Appunti biochimica, primo semestre

Biochimica I semestre

La biochimica è lo studio della chimica dei processi da cui dipende la vita. Un essere vivente è caratterizzato da complessità chimica organizzativa, specializzazione funzionale, estrazione, trasformazione e uso di energia, adattamento all’ambiente, capacità di riprodursi, cambiare nel tempo per evoluzione graduale. C, N, O e H sono il 90-99% in peso. Rappresentano la maggior parte delle molecole aa, glucidi, lipidi, ioni inorganici come Ca, P, K, S, Cl, Mg, Na, Fe → 1-10% in peso.

Polimeri e legami

Per ogni polimero il primo livello da considerare è la sequenza lineare delle unità monomeriche (glucosio, aa, nucleotidi) che si assemblano sempre con legami covalenti. È determinante per definire la struttura tridimensionale e funzionale, ma non è sufficiente. La struttura tridimensionale è determinata dalle interazioni deboli. La funzione di una macromolecola è associata alla sua struttura.

I legami covalenti hanno energia di rottura molto alta. I legami deboli sono forze di van der Waals, legami idrogeno, legami ionici, interazioni idrofobiche. Hanno energia di rottura bassa, la rottura è reversibile, la possibilità di rompere e riformare questi legami è alla base della flessibilità e dinamicità di tutte le macromolecole. Il legame idrogeno è un legame che sfrutta la polarità delle molecole di H₂O con altre molecole, H interagisce meglio con P, O, N.

Acqua come solvente

H₂O è il solvente principale (tranne le membrane tutto il resto è ambiente acquoso), ha un ruolo attivo nei processi biochimici sia in quanto reattivo sia in quanto la maggior parte dei processi avviene in ambiente acquoso. La forma biomolecole/strutture spesso dipende dalle proprietà dell’acqua che le circonda → effetto idrofobico: una molecola idrofobica ha scarsissima capacità di interagire con H₂O. Se viene spostata in acqua, le molecole di acqua si dispongono in modo da esporre O dal lato dove c’è la molecola idrofoba, l’ossigeno interagisce meglio con la componente idrofobica → struttura a clatrato, è una struttura molto ordinata che limita i gradi di libertà della molecola idrofobica. Per la molecola idrofobica, escludere le molecole di acqua permette di diminuire la superficie di contatto, ovvero aumentano i gradi di libertà della molecola di acqua → favorita a livello entropico. Una reazione può procedere spontaneamente solo se la sua energia libera è negativa, l’energia libera è negativa se l’entropia aumenta.

Proteine

Le proteine sono polimeri di 20 (L-aa) e hanno varie funzioni:

• Catalisi (enzimi)
• Difesa (es. anticorpi)
• Trasporto (es. emoglobina)
• Movimento (es. miosina)
• Deposito (es. ferritina)
• Controllo e regolazione (es. ormoni)
• Supporto strutturale (es. collagene)

Struttura e funzione cambiano e dipendono da R (caratteristiche chimiche). I 20 R variano per dimensioni, carica, capacità di formare legami H, idrofobicità e reattività chimica. La sequenza di aa determina la forma finale e quindi la funzione.

Punto isoelettrico e indice idropatico

Il punto isoelettrico è il punto in cui si forma lo zwitterione dell’aa. A pH neutro esistono in forma di ioni dipolari (zwitterioni), hanno il gruppo amminico protonato (-NH₄⁺) e il gruppo carbossilico deprotonato (-COO^-), la forma dipolare permane fino a pH 9,5. L’indice idropatico è il grado di idrofobicità, alto negli aa con residuo apolare. Nelle proteine la leucina è l’aa più presente.

Strutture secondarie

Le strutture secondarie delle proteine sono elica e foglietto, sono dovute ai legami H tra gruppo carbonile e amminico. Nella α-elica (legame tra NH e CO) il passo è 3,6 aa della sequenza primaria. Contano la polarità degli aa, i gruppi R, ingombro sterico di aa, pro (anello rigido, no rotazioni tra C e N) e gly (residuo piccolo e strutture convolute) ed interazioni tra N terminale e C terminale. Nel foglietto β gli aa possono trovarsi anche lontano, le dimensioni di R devono essere simili per permettere appaiamento ordinato.

