Enzimologia alimentare - Appunti e domande riflessione

Enzimologia: aspetti termodinamici

Enzima -> Proteina dotata di proprietà catalitiche dovute alla sua specifica attivazione. Solo nel 1930 è stato scoperto che enzimi sono proteine. Non tutti, nei ribosomi, sono presenti molecole di RNA che contribuiscono alla catalisi (ribozimi).

Gli enzimi sono catalizzatori biologici (accelerano il raggiungimento dell'equilibrio di reazione) → non spostano l'equilibrio di reazione! Abbreviano il tempo con cui viene raggiunto l'equilibrio. Non fanno parte dell'equazione (non bisogna scriverlo) che descrive la reazione.

Quando si parla di reazione catalizzata da enzimi, i substrati vengono trasformati in prodotti secondo l'equazione: A + B = C + D. A e B sono i substrati dell'enzima e diventano C + D.

• La reazione è spontanea (procede da sinistra verso destra) se ΔG < 0 => Esoergonica.
• La reazione è all'equilibrio ΔG = 0.
• La reazione non è spontanea (sono favoriti i reagenti) se ΔG > 0 => Endoergonica.

Dove G è l'energia libera di Gibbs, parametro termodinamico che descrive lo stato energetico del sistema. ΔG è la variazione dell'energia libera di Gibbs = ΔH - TΔS. È dato dal livello energetico dello stato finale meno il livello energetico dello stato iniziale (G_f - G_i). Se i prodotti hanno un livello energetico inferiore a quello dei reagenti, la reazione avviene spontaneamente e si libererà energia. Se siamo al contrario, dobbiamo fornire energia affinché possa avvenire la trasformazione.

Spontaneità delle reazioni chimiche

In un sistema biologico, il ΔG' = ΔG°' + RT ln ([C][D]/[A][B]). ΔG' è la variazione dell'energia libera del sistema a pH 7, nel passaggio dalle concentrazioni iniziali all'equilibrio del sistema. ΔG°' è la variazione di energia libera in condizioni standard (tutti i prodotti e reagenti sono 1M, pH 7, 25°C, 1 atm) all'equilibrio del sistema.

All'equilibrio, il ΔG' = 0, quindi ΔG°' = -RT ln ([Ceq][Deq]/[Aeq][Beq]) = -RT ln K_eq. Il ΔG°' è correlato alla situazione di equilibrio del sistema. Una reazione che ha ΔG' negativo è spontanea, ma non implica che proceda ad alta velocità! Indica solo la sua tendenza a procedere verso destra (favorire i prodotti).

Es. Glucosio + 6O₂ → 6CO₂ + 6H₂O ΔG°' = -686 kcal/mole. Dal punto di vista termodinamico, il glucosio all'aria è instabile, ma la reazione non procede a velocità apprezzabili. Il glucosio è stabile in senso cinetico. Questa reazione spontaneamente tenderebbe ad avvenire, ma è talmente lenta che non è percepibile! La termodinamica esprime se un processo è spontaneo o meno, la cinetica si concentra su quanto veloce un processo avviene.

Aspetti cinetici

La velocità di una reazione è la quantità di prodotto formato per unità di tempo. La transizione energetica passa sempre per un punto intermedio che ha energia interna più alta dei prodotti e dei reagenti, chiamato “stato di transizione.” La differenza energetica tra lo stato iniziale e lo stato di transizione è chiamata energia di attivazione (E_reag - E_transizione), che permette di capire se la reazione sarà veloce o lenta.

I reagenti devono avere un'energia sufficiente per raggiungere lo stato di transizione e poi “cadere” a prodotti finali. L'energia di attivazione è una barriera energetica: tanto più alta è l'energia di barriera, tanto più lenta è la reazione, perché sarà statisticamente difficile che il reagente possa avere abbastanza energia per superarla. Gli enzimi intervengono qui: quando una reazione è catalizzata da enzimi, si abbassa l'energia di attivazione.

Specifica attivazione

Il substrato si attacca all'enzima e forma il complesso enzima-substrato ⇔ il substrato si modifica e diventa prodotto, abbiamo il complesso enzima-prodotto → poi l'enzima si stacca dal prodotto e otteniamo enzima libero e prodotto (l'enzima non si modifica).

