Enzimologia

Enzimi

Un enzima è un catalizzatore di reazioni biologiche. Accelera il raggiungimento dell’equilibrio (concentrazioni relative di reagenti e prodotti non cambiano più nel tempo) di una reazione chimica (spontanea) senza spostarlo. Tutti gli enzimi sono proteine. I reagenti sui quali agisce l’enzima sono i substrati. Prima di trasformarsi in prodotto, le molecole di substrato passano per uno stato di transizione a maggiore contenuto energetico rispetto a quello iniziale.

La differenza tra il livello energetico dello stato di transizione e quello iniziale del substrato è detta energia di attivazione. L’enzima si lega al substrato (in stato di transizione) e il complesso enzima-substrato abbassa l’energia di attivazione. Il complesso è tenuto insieme da legami deboli, che liberano energia abbassando il contenuto energetico del complesso. L’enzima non fa avvenire una reazione non spontanea, ma accelera il raggiungimento dell’equilibrio. Un substrato si trasforma in prodotto perché generalmente questo ha livello energetico più basso. L’enzima diminuisce l’energia che devo dare alla molecola perché venga trasformata.

Il substrato si lega a livello del sito attivo, una tasca specifica per quel substrato, meccanismo chiave-serratura. L’enzima ha tre caratteristiche principali:

• Specificità: riconoscimento selettivo del proprio substrato, stereochimico (posizioni spaziali di atomi), di gruppo e di legame. La specificità dei legami dipende da quali amminoacidi sono presenti nel sito attivo e quali gruppi R possono formare legami deboli con il substrato.
• Saturabilità: massima quando tutti i siti attivi di tutti gli enzimi presenti sono saturati, legati al substrato, la velocità di catalisi è massima e non può aumentare ulteriormente.
• Inibibilità: una reazione può essere rallentata o bloccata se l’enzima viene inibito con una molecola molto simile al substrato o un eccesso di substrato.

Sito attivo e sito catalitico

Non sono sempre distinguibili. Nella formazione del sito attivo rientrano le R degli amminoacidi che si affacciano sulla tasca, queste riconoscono il substrato. Il sito catalitico può usare R di amminoacidi ma anche gruppi chimici diversi forniti da coenzimi e cofattori. (Per capire quali amminoacidi sono importanti nelle reazioni, creo una versione della proteina mutata dove sostituisco l’amminoacido). Alcuni enzimi svolgono la loro funzione se associati a cofattori o coenzimi.

Cofattori

Molecole (non amminoacidi) che si inseriscono nella proteina con legami forti. Ioni per mantenere la struttura della proteina/enzima o per il meccanismo di reazione se presenti nel sito attivo (Cu, Fe, Zn, Mg ecc). Gruppi prostetici sono invece cofattori che si associano in modo permanente alla proteina.

Coenzimi

Sono molecole organiche non proteiche. Sono essenziali per la funzione enzimatica e sono spesso derivati da vitamine. Se si associano in modo transitorio, sono co-substrati (NAD+; NADP+). NAD+ e NADP+ funzionano rispetto all’enzima come substrati, escono in forma ridotta o viceversa ossidati. Il FAD invece è già presente nel sito attivo e funziona quindi come gruppo prostetico, legato in modo covalente al sito attivo. Catalizzano tutte reazioni di ossidoriduzione.

La forma ossidata e quella ridotta del NAD hanno una importante differenza quando guardate lo spettrofotometro: strumento che manda luce a diversa lunghezza d’onda. Se io guardo il NAD+ dentro a uno spettrofotometro, vedo che il massimo spettro di assorbimento è a 260 nanometri. L’assorbimento in uno spettro fotonico è proporzionale alla quantità di molecole che bloccano la luce. Quando la molecola è ridotta (NADH) lo spettro è diverso. Picco di assorbimento a 260 e assorbe anche alla lunghezza di 340 nm. Se io in laboratorio voglio dosare l’attività di un enzima che usa NAD+ e che lo trasforma in NADH, volendo seguire la trasformazione, metto lo spettro a 340. A 260 non mi accorgo se NAD+ è rimasto tale o è diventato NADH perché entrambi assorbono a questo valore.

Utilizzate queste differenze di assorbimento tra NAD+ e NADH o NADP+ e NADPH per dosaggi enzimatici: se so che un certo enzima è causa di una malattia, lo doso per capire quanto tale enzima è presente nel sangue del mio paziente.

