Enzimologia alimentare

Francesca Nasatti e l'enzimologia alimentare

Gli enzimi

Non è scontato che gli enzimi siano solo proteine: sono state identificate molecole di RNA con proprietà catalitiche che si trovano nel ribosoma e partecipano alla catalisi che avviene nella traduzione. Per differenziare queste molecole di RNA dagli enzimi proteici vengono chiamati ribozimi. Gli enzimi sono, invece, proteine con attività catalitica.

Spontaneità delle reazioni chimiche

All'equilibrio, la velocità con la quale i reagenti diventano prodotti è uguale a quella con cui i prodotti tornano ad essere reagenti: la reazione procede nei due versi con la stessa velocità. La variazione di energia libera rappresenta la differenza di stato energetico (energia libera) tra prodotti e reagenti. Se deltaG è negativo, i prodotti hanno un livello energetico più basso dei reagenti. I reagenti si trasformano in prodotti perché i sistemi tendono al minimo energetico.

Nei sistemi biologici si usa delta G' e deltaGzero' perché essi sono sistemi tamponati, in cui il pH è costante. Nelle reazioni in questi sistemi sono spesso coinvolti gli ioni H+ (è un reagente o un prodotto della reazione). Però, essendo un sistema tamponato, la concentrazione di H+ viene ritenuta costante e uguale a 7. Le concentrazioni di reagenti e prodotto sono relative alle condizioni iniziali. L'altezza dell'energia di attivazione determina la velocità della reazione.

Specificità dell'attivazione

Reazione spontanea. L'enzima si lega al substrato formando il complesso ES. Il substrato, mentre è legato all'enzima, diventa prodotto (EP). Il prodotto si dissocia dall'enzima. Ciascuno di questi step ha una energia di attivazione da superare affinché avvenga il processo. L'altezza complessiva delle energie di attivazione che si hanno in presenza dell'enzima è molto più bassa di quella che si avrebbe in assenza dell'enzima.

Il deltaG della reazione (la sua spontaneità, la termodinamica, la costante di equilibrio) non cambia con o senza l'enzima. Esso rende la reazione più veloce abbassando la sua energia di attivazione. Specificità di posizione di reazione: se in una reazione enzimatica si forma una molecola chirale, si forma solo uno dei due possibili isomeri.

Cofattori: gruppi prostetici o coenzimi. La costante di equilibrio varia con la temperatura. Il saggio enzimatico è una misura finalizzata a quantificare l'attività di un enzima.

Aspetti cinetici

La concentrazione del reagente non è costante nel tempo perché il reagente si trasforma in prodotto. La velocità cambia in funzione della concentrazione del reagente. Di solito si considera la concentrazione iniziale perché la conosciamo sicuramente (abbiamo messo noi il reagente nella provetta), non si è ancora formato prodotto. La velocità è data dalla pendenza della tangente alla curva stessa.

Si misura la velocità iniziale, prima che ci siano variazioni apprezzabili dalla linearità: inizialmente, il grafico della quantità di prodotto in funzione del tempo sembra una retta, perché all'inizio la velocità con la quale si forma il prodotto è praticamente costante (anche se sta diminuendo la concentrazione di substrato: non è rilevante perché siamo in eccesso di substrato). Si arriva poi ad un massimo in cui la concentrazione di prodotto non aumenta ulteriormente.

La formazione di prodotto nel tempo o la diminuzione di substrato nel tempo sono due grandezze correlate. Fare un saggio enzimatico significa misurare la velocità iniziale di una reazione in presenza di un enzima. Si misura l'attività enzimatica di un enzima.

Saggi calorimetrici

Le reazioni chimiche (in cui c'è una variazione di energia libera) sono esotermiche o endotermiche, cioè associato alla trasformazione substrato-prodotto c'è un flusso di calore dal sistema o verso il sistema. Mediante la calorimetria si può studiare questo flusso, che è proporzionale alla velocità di reazione.

