Tecniche avanzate per la separazione e identificazione del DNA

Tecniche di separazione del DNA

Una delle tecniche più usate per la separazione di acidi nucleici (DNA e RNA) di differente peso molecolare (numero di nucleotidi) è l’elettroforesi su gel. In una prima fase, una certa quantità della molecola di DNA che si desidera sequenziare viene digerita con un'endonucleasi di restrizione. I frammenti di DNA, composti da poche centinaia di nucleotidi, vengono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide. Molecole più grosse che non riescono a passare attraverso il reticolo di poliacrilamide vengono frazionate su gel di agarosio, che ha una porosità maggiore. La poliacrilamide o l’agarosio gelificato forniscono la resistