Appunti di preparazione all'esame di Biochimica

Appunti - biochimica mod. 1

Lezione 1 - Mer 28/09/2022 - Slide 1 - Introduzione

La biochimica è la chimica che studia i sistemi biologici viventi, è basata sui principi chimici, energetici e cinetici:

Aspetti chimici

Gli organismi viventi sono sistemi confinati, il loro contenuto di molecole e ioni differisce per natura chimica e concentrazione da quelli presenti nell’ambiente che lo circonda. Tutti gli organismi viventi hanno gli stessi tipi di unità monomeriche, tra questi vi sono modelli comuni nelle macromolecole biologiche. Le molecole presenti in un organismo vengono continuamente rinnovate. La costanza della composizione di un organismo è il risultato di uno stato stazionario dinamico.

Aspetti energetici

I sistemi viventi sono sistemi ordinati, lontani dall’equilibrio con l’ambiente circostante. Gli organismi viventi sono sistemi aperti che scambiano materia ed energia con l’ambiente circostante. Gli organismi viventi creano e conservano la loro struttura complessa e ordinata a spese dell’energia derivata dall’ambiente. La produzione di energia avviene attraverso reazioni red-ox. I sistemi viventi accoppiano reazioni chimiche o fotochimiche spontanee a processi non spontanei attraverso passaggi intermedi chimici, che servono ad incanalare energia libera verso la produzione di lavoro. I sistemi viventi sono in grado di inter-convertire diverse forme di energia:

• Chimica (catabolismo e anabolismo);
• Elettrica (trasmissione nervosa);
• Termica (omeostasi termica);
• Meccanica (movimento);
• Luminosa (visione e fotosintesi);
• Informazionale (organizzare materiale biologico).

La variazione dell’energia libera di Gibbs è uno strumento utile per stabilire la spontaneità di una reazione. Il ΔG è la variazione energetica di un sistema chiuso nel passaggio dallo stato iniziale a quello finale:

• ΔG < 0 reazione spontanea (esoergonica)
• ΔG > 0 reazione non spontanea (endoergonica)
• ΔG = 0 stato di equilibrio

Il valore del ΔG dipende dalle concentrazioni iniziali e dal parametro ΔG° a sua volta correlato alla K_eq

ΔG = Δ H - T * Δ S

H = entalpia, calore scambiato con l’ambiente S = entropia, stato di disordine

È importante ricordare che mantenere l’ordine costa energia in quanto il sistema in natura tende al disordine.

Aspetti cinetici

Nonostante la reazione sia spontanea non significa anche che sia rapida. Ci sono delle costanti, ovvero delle cellule che operano a temperatura e pressione costante. Negli organismi viventi le reazioni chimiche vengono catalizzate da enzimi. Le reazioni chimiche sono organizzate in reazioni consecutive chiamate vie metaboliche. Lo stato stazionario dinamico non potrebbe essere mantenuto in assenza di regolazioni.

Lezione 1 - Mer 28/09/2022 - Slide 2 - Le proteine

Le proteine sono composte da sequenze di amminoacidi, i quali hanno medesima struttura chimica: un carbonio centrale chirale Ca (carbonio alfa, o carbonio in alfa), il quale lega 4 sostituenti diversi, gruppo carbossilico COOH + Gruppo amminico NH₂ + Idrogeno H + Gruppo laterale R (identifica l’AA). I carboni di una molecola organica sono numerati usando le lettere dell’alfabeto greco, la posizione alfa corrisponde al secondo carbonio della catena. Il carbonio centrale dell’amminoacido si trova in posizione alfa rispetto al primo carbonio della catena, infatti il primo carbonio della catena è carbonio carbossilico.

Per ogni amminoacido abbiamo due configurazioni: enantiomeri (D) o stereoisomeri (L). Nelle proteine sono presenti quasi sempre gli amminoacidi della serie L.

Proprietà chimiche

Quando siamo a pH 7, NH₂ essendo una base debole, nella forma protonata acquista un H⁺ e diventa NH₃⁺. Il carbossile COOH, invece, nella forma dissociata perde un H⁺ diventando COO^-. In questo stato di pH, gli amminoacidi sono definiti zwitterioni, cioè ioni dipolari senza carica netta. Bisogna tenere conto anche della possibile presenza di gruppi ionizzabili nella catena laterale R.

Gli amminoacidi standard

Gli amminoacidi standard sono codificati dal codice genetico e vengono usati per fare sintesi proteica durante la fase di traduzione. Sono 20, le loro proprietà chimiche derivano dalle proprietà chimiche del gruppo -R.