Saggi mediante pH-stat: la variabile che si misura per monitorare la reazione è il pH, che varia, nel mezzo di reazione, in seguito alla formazione di prodotto o alla scomparsa di substrato. Due modi per poter eseguire i saggi enzimatici: mediante misure continue o discontinue.

Misure continue

La formazione del prodotto viene misurata in tempo reale. Con queste misure è facile misurare la velocità enzimatica perché basta guardare la tangente al punto iniziale della curva (come prima). I substrati naturali o sintetici usati in queste misure hanno una caratteristica: devono formare un prodotto che ha caratteristiche spettroscopiche diverse dal substrato di partenza.

Ciò significa che il prodotto assorbe la luce ad una lunghezza d'onda a cui il substrato non l'assorbe (il prodotto ha un colore differente dal substrato). Queste differenze di colore sono monitorabili attraverso uno spettrofotometro.

Esempio: substrato sintetico utilizzato per fare i saggi di attività su una proteasi, la tripsina (idrolizza il legame peptidico vicino agli aa basici). Si potrebbe quindi fare avvenire la reazione sul substrato naturale; però, sul substrato naturale non si può monitorare la reazione in continuo, perché quest'ultimo è una proteina che, dopo idrolisi, diventa un peptide, quindi ha le stesse caratteristiche spettroscopiche del substrato iniziale (con lo spettrofotometro non si noterebbe nessuna differenza).

Per sviare questo problema sono stati creati substrati sintetici specifici per queste proteasi. Essi sono creati in laboratorio. Uno di questi è il BAPA, che contiene l'arginina (aa basico). Legato all'arginina tramite un legame ammidico c'è la para-nitroanilide: la tripsina idrolizza questo legame. La p-nitroanilina, staccata dal substrato, è colorata di giallo perché assorbe la luce a 405 nm. Questo è utile perché permette di monitorare in modo continuo in uno spettrofotometro l'aumento di assorbanza dovuto alla formazione del prodotto.

Di questo prodotto si conosce il coefficiente di estinzione molare (tabulato), quindi dalla assorbanza si può risalire alla concentrazione del prodotto e poi all'unità di attività. Si divide l'aumento di assorbanza per il coefficiente di estinzione molare del prodotto (legge di Lambert-Beer) per conoscere la molarità del prodotto in cuvetta dopo un minuto. Per passare dalla molarità alle moli si moltiplica per il volume. Così si calcolano quante moli si formano in un minuto. Per passare a micromoli si moltiplica per un milione.

Per una serie di enzimi, l'attività enzimatica può venire misurata sfruttando la variazione di pH. Un titolatore automatico: nel bicchierino si mette la soluzione in analisi. Un elettrodo misura il pH. La velocità con la quale viene aggiunta la base nel bicchierino per mantenere costante il pH equivale alla velocità con la quale si ha la formazione di prodotto nel tempo.

Elettrodo di Clark

Sfrutta il fatto che l'ossigeno, a contatto con un catodo di platino, si riduce, assorbendo elettroni. Questa riduzione di elettroni nell'ambiente provoca un flusso di corrente sull'elettrodo. Questo metodo serve a misurare la concentrazione di ossigeno in soluzione (quando è più concentrato si genera un flusso di elettroni maggiore).

Reazione accoppiata: si fa in modo che lo step più lento sia quello dell'enzima che si vuole quantificare. Si mettono, quindi, gli altri enzimi in quantità sufficienti. Inoltre, tutti gli enzimi presenti devono avere lo stesso ottimo di pH e di temperatura perché i passaggi accoppiati avvengono in contemporanea.