Struttura quaternaria

La struttura quaternaria è l’assemblaggio di due strutture terziarie. L’associazione permette un’attività coordinata degli enzimi diminuendo i gradi di libertà di scambio dei substrati degli intermedi delle diverse reazioni che sono intermedi del processo globale che non abbandonano la struttura proteica se non alla fine del processo → diverse attività coordinate. Permette inoltre un’attività che ha un elevato grado di cooperatività quando le unità che costituiscono la struttura quaternaria svolgono la stessa funzione. Per esempio, l’emoglobina ha una struttura quaternaria e l’attività che si svolge a livello di una subunità dell’emoglobina si ripercuote in modo positivo sulle altre tre subunità e permette un comportamento cooperativo della struttura proteica rispetto alla funzione che svolge. Il legame di un substrato (ossigeno per l’emoglobina) condiziona l’affinità dello stesso substrato per le altre subunità aumentandola → cooperatività (potenzia l’attività rispetto a proteine separate).

Proteine fibrose

Le proteine fibrose hanno struttura terziaria che si sviluppa in una sola dimensione, determinano resistenza, forma e protezione della cellula. Sono scarsamente solubili, asimmetriche, con una composizione semplice in aa. Non ci sono proteine fibrose che abbiano una ripetizione di singoli aa in maniera continua. L’α-cheratina ha variabilità maggiore, ma al 37% è composta dagli stessi aa. Ogni cheratina fa un’α-elica, due di queste si super avvolgono in una doppia elica (la cisteina forma ponti S che deviano la forma della proteina; quando cambio forma ai capelli, manipolo i ponti S). La doppia elica è determinata dai residui di aa apolari presenti nel 40%. La fibroina è composta al 90% da tre aa, di cui due hanno struttura molto simile (serina e alanina), la struttura a foglietto prevale.

Collagene

La struttura del collagene è l’elica lasca ed è tipica ed esclusiva del collagene. È una delle proteine più presenti nel nostro organismo, è fondamentale del connettivo, fino a un terzo della massa proteica è rappresentata dal collagene (diversi tipi → famiglia di proteine). I vari tipi di collagene differiscono in capacità e funzioni, la principale funzione del collagene è strutturale e può essere connessa a maggiore resistenza o elasticità. Le diverse tipologie hanno diversa composizione di aa e modificazione post traduzionale. È fondamentale in tendini, cartilagine e pelle.

La struttura generale del collagene è rappresentata da una tripla elica, formata da tre catene superavvolte e ciascuna catena è un’elica lasca; è molto lontana dall’α-elica, ha un passo maggiore dato dagli aa e una sequenza di aa estremamente ripetuta. La sequenza di aa è una tripletta (gly-x-y); il primo è sempre gly, gli altri due sono variabili, ma generalmente la x è prolina e la y è idrossiprolina (derivato della prolina con una modifica post traduzionale) o l’idrossilisina. La presenza di gly permette che le tre eliche lasche possano superavvolgere perché ha minor ingombro sterico e garantisce un certo grado di idrofobicità → gly è l’aa obbligato della tripletta. Le tre gly delle tre catene sono sfalsate per garantire la capacità a livello del punto di contatto delle tre catene di generare una rete di legami di idrogeno con le proline degli altri filamenti.

I tre filamenti si assemblano nel tropocollagene (unità fondamentale del collagene), le tre catene sono classificate come α1, α2, α3, sono tre diversi polipeptidi. Ogni tropocollagene è allineato in modo sfalsato a ciascun piano, l’appaiamento è sfalsato di 40 nm e ha una periodicità con un passo di 60 nm. L’orientamento delle diverse fibre di collagene è caratteristico per ciascun ambito in cui il collagene agisce (es. nella cornea è completamente allineato).

Il collagene si trova nella MEC e deve essere rilasciato, ha una ridotta solubilità, ma quando si trova nel citoplasma deve essere solubile. Durante la sintesi proteica interviene un meccanismo di modificazione degli aa, vengono introdotti gruppi OH (idrossilazione) in prolina e lisina (idrossiprolina e idrossilisina, hanno sequenze apposite). L’idrossilazione è una reazione di ossidazione ed è vitamina C dipendente (acido ascorbico e anche Fe dipendente), il grado di idrossilazione è funzionale alla funzione del collagene. Una volta finita la sintesi c’è la possibilità di modificare per glicosilazione degli aa, le diverse unità monosaccaridiche sono associate solo all’idrossilisina. Tutto ciò avviene a livello citoplasmatico, le tre catene superavvolgono a livello citoplasmatico e devono mantenere la solubilità→ porzioni globulari alle estremità, in ambiente extracellulare vengono rimosse le porzioni globulari per poter assemblare in collagene.