E + S ⇔ ES ⇔ EP ⇔ E + P. L'energia di attivazione totale è elevata, ma l'energia di attivazione del complesso ES ed EP è molto più bassa. Questa riduzione di energia di attivazione si traduce in un aumento di velocità, si parla di proprietà di specifica attivazione. Il delta G della reazione non è stato modificato dall'enzima!

Selettività

• Gli enzimi hanno una grande selettività di azione.
• Specificità nei confronti del substrato (più o meno alta, es. esochinasi/glucochinasi, esochinasi catalizza sia il glucosio che altri composti).
• Specificità di reazione (catalizzano una reazione specifica).
• Stereospecificità (possono formare/legare solo uno specifico stereoisomero).

Sito attivo

Il legame del substrato e la sua trasformazione in prodotto avvengono nel sito attivo. Nel sito attivo, determinate catene laterali di amminoacidi interagiscono con il substrato.

Sito di legame con il substrato: binding locus. Sito dove avviene la catalisi: transforming locus. Es. chimotripsina (proteasi pancreatica idrolizza il legame peptidico adiacente ad amminoacidi idrofobici): c'è una piccola parte del sito attivo deputata a riconoscere gli amminoacidi idrofobici della proteina intera (binding locus), poi ci sono altri amminoacidi che catalizzano la reazione di idrolisi (transforming locus).

I tre amminoacidi coinvolti si trovano in posizioni molto lontane tra di loro nella struttura primaria, ma si trovano vicini in seguito ai ripiegamenti della struttura nativa. La tripsina (idrolizza amminoacidi basici) ha una diversa specificità. Hanno lo stesso transforming locus ma varia il binding locus.

Esiste una complementarietà tra enzima e substrato che permette di legare perfettamente uno specifico substrato con l'enzima.

Adattamento indotto

Quando avviene il legame tra enzima e substrato, c’è una modifica di conformazione di quest'ultimo. Questo cambiamento conformazionale è funzionale al corretto orientamento dei gruppi coinvolti nella catalisi.

Gruppi prostetici o coenzimi

Molti enzimi per funzionare necessitano di cofattori che possono essere:

• Di natura organica
• Di natura inorganica

I cofattori sono definiti:

• Gruppi prostetici se sono strettamente legati all'enzima, a volte il gruppo prostetico è legato in modo covalente all'enzima stesso (es. FAD).
• Coenzimi quando il cofattore non è strettamente legato all'enzima stesso (es. NAD).

Enzimi che utilizzano cofattori sono definiti:

• Oloenzimi: insieme della struttura funzionante con cofattore (enzima funzionante).
• Apoenzima: la sola struttura polipeptidica con cofattore dissociato (enzima non funzionante).

Alcune proteasi sono enzimi che funzionano legate a metalli (metallo-proteasi); il legame col metallo è necessario.

Classificazione

Gli enzimi spesso si chiamano con il nome della reazione che catalizzano/substrato; per evitare confusioni, è stata definita un'International Enzyme Commission che ha introdotto una classificazione basata su 4 numeri:

• Esochinasi E.C. 2.7.1.1

Primo numero: classe di reazione catalizzata

Secondo numero: sottoclasse

Terzo numero: sotto sottoclasse

Quarto numero: seriale dell'enzima nella sua sotto sottoclasse

• Classe tipo di reazione catalizzata
• 1 ossidoreduttasi reazioni di ossido-riduzione
• 2 transferasi trasferimenti di gruppi
• 3 idrolasi idrolisi di legami
• 4 liasi rottura non idrolitica di legami
• 5 isomerasi interconversione di isomeri
• 6 ligasi formazione legami utilizzando ATP

Altri aspetti termodinamici

Qualunque enzima non altera l'equilibrio della reazione; arriviamo sempre allo stesso punto finale della reazione indipendentemente dalle quantità di enzima che aggiungo. Cambia la velocità.

Per una generica reazione S ⇔ P, con costante di equilibrio K_eq = [P_eq]/[S_eq], possiamo definire una massima quantità di prodotto ottenibile [P_eq] = [S]*K_eq.

Ad esempio, se parto con 100 di substrato e so che se K_eq = 1, l'equazione si ferma quando [P_eq]/[S_eq] = 1. Dire che avrò [P_eq] = 50 e [S_eq] = 50.