Classificazione

Abbiamo delle classificazioni di vario tipo:

• Natura chimica del gruppo R;
• Per proprietà di carica;
• Abbreviazione 3 lettere e una lettera per tutti gli amminoacidi standard;

Amminoacidi alifatici

Gruppo R alifatico CH, hanno una catena laterale non polare. Glicina (Gly): H come gruppo R, è l’amminoacido con minore ingombro sterico. Ha una flessibilità di struttura molto alta se inserita in una proteina ed è l’unico amminoacido non chirale; Alanina (Ala): come gruppo -R; Valina (Val); Leucina (Leu); Isoleucina (Ile): spesso proposte come integratori alimentari.

Amminoacidi con gruppo R contenenti zolfo (S) o gruppi ossidrilici

Serina (Ser) e Treonina (Thr): hanno un gruppo ossidrilico (alcolico) nella catena laterale. I gruppi alcolici possono venire utilizzati per legare all’amminoacido e alla proteina molecole di natura diversa come fosfati e zuccheri; Cisteina (Cys): ha un gruppo solfidrilico (tiolico, gruppo –SH). Il gruppo tiolico permette formazione di ponti disolfuro, legame covalente che stabilizza le proteine; Metionina (Met): S legato a due C, legame ponte di solfuro. Mediante ossidazione, 2 gruppi tiolici appartenenti a due cisteine possono legarsi covalentemente formando ponte disolfuro. Contribuire a stabilizzare struttura terziaria e quaternaria delle proteine. Reazione contraria necessita riduzione.

Amminoacido ciclico

Prolina (Pro): è l’unico amminoacido ciclico. La catena laterale R legata al gruppo amminico, forma una struttura eterociclica. Il gruppo amminico è un’ammina secondaria, legato a 2C. La sua struttura ciclica costituisce un vincolo per ripiegamento di una proteina.

Amminoacidi aromatici

Contengono anelli aromatici nel loro gruppo R. Gli anelli aromatici assorbono luce nell’UV (ultravioletto) (280nm), questa caratteristica è sfruttata in molte tecniche sperimentali. Fenilalanina (Phe); Tirosina (Tyr): Gruppo –OH fenolico; Triptofano (Trp).

Amminoacidi basici

Hanno un gruppo R ionizzabile. Può protonarsi acquisendo carica netta positiva. Il gruppo R è caratterizzato dalla presenza di gruppi chimici contenenti azoto. Lisina (Lys) e Arginina (Arg): a pH 7 cariche positivamente, (pK_{R Arg} = 12.5; pK_{R Lys} = 10.5); Istidina (His): a pH 7 ha un gruppo R parzialmente protonato, (pK_{R His} = 6).

Amminoacidi acidi e loro ammidi

Acido aspartico (Asp) e Acido glutammico (Glu): sono amminoacidi acidi che hanno un gruppo carbossilico nella catena laterale. Questo può dissociarsi acquisendo carica netta negativa. A pH 7 dissociati COO^- (pK_{R Asp} = 3.8; pK_{R Glu} = 4.3); Asparagina (Asp) e Glutammina (Gln): sono le ammidi corrispondenti. Il gruppo ammidico non è ionizzabile e polare.

Classificazione per proprietà di carica

Gli amminoacidi con carica netta possono interagire con l’acqua e fare legami elettrostatici con amminoacidi di carica opposta:

• Positiva Lys (K), Arg (R) e His(H) hanno una carica netta positiva sul gruppo R.
• Negativa Asp(D) e Glu(E) hanno una carica netta negativa sul gruppo R.

Gli amminoacidi polari senza carica netta sono polari con cariche parziali, possono fare legami idrogeno:

• Ser(S), Thr(T) e Tyr(Y) che hanno un gruppo –OH;
• Asn(N) e Gln(Q) che hanno un gruppo ammidico: Cys(C) che ha il gruppo –SH.

Gli amminoacidi non polari idrofobici non possono interagire con l’acqua, infatti sono importanti per la formazione di interazioni idrofobiche:

• Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M), Gly(G)

Carica e pH

La carica di un amminoacido dipende dal pH della soluzione in cui si trova. Per ogni gruppo ionizzabile presente vale regola generale:

• pH > pK gruppo funzionale è prevalentemente in forma dissociata;
• pH < pK gruppo funzionale è prevalentemente in forma protonata;
• pH = pK forma protonata e forma dissociata si equivalgono.

Titolazione

Un amminoacido può venire titolato, in questa situazione si comporta come un acido debole poliprotico.