In ambiente extracellulare, viene ulteriormente modificata e si formano legami crociati tra le diverse catene, i legami possono essere in numero variabile: maggior numero di legami, maggior resistenza del collagene ma minore dell’elasticità (l’aumento dei legami crociati è un fenomeno associato all’invecchiamento). I legami crociati derivano da modificazioni a carico della lisina che può essere ossidata convertendosi nell’aldeide corrispondente, a livello del carbossi il gruppo metilenico diventa gruppo aldeidico (ossidazione con contemporanea perdita del gruppo amminico) → allisina. L’allisina può essere un centro di reattività (gruppo aldeidico molto reattivo) e può reagire con una lisina, può determinare la condensazione di due allisine (condensazione aldolica). La quota di legami crociati può variare (una quota è sempre fissa) per fenomeni di ossidazione → stress ossidativo (legato all'invecchiamento). La sequenza di aa è cruciale per stabilire la funzione o la disfunzione della proteina.

Elementi che mutati possono generare una situazione patologica

• Osteogenesi imperfetta: mutazione di una singola glicina, distorsione elica e fragilità ossea
• Scorbuto: carenza vitamina C → ridotta idrossilazione, lesioni cutanee e fragilità vasale, forma pochi legami crociati

Proteine globulari

Le proteine globulari svolgono molte funzioni, sono simmetriche nello spazio, la maggiore simmetria ne determina la solubilità. Non è identificabile con un elemento di struttura secondaria prevalente, ci sono varie strutture secondarie o supersecondarie, ovvero strutture formate da segmenti specifici di struttura secondaria. Queste strutture sono stratificate sulla base della caratteristica chimica degli R dei diversi segmenti, gli R sono responsabili della possibilità di interagire con altri fattori.

Gli aa idrofobici si trovano all’interno, quelli idrofili stanno fuori per interagire con l’acqua, nella struttura primaria gli aa idrofili e idrofobi non sono in sequenze discrete ma sono sparsi → il ripiegamento della proteina determina la vicinanza degli aa (nelle proteine di membrana è al contrario).

Le strutture tridimensionali possono essere stabilizzate intrinsecamente (come nella mioglobina) oppure possono avere bisogno di un supporto. La capacità di stabilizzare una proteina è direttamente proporzionale al peso della proteina o alla presenza di eliche. La mioglobina ha sette eliche α determinati nella formazione della tasca che contiene il gruppo eme, che è legato solo con legami idrogeno. Osservando un’altra eme proteina come il citocromo C, che è più piccolo in dimensioni e ha un contenuto in elica α più basso (4), ha comunque una struttura stabile, ma il legame col gruppo eme contribuisce alla stabilizzazione della struttura perché è un legame covalente → ha bisogno del cofattore come elemento di stabilizzazione della sua conformazione (come lisozima e ribonucleasi, che hanno poche eliche α e hanno bisogno di legami e ponti disolfuro tra ligando e proteina).

Elische α e foglietti β possono essere utilizzati per dare la logica di definizione di elementi all’interno di una proteina globulare caratterizzati dal punto di vista funzionale e strutturale. Si trova analogia strutturale in proteine appartenenti alla stessa famiglia (stessi aa), oppure alla stessa superfamiglia se hanno una caratteristica strutturale comune pur avendo sequenze amminoacidiche diverse → somiglianza in struttura e funzione, principio alla base del concetto di dominio proteico. Ad esempio, la struttura a barile serve per il trasporto non selettivo.

Il dominio è quella parte della proteina che anche separata dalla proteina con taglio proteolitico mantiene la funzione, ha stabilità strutturale intrinseca, la sua struttura è di per sé sufficiente per sviluppare la funzione. L’identificazione di domini è importante per la comprensione dell’attività di molte proteine coinvolte nel signaling cellulare. Un certo dominio che svolge una funzione in una proteina la svolge anche in un’altra appartenente alla stessa famiglia o superfamiglia, domini uguali su proteine diverse possono concorrere a funzioni diverse.

Per esempio, prendendo tre enzimi coinvolti nei meccanismi di trasmissione del segnale: sono enzimi idrolitici, quindi hanno dominio catalitico simile, tutte e tre presentano un dominio PH, quindi tutte le proteine lavorano sulla base della presenza di quel dominio e sull’interazione che genera con una molecola non proteica. Se aggiungo altri domini su una proteina, questi mi modificano la funzione della proteina → il meccanismo di azione delle diverse proteine è diverso in base alla presenza di altri domini.