Possiamo definire la resa di conversione come [P]/[S], cioè quanto prodotto si è formato rispetto al substrato.

La resa massima è quella che possiamo avere all'equilibrio. Si può calcolare conoscendo la costante di equilibrio.

Es. Glucosio -> Fruttosio

• Aldoso -> Chetoso

Il glucosio è più stabile in quanto può avere più conformazioni (sedia, barca) e perché l'angolo dei legami carbonio non stressa la struttura, come invece fa il fruttosio. Inoltre, il glucosio è tra quelli della sua forma più stabile perché ha gruppi OH equatoriali. In campo alimentare, il glucosio viene trasformato in fruttosio perché quest'ultimo è circa due volte e mezzo più dolce.

K_eq glucosio ⇔ fruttosio [F]/[G] = 0.64

La velocità di reazione varia al variare della concentrazione di substrato: man mano che il substrato diminuisce, la velocità di reazione diminuisce, perché al diminuire della velocità di reazione A → B, aumenta la velocità B → A. Maggiore è la concentrazione iniziale, maggiore la velocità.

A parità di concentrazione e condizione, la velocità è influenzata dalla costante di velocità. L'aumento di concentrazione di enzima influenza quindi la velocità. Per paragonare diverse reazioni si misura la velocità iniziale (misura della tangente alle curve cinetiche).

L'equilibrio della reazione è un parametro termodinamico. Per modificarlo possiamo intervenire su altri parametri, che influenzano la stabilità termodinamica di reagenti e prodotti o la loro concentrazione (T e pressione). Nonostante il nome, la costante di equilibrio non è costante e può variare in funzione dei parametri ambientali.

L'unico modo per modificare la resa “termodinamica” di una qualunque reazione è spostare l'equilibrio, per esempio sottraendo il prodotto alla miscela di reagenti. Questo equilibrio rimane tale anche con l'enzima, ma con esso varia la velocità di reazione.

Come posso migliorare la resa?

1. Vario le condizioni in modo da rendere più favorevole la conversione, per esempio la temperatura. Questo permette l’aumento della resa <10%. L'ulteriore raffreddamento della miscela porta al cambiamento dell'equilibrio. Per evitare questo, dobbiamo togliere l'enzima dalla soluzione prima di raffreddare.
2. Come posso avere resa totale di fruttosio? Uso una resina che cattura fruttosio, così possiamo toglierne e spostare nuovamente l'equilibrio.

Catalisi enzimatica

I saggi enzimatici servono per determinare la concentrazione di enzima presente nel sistema. Per quantificarlo bisogna trovare quanto velocemente procede la reazione; la velocità è direttamente proporzionale a quanto enzima è presente.

Aspetti cinetici

1. La velocità con la quale la reazione A→ B procede è data dalla concentrazione di prodotto nell'unità di tempo V = .
2. In una reazione in cui non ci sono enzimi la velocità è condizionata da:
   • Costante di velocità
   • Concentrazione dei reagenti

Per una reazione che segue una cinetica di primo ordine, la velocità è data da v=k[A]. La velocità dipende da quanto substrato è presente. Man mano che la reazione procede, il substrato diventa prodotto. Se col tempo il reagente diminuisce, la velocità diminuirà fino ad azzerarsi. La velocità in questo grafico è data dalla tangente della curva in un preciso punto. Stiamo guardando quanto velocemente si consuma il substrato, non quanto velocemente il prodotto si forma!

È uguale definire quanto velocemente si forma il prodotto o quanto velocemente si consuma il substrato.

V = = - . A parità di concentrazione iniziale di reagenti, la velocità è solo funzione della costante cinetica. La presenza di un enzima porta ad un aumento della costante di velocità (perché diminuisce l'energia di attivazione). Quando possibile, si misura la “velocità iniziale,” prima che ci siano variazioni apprezzabili dalla linearità (perché poi non è lineare l'andamento) e perché la concentrazione di substrato è quella di riferimento (poi il substrato varia). In altre parole, si cerca di ottenere la tangente alle curve cinetiche di cui ai tracciati precedenti.

Come misurare la velocità di una reazione enzimatica

Parametri da cui dipende la velocità:

• Concentrazione totale di enzima
• Concentrazione del substrato
• Temperatura, pH (in vitro), tutti gli enzimi hanno un ottimo di temperatura e di pH a parità di concentrazioni di substrato ed enzima. Se vario pH o temperatura vario la velocità di reazione.