Classificazione enzimi

Gli enzimi sono denominati e classificati in base alle reazioni che catalizzano. Ci sono 6 classi divise in sottoclassi. Ad ogni enzima sono associate quattro cifre. Le sei classi:

• Ossidoriduttasi: catalizzano reazioni di ossidoriduzione (reversibili). La maggior parte sono deidrogenasi. Il substrato rid incontra il coenzima ox, si formano prodotto ox e coenzima rid. Esempio: lattato/lattico deidrogenasi, ultima tappa della glicolisi anaerobia. Lattato viene ossidato in piruvato, il NAD+ viene ridotto a NADH. (Se ossido un alcol II ottengo un chetone, da un alcol I un’aldeide, poi acido carbossilico e poi CO₂). Esempio: il succinato viene ossidato a fumarato, il FAD viene ridotto a FADH₂. Altre ossidoreduttasi sono deidrogenasi, ossidasi, ossigenasi, reduttasi e catalasi.
• Transferasi: catalizzano reazioni di trasferimento di gruppo. Molte richiedono la presenza di coenzimi. Esempio: le chinasi trasferiscono un P dall’ATP a una molecola accettrice, come la glicogeno fosforilasi chinasi, fosforila un enzima, modifica post-traduzionale. Sono reversibili o meno a seconda del delta G di idrolisi. Solitamente irreversibili, ci sono tante molecole che accettano P ma poche che sono in grado di donarlo ad ADP (solo 3 molecole che raggiungerebbero una forma più stabile donando P). Esempio: transaminasi, trasferiscono gruppi amminici.
• Idrolasi: catalizzano reazioni di idrolisi di legami, rottura di un legame per introduzione di una molecola d’acqua. Sono sempre reazioni irreversibili. Esempi: enzimi che scindono il legame peptidico. Esempio: fosfatasi, tramite inserimento di una molecola d’acqua scissione di esteri fosforici. Altri esempi: esterasi, fosfatasi, tiolasi, glicosidasi, peptidasi e proteasi.
• Liasi: eliminazione di gruppi per generare doppi legami. Catalizzano reazioni di rottura non idrolitica e non ossidativa. Sono reazioni reversibili, non richiedono mai consumo di energia. Esempi: Aldolasi, scissione del fruttosio 1,6 bifosfato in G3P e DHAP. Esempio: fumarasi, trasforma il fumarato, tramite aggiunta di acqua, in L-malato (non è una idrolasi perché la reazione è reversibile). Altri esempi sono decarbossilasi, aldolasi e sintasi.
• Isomerasi: catalizzano reazioni di isomerizzazione, sono reversibili. La reazione avviene da una parte o dall’altra in base all’equilibrio (da quale dei due isomeri sottraggo). Esempio: fosfoglucosio-isomerasi trasforma glucosio 6P in fruttosio 6P. Esempio: triosofosfato isomerasi catalizza DHAP in G3P.
• Ligasi: catalizzano la formazione di un legame tra due substrati. Richiedono energia e sono spesso irreversibili. Esempio: AcetilSCoA sintetasi, trasforma acetato in acetil-CoA. Legame tioestere tra SH e gruppo carbossilico.

Cinetica enzimatica

La velocità di una reazione come la formazione del prodotto nell’unità di tempo o come consumo di substrato nell’unità di tempo (con prodotto meno errore di misura). La velocità dipende da:

• Concentrazione del substrato (più c’è substrato, più velocità);
• Quantità di enzima (più enzimi, più velocità);
• Temperatura (il massimo della velocità si ha a 37-40°C);
• pH (ottimale quello fisiologico 7,38, eccezione pepsina che lavora a pH molto basso. Con valori estremi però gli enzimi si denaturano);
• Meccanismi di regolazione;
• Tempo (all’inizio retta, tempo e prodotti proporzionali, V0, quasi impossibile misurarla, lo strumento deve detectare abbastanza prodotto. La curva poi si piega, diminuisce il substrato. Curva dovuta all’ingombro di prodotto creato, che può rallentare l’enzima, occupando la tasca).

La cinetica enzimatica consente di ottenere informazioni sul meccanismo di azione degli enzimi e sull’efficienza catalitica di un enzima.

Dosaggio enzimatico

Il dosaggio di attività enzimatiche è usato a scopo diagnostico, per discriminare forme enzimatiche fisiologiche o patologiche e nella messa a punto dei dosaggi di substrati per via enzimatica. L’unità enzimatica U è la quantità di un enzima che trasforma 1 μmol di substrato in 1 min. Dosare la velocità degli enzimi può servire a scopo di ricerca per vedere se un enzima funziona meglio di un altro o per capire se un l’enzima mutato presente in una determinata malattia genetica funziona più o meno bene di quello nei pazienti sani; utilizzato anche per capire in quali situazioni certi enzimi lavorano di più o di meno per vedere se bisogna inibirli o attivarli per correggere la patologia. Un dosaggio enzimatico serve per dosare l’enzima o il substrato, per vedere quanto enzima c’è o quanto è bravo. Se l’incognita è l’efficienza o...