Proteine intrinsecamente disordinate

Le proteine intrinsecamente disordinate sono proteine non strutturate o con segmenti non strutturati, hanno aa carichi e prolina → interrompono strutture molto ordinate, la prolina interrompe l’α-elica e il foglietto β, gli aa acidi interrompono la possibilità di fare porzioni di elementi di struttura secondaria. Esiste un punteggio che misura il grado di disordine delle varie proteine, per esempio P53 ha una regione con un punteggio basso (ordinata), all’N e al carbossi terminale si trovano regioni con punteggio elevato (disordinate). Il disordine garantisce la possibilità di riorganizzazione e di assunzione di una conformazione che può essere complementare a diversi target diversi fra loro; la regione disordinata assume ordine solo in seguito al legame del ligando.

Ripiegamento delle proteine

Quando estraggo una proteina dal suo ambiente la trovo nella forma nativa che è la forma attiva della proteina. La denaturazione di una proteina è basata sulla rottura dei legami deboli che definiscono la struttura tridimensionale. La denaturazione della proteina non tocca la sequenza amminoacidica, non rompe legami covalenti, denaturando ottengo una proteina simile alla struttura primaria (lineare). Quando rimuovo l’agente denaturante, la proteina riassume la sua struttura e riprende la sua funzione riformando i legami in breve tempo.

Considerando la proteina in forma estesa e pensando quante rotazioni deve fare l’aa per trovare il suo assetto, teoricamente ci vuole troppo tempo. Ad esempio, un polipeptide di 100 aa ha 10¹⁰⁰ strutture, usando come tempo minimo per la rotazione 10^-13 s, per trovare la conformazione ci vogliono 10⁷⁷ anni → paradosso di Levinthal: il ripiegamento non è casuale ma è energeticamente guidato. In vitro per la rinaturazione della proteina ci vogliono al massimo minuti, quindi per spiegare questo paradosso si utilizza il concetto di selezione cumulativa: quando un aa si trova orientato nel modo giusto, questo non si muove più e rimane fissato perché raggiunge un minimo di energia → ho un meccanismo casuale che quando impatta nella posizione giusta questa posizione è fissata.

Nel ripiegamento in vivo, il ripiegamento avviene nell’ordine dei secondi. Questo avviene quando dalla struttura primaria a livello del ribosoma passo alla struttura funzionale. Questo processo è basato su un fenomeno di nucleazione che dura millisecondi (anche detto definizione delle strutture secondarie locali nel globulo fuso), ovvero si formano strutture secondarie locali che costituiscono il punto di partenza nel processo di rinaturazione → modello di nucleazione-condensazione, tutti gli aa idrofobici tendono ad escludere l'acqua e si stabilizzano in una struttura a globulo fuso che ha una compattezza di aa idrofobici all’interno. Questo assetto di strutture secondarie può avere consolidamento che può essere o spontaneo o assistito. Gli elementi che assistono il ripiegamento della proteina (consolidamento e riarrangiamento nella forma definitiva) sono le disolfuro isomerasi e heat shock proteins (chaperonine).

Disolfuro isomerasi

Lavorano sulla formazione di legami covalenti che possono essere modificati a seconda della presenza di partner nel legame covalente (ponte disolfuro). Prendendo una proteina nella sua forma non definitiva che presenta due ponti disolfuro nella posizione errata, i due gruppi SH presenti sulla disolfuro isomerasi (enzima) avranno un’affinità maggiore verso uno dei gruppi SH presenti nei ponti disolfuro. Quando l’enzima si lega, cambia la conformazione della proteina aprendola e lascia un gruppo SH libero sulla proteina. L’SH libero ha una maggiore affinità per l’altro ponte, quindi si lega e lascia libero l’altro SH che ha affinità per un altro SH del primo ponte legato alla disolfuro isomerasi, quindi spiazza l’enzima e permette la formazione dei ponti disolfuro della proteina nativa.

Chaperoni molecolari

Oltre alle disolfuro isomerasi, esistono altre proteine coinvolte nel raggiungimento della struttura nativa della proteina e sono i chaperoni molecolari e il complesso delle chaperonine. Entrambi sono meccanismi che facil...