L'attività enzimatica misurata mediante un saggio enzimatico ha un significato relativo; essa dipende ed è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima presente, ma dipende dalla concentrazione di substrato, dal pH e dalla temperatura, che vanno mantenuti costanti! L'attività di un enzima non ha nessun significato se non viene indicato in che condizioni è stata misurata.

L'attività enzimatica viene quantificata in Unità (UI): quantità di E che produce 1 micromole P/minuto. Per definizione 1 UI è la quantità in condizioni sperimentali definite e controllate in cui si sono formati 1 millimole/minuto. Quante UI? 10³ perché milli 10^-3 e micro 10^-6. Si formano 10³ micromoli/min (UI). Spesso il segnale misurabile non è espresso in quantità, ma in altri segnali (assorbanza). Si usano diversi metodi per osservare la velocità.

L'attività specifica di una preparazione enzimatica è misurata come UI presenti per ogni unità di massa, equivalendo al numero di UI/mg = micromoli P/ (min × mg), in base alla tecnica adottata per quantificare il prodotto formato.

• Spettrofotometrici/colorimetrici: il prodotto si quantifica con l'assorbanza.
• Fluorimetrici
• Calorimetrici: misurano il calore scambiato con l'ambiente durante una reazione, ed è proporzionale a quanti legami si rompono o si formano (velocità della reazione).
• Mediante pH-stat: si possono formare sostanze con nature acide/basiche e con la formazione della reazione cambia il pH.
• Cromatografici
• Elettroforetici
• Etc.

Modalità di misurazione delle velocità

È possibile fare delle misure delle velocità con due modalità:

• Misure continue: misure con cui posso valutare il tempo reale come varia la velocità in funzione del tempo.
  • Con substrati naturali o sintetici creati in laboratorio, che vanno a mimare il substrato naturale (hanno proprietà simili al substrato naturale) tanto che l'enzima può compiere la sua reazione anche sul substrato sintetico. In giallo c'è l'arginina, legato con un legame isopeptidico c’è la nitroanilina simile a quello delle proteine. La tripsina quindi è in grado di rompere questo legame e produrre la para-nitroalanina che presenta un colore giallo da sola. Studiando la presenza del giallo è possibile capire quanta BAPA è presente (la struttura intera).
  • Reazioni che alterano il pH: molte reazioni enzimatiche portano al rilascio di acidi o di basi (es. trigliceridi → acidi grassi e glicerolo), si può misurare la variazione di pH conseguente all’aggiunta dell’enzima. Il vantaggio di questa metodologia è che può essere utilizzata anche su sospensioni ricche in solidi o su emulsioni, dove non si possono utilizzare metodi spettrofotometrici (questi campioni sono opachi (latte) o torbidi, assorbanza non misurabile).

Assumendo di seguire una reazione che produce acidi, la velocità di reazione è proporzionale al decremento di pH nel tempo. Le moli del prodotto formato sono deducibili dall’aumento di pH (quantità nota di base forte NaOH). Uso titolatori automatici che permettono di mantenere costante il pH della reazione mediante l’aggiunta “misurata” di una base. La velocità con la quale viene aggiunta la base (micromoli/min, calcolabili conoscendo la concentrazione e il volume aggiunto nell’unità di tempo) costituisce una misura dell’attività enzimatica. L'aggiunta di base forte è fatta costantemente durante la reazione per mantenere costante il pH.

• Accoppiando più reazioni enzimatiche: Molte reazioni enzimatiche non portano alla formazione o alla scomparsa di composti facilmente rilevabili con comuni metodi analitici. In questo caso, si può ricorrere ad altri enzimi (e, se necessario, ai loro substrati), che trasformano i prodotti della reazione in composti misurabili, realizzando appunto l'idea di accoppiare una o più reazioni enzimatiche.

Es: Misura continua di attività di beta-galattosidasi. L’enzima beta-galattosidasi converte il lattosio in una miscela 1/1 di galattosio e glucosio, ed è utilizzato per la preparazione del latte de-lattosato. La reazione di idrolisi non produce materiale facilmente individuabile (non c'è assorbimetria misurabile).