Misure discontinue

Non si può misurare in continuo quanto prodotto si forma. La reazione viene fatta procedere per un certo tempo e dopo questo tempo si misura quanto prodotto si è formato. Se si sa quanto prodotto si è formato nella variazione di tempo, si può calcolare la velocità alla quale ha proceduto la reazione. Si utilizza spesso per gli enzimi proteolitici perché:

• Il BAPA è specifico per la tripsina.
• Quando si vogliono quantificare le proteasi presenti in un alimento, non si sa che tipo di proteasi è presente, quindi non c'è modo di scegliere il substrato sintetico più appropriato per quella proteasi.

Per fare una misura complessiva, generica di tutte le proteasi presenti in un certo prodotto si ricorre a dei saggi enzimatici in cui il substrato sia una vera proteina: quasi sicuramente, qualsiasi proteasi presente nel prodotto riuscirà ad idrolizzarla.

Acido tricloroacetico: TCA. Le proteine assorbono a 280 nm.

Enzimi cooperativi (o allosterici) e non cooperativi

Questa differenza si capisce osservando il grafico che descrive la velocità della reazione in funzione della concentrazione di substrato. Gli enzimi non cooperativi sono descritti da una curva iperbolica: la velocità aumenta al crescere di [S] tendendo asintoticamente a un valore massimo (vmax). Per gli enzimi cooperativi (o allosterici), la curva ha andamento asigmoidale: all'inizio, aumentando [S], v aumenta poco; successivamente, la v tende ad aumentare di più all'aumentare di [S], tendendo ad un valore massimo (vmax).

Equazione di Michaelis-Menten

L'equazione di Michaelis-Menten descrive gli enzimi non cooperativi. ES è l'unico complesso cataliticamente competente: il substrato si trasforma in prodotto solo quando è legato all'enzima nel complesso ES. La dissociazione del prodotto ha costante di equilibrio molto grande: la [EP] tende a zero, ossia appena il substrato si converte in prodotto, viene dissociato a dare l'enzima più il prodotto libero.

La reazione che da E+P è irreversibile: in realtà sappiamo che l'enzima non decide il verso della reazione. Si può fare questa assunzione perché si considera la velocità iniziale della reazione: non è ancora presente il P e siamo lontani dall'equilibrio chimico. Il turnover number dà un'idea dell'efficienza catalitica massima di un enzima.

Lo stato pre-stazionario dura pochissimo tempo, non ci si accorge neanche della sua presenza. Lo stato stazionario può durare secondi, minuti o ore, dipende dalla concentrazione delle specie. È quello che si studia. V=k[ES]. Le due reazioni che fanno consumare il complesso ES sono quella che lo riporta a dare E+S e quella che lo porta a dare E+P. C'è una proporzionalità diretta tra la velocità di reazione e la concentrazione totale di enzima.

Maggiore è la quantità di enzima presente, maggiore è la vmax a cui si tende. La km non varia perché l'enzima è lo stesso. La dipendenza della velocità da km è importante in condizioni fisiologiche: la reazione catalizzata da alcuni enzimi accelera o diminuisce in funzione della concentrazione di substrato presente. Questo può avvenire solo quando la concentrazione di substrato ha valori inferiori o uguali alla km.

È meno importante quando gli enzimi sono usati in processi produttivi: si utilizza il substrato a concentrazioni molto elevate, più grandi di km, si lavora praticamente sul ramo orizzontale della curva di M-M. A queste concentrazioni non ci interessa la km dell'enzima perché si lavora a velocità prossime alla vmax. A basse concentrazioni di substrato l'enzima blu è più efficiente di quello giallo (velocità maggiore), mentre ad alte concentrazioni di substrato l'enzima giallo è più efficiente di quello blu.

Linearizzazione delle misure di attività - Metodo dei doppi reciproci

In questo metodo l'equazione di M-M è riscritta come nella slide. È chiamato dei doppi reciproci perché i due parametri importanti (v e [S]) sono presenti come reciproci di loro stessi. La cosa importante è che si stratta dell'equazione di una retta. Il modello di M-M permette di calcolare l'effetto degli inibitori.

