento e l’altro viene rimossi da una specifica polimerasi che riempirà poi lo spazio (nei batteri svolto dalle polB), successivamente i frammenti vengono uniti dall’enzima ligasi (catalizza il legame fosfodiesterico terminale).

Per il filamento del lagging strand è stato proposto il modello flapping: la pol-δ urtando contro il primer RNA/DNA riesce a scansarlo lasciando pertanto uno spazio vuoto che viene riempito da polimerasi specifiche (per i batteri polB). Quindi, la pol-δ continuerebbe ad allungare il filamento di Okazaki che stava sintetizzando fino a raggiungere la nuova estremità 5’ del frammento di Okazaki adiacente, privata della sequenza primer a RNA dall’azione di determinati enzimi. A questo punto i due frammenti di Okazaki possono essere legati fra loro grazie all’enzima DNA ligasi.

Si definisce replisoma l’intero complesso proteico responsabile della sintesi del DNA, esso è costituito da:

• Elicasi, svolge elica.
• SSB, aiuta a mantenere aperta l’elica evitando formazione di grovigli.
• Primasi, sintetizza RNA primer.
• DNA Polimerasi, grazie al primer sintetizza nucleotidi complementari.
• Proteine clamp, insieme di proteine α+β che mantengono le polimerasi agganciate al filamento di DNA; le proteine sono assemblate in un multimero ad anello (toroidale) che circondacom