Tecnologia del DNA ricombinante: sfide e vettori innovativi

Qual è la sfida del DNA ricombinante?

La sfida principale della tecnologia del DNA ricombinante non è quella di far entrare il DNA stesso in una cellula ospite, ma quella di far sì che il DNA estraneo si duplichi quando la cellula si divide.
Per potersi duplicare il DNA ricombinante deve entrare a far parte di un replicone, un segmento di DNA che contenga un’origine della duplicazione; l’integrazione può avvenire in due modi:

- il frammento si può inserire in prossimità di un sito di origine della duplicazione

- il frammento può entrare nella cellula ospite come parte integrante di una sequenza di DNA trasportatrice (un vettore) che possiede una propria origine della duplicazione.

Caratteristiche dei vettori

Il vettore, per essere efficace, deve avere quattro caratteristiche fondamentali: deve essere capace di duplicarsi indipendentemente dalla cellula ospite; deve possedere una sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione che lo possa tagliare e ricombinare con il nuovo DNA; deve contenere un gene reporter; e deve avere dimensioni minori dei cromosomi dell’ospite.

Plasmidi come vettori

I plasmidi hanno piccole dimensioni e spesso contengono una solo sequenza di riconoscimento per un dato enzima di restrizione. Un plasmide tagliato con un enzima di restrizione si trasforma in una molecola lineare provvista di estremità coesive che si possono appaiare con le estremità di un altro frammento di DNA.

Molti plasmidi possiedono un’origine della duplicazione e contengono inoltre geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per questi motivi sono ottimi vettori, ma sono di piccole dimensioni, pertanto non possono essere utilizzati come vettori per la maggior parte dei geni eucariotici.

Virus e cromosomi artificiali

I virus, nonostante siano anche loro di dimensioni ridotte, vengono spesso usati come vettori per i geni eucariotici e procariotici. Essi non richiedono particolari artifici per essere indotti a penetrare nelle cellule ospiti.

I vettori più utilizzati sono i cromosomi artificiali di lievito. Essi sono cromosomi minimi creati in laboratorio, cioè molecole di DNA che contengono non soltanto siti di restrizione, geni reporter e l’origine della duplicazione del lievito ma anche le sequenze del centromero e del telomero che li rendono veri e propri cromosomi eucariotici.