Effetto del pH sulla catalisi enzimatica

Le curve sono spostate a dx o sx in funzione del pK del singolo gruppo funzionale (carbossilico o amminico). L'ottimo di pH è il pH al quale ogni enzima ha i gruppi funzionali della catena proteica che hanno il giusto grado di protonazione o dissociazione. Quando ci si allontana dall'ottimo di pH, ad esempio alzando il pH, si ottiene che qualche gruppo funzionale si potrà dissociare, potrebbe quindi cambiare la sua carica.

Questo può avere sia un effetto sulla struttura proteica (il cambio di carica potrebbe fare variare i legami elettrostatici, quindi influenzare l'attività dell'enzima); ma se il gruppo che cambia carica appartiene al sito attivo, potrebbe cambiare la sua capacità di legare il substrato o di catalizzare la reazione. La curva a campana riflette questo concetto.

Effetto della temperatura sulla catalisi enzimatica

Tutte le reazioni aumentano la loro velocità all'aumentare della T. Oltre l'ottimo di temperatura l'enzima si denatura: si perde quindi l'attività catalitica (perché perde la sua struttura nativa) e la reazione rallenta.

Stabilità degli enzimi

Denaturanti fisici:

• Radiazioni ionizzanti: molto utilizzate per trattare i prodotti alimentari. Si utilizzano i raggi gamma perché hanno ottime capacità penetranti negli alimenti, quindi agiscono anche in profondità. I radicali che si formano possono reagire chimicamente con gli enzimi, quindi provocare modificazioni sui gruppi funzionali della proteina, che ne modificano la funzionalità, possono denaturare le proteine (processo che serve anche per sterilizzare alimenti). Usati per inattivare microrganismi.
• Shear forces.
• Temperatura: c'è un abbassamento di deltaG anche quando la T si abbassa. La Td (cold), ovvero la T di denaturazione fredda, è la T al di sotto della quale il deltaG è negativo, ossia al di sotto della quale la proteina è più stabile in forma denaturata. Tuttavia, la denaturazione a basse T è molto lenta.
• Pressione: pressioni molto alte o molto basse possono avere effetto denaturante.

Denaturanti chimici o chimico-fisici:

• pH/caotropi: modificando le interazioni ioniche tra amminoacidi di segno opposto che si trovano anche all'interno della proteina, viene destabilizzata la struttura proteica, la proteina si denatura. Quando il pH induce una denaturazione, l'effetto è irreversibile. Quando, invece, l'effetto è solo sulla protonazione di gruppi funzionali ma la proteina non è denaturata, basta ripristinare il giusto pH per avere nuovamente piena funzionalità dell'enzima. I caotropi sono sostanze in grado di destabilizzare le proteine. La loro azione è spiegata nella serie di Hofmeister. Ci sono alcuni ioni che, per la loro struttura chimica, sono in grado di stabilizzare o destabilizzare la struttura proteica. La serie di Hofmeister descrive gli ioni, diversi dai caotropi come l'urea, la cui azione è dovuta alla capacità di legare l'acqua.
• Solventi immiscibili: la fase idrofobica è separata dalla fase idrofilica in modo netto. La proteina si può denaturare all'interfaccia delle due fasi.

Modalità per stabilizzare un enzima:

• Rimozione acqua: aggiunta di Sali cosmotropi, ossia che aumentano la stabilità della struttura proteica. Molto spesso, questi Sali vengono utilizzati insieme alla liofilizzazione. Il sale rimane legato alla proteina liofilizzata e la proteggono durante il processo.
• Interventi sulla proteina: aggiungendo substrato o inibitori competitivi si creano legami con il sito attivo, quindi si crea, localmente, una struttura più stabile. Questa stabilizzazione conformazionale si trasmette a tutta la proteina.

Immobilizzazione di enzimi

Soprattutto per gli enzimi con alto valore economico, che difficilmente vengono aggiunti in un prodotto come enzima da perdere si ricorre all'immobilizzazione per poterli applicare al giusto contesto.