Sintesi amminoacidi non standard

Durante la traduzione, in cui avviene la sintesi proteica, vengono utilizzati i 20 amminoacidi standard. Alcuni amminoacidi possono venire modificati dopo che la sintesi è avvenuta: modificazioni post-traduzionali, come ad esempio nel collagene si ritrovano l’idrossiprolina, che deriva dalla prolina, e l’idrossilisina, che deriva da lisina. La fosforilazione della serina è una modificazione utilizzata anche per regolare l’attività degli enzimi.

Amminoacidi come precursori

Da alcuni amminoacidi si derivano molecole fisiologicamente importanti:

• Ormoni: tiroxina (ghiandola tiroidea);
• Ammine pressorie: istammina (vasodilatatore rilasciato durante risposta allergica);
• Neurotrasmettitori: g-amminobutirrico da glutammato, dopamina da tirosina o da fenilalanina.

Lezione 2 - Gio 29/09/2022 - Slide 3 - Legame peptidico e struttura primaria

Legame peptidico

Il legame peptidico si forma tramite reazione di condensazione (endoergonica). Il gruppo ammidico (non ionizzabile) viene rotto tramite idrolisi (esoergonica, ma con elevata energia di attivazione). Essendo una catena orientata il carbonio carbossilico instaura un legame covalente con l’azoto amminico adiacente. I peptidi si suddividono in:

• Dipeptide: 2 amminoacidi
• Tripeptide: 3 amminoacidi
• Oligopeptide: più di tre ma non molti
• Polipeptide: molti

La struttura primaria

La struttura primaria è la sequenza amminoacidica della proteina. Si scrive da N- a C-terminale, nella direzione della sintesi proteica. Le posizioni vengono numerate da N- a C-terminale. Le unità amminoacidiche vengono definite residui.

Legame peptidico

Il legame peptidico è di tipo planare. Risonanza per parziale ridistribuzione delle due coppie di elettroni tra ossigeno carbonilico e azoto amminico. Parziale natura di doppio legame. Gli atomi che compongono il legame peptidico giacciono sullo stesso piano. Negli isomeri cis i carboni alfa sono dallo stesso lato legame peptidico; in quelli trans sono ai vertici opposti, la configurazione più stabile è quella trans. Questi atomi non si possono muovere l’uno rispetto all’altro a causa del vincolo di rigidità.

Hanno forma rettangolare, il legame peptidico è formato da 3 amminoacidi e 2 legami peptidici. I legami peptidici possono ruotare facendo perno sul carbonio alfa, attraverso il legame che lo unisce all’azoto amidico phi e a quello che lo lega al carbonio carbonilico psi. Grazie a questa rotazione si consente il ripiegamento delle proteine. La rotazione possibile non corrisponde a 180°, alcuni angoli sono impediti per ingombro sterico tra atomi della catena peptidica e delle catene laterali R. È impossibile la rotazione sull’asse del legame C-N (phi), in quanto bloccata dalla struttura ciclica dell’amminoacido (immino-acido), al contrario il legame che coinvolge il gruppo carbossilico può ruotare.

I gruppi alfa-carbossilici e alfa-amminici impegnati nel legame peptidico non sono ionizzabili, al contrario lo sono i gruppi funzionali delle catene laterali e del C-N terminale. Lo stato di dissociazione di ogni gruppo dipende dal pH del mezzo e dalla pK del gruppo stesso: pH alto, basico = cariche positive; pH basso, acido = carica negativa. Il punto isoelettrico (pI) è il pH nel quale la proteina (o peptide) ha carica netta nulla. Non significa che non è carico, ma che il numero di cariche positive e di cariche negative si equivalgono.

Macromolecole informazionali

La sequenza primaria deriva dalla sequenza del codice genetico. La sintesi inizia da N-terminale e procede verso il C-terminale. Mioglobina: Sequenza primaria della mioglobina, è la proteina che nelle cellule lega ossigeno. Circa il 20-30% delle proteine dell’uomo sono proteine polimorfiche, hanno sequenze variabili nella popolazione umana. La stessa proteina può cambiare da specie a specie, le differenze saranno minori tra specie animali filogeneticamente più vicine; al contrario, saranno differenze maggiori tra specie animali filogeneticamente lontane.

Residui e sostituzioni

• Residui invarianti: amminoacido indispensabile in quella posizione per la funzione biologica della proteina, sono identici nelle specie;
• Residui variabili: l’amminoacido può cambiare.

Sostituzioni conservative

Amminoacido sostituito da un altro che è chimicamente simile; indica che in quella posizione non serve quell’amminoacido specifico, ma quella tipologia;

Sostituzioni non conservative

Amminoacido con caratteristiche chimicamente diverse.

Modificazioni dei gruppi N- terminale o C- terminale

Gruppo amminico che può venire acetilato, questa azione è presente nel 50% dei casi nelle proteine eucariotiche. Il gruppo amminico cambia le sue proprietà di carica così da avere effetti nella proteina finita.

• La formilazione serve per l’inizio della sintesi batterica nei procarioti.
• La fosforilazione nei gruppi –OH funziona grazie al legame tra il calcio e le fosfoserine delle caseine.
• La glicosilazione nelle caseine lavora sui residui di Ser e Thr (legati in O) o sui residui di Asn (legati in N).

La sequenza tradotta, che viene codificata dal DNA, può non corrispondere alla struttura primaria della proteina funzionale. Il primo peptide sintetizzato è il più lungo della proteina. Sono presenti alcune sequenze di amminoacidi non utili nella proteina finita, ma il cui scopo è quello di permettere di arrivare alla proteina funzionante. Come ad esempio la sequenza di connessione, il tratto azzurro permette il corretto ripiegamento e formazione ponti di solfuro. La sequenza leader è utile per il trasporto della catena polipeptidica. Avviene una rimozione selettiva di peptidi, il segnale viene mandato all’N-terminale per la corretta localizzazione. Il processo di maturazione porta ad una proteina matura.

Molecole particolari di natura amminoacidica

Lezione 3 - Ven 30/09/2022 - Slide 4 - Struttura secondaria

Struttura secondaria

Il polipeptide lineare si organizza nello spazio in una struttura tridimensionale, grazie alle interazioni deboli, infatti la struttura è solo marginalmente stabile.

Motivazioni

Termodinamiche

• Entalpia: ripiegandosi massimizza il numero di legami intermolecolari;
• Entropia: in soluzione acquosa i residui idrofobici si organizzano per minimizzare la superficie di contatto con l’acqua.

Funzionali

La struttura è fondamentale per la corretta funzione biologica (regolazione, trasporto, meccanica, enzimi, ecc.). La necessità di compattare la struttura primaria, si traduce innanzitutto in organizzare localmente un segmento polipeptidico in strutture discrete (elementi di struttura secondaria), che serviranno poi come elementi di organizzazione di strutture di ordine superiore. La disposizione nello spazio degli atomi dello scheletro peptidico, dipende dai carboni alfa legati da un legame peptidico, non ai gruppi laterali; infatti le conformazioni delle catene laterali R non fanno parte della struttura secondaria. Tuttavia, il gruppo R può però influenzare la struttura secondaria, in quanto ha interazioni ripetitive dovute ai legami idrogeno che si formano tra i gruppi C=O (carbossilico) ed N-H (ammidico), ovvero gli stessi gruppi presenti all’interno dei legami peptidici. Le più comuni strutture secondarie sono alfa-elica e beta-foglietto.

Tipologie di strutture

Il vincolo di rigidità dato dal legame peptidico viene sempre rispettato. La catena peptidica si ripiega attorno al C alfa, sfruttando la rotazione attorno agli angoli phi e psi.

Alfa elica

Lo scheletro peptidico si organizza lungo una generatrice di un cilindro formando elica destrorsa. Legami idrogeno, ogni 4 residui (tra C=O e N-H). I gruppi polari hanno sempre carica netta perché si trovano nel legame peptidico e sono paralleli alla direttrice del cilindro dell’elica. I legami che stabilizzano questa struttura avvengono tra atomi facenti parte dello scheletro peptidico. C=O e N-H che prendono parte al legame idrogeno sono allineati garantendo la massima forza, e quindi stabilità, del legame. All’interno il gruppo è vuoto mentre all’esterno ci sono i gruppi R che sporgono. Ogni gruppo R potrà avere interazioni con il gruppo R distante 3/4 posizioni:

• Motivi di stabilità: l’amminoacido carico negativamente è distante 3 posizioni da uno carico positivamente, si forma una coppia ionica grazie a 2 amminoacidi idrofobici distanti da 3 residui che fanno interazioni idrofobiche tra di loro;
• Motivi di instabilità: Carbonio ramificato è un ingombro sterico. Carbonio è il carbonio del gruppo R direttamente legato al carbonio alfa (es VAL, ILE e THR), abbiamo in questo caso una repulsione di carica perché 2 cariche uguali tendono a respingersi quindi ad allontanarsi tra AA distanti di 3 posizioni. La Prolina è un amminoacido ciclico, la sua struttura non è compatibile con elica perché, il gruppo amminico non ha idrogeno, per cui non potrebbe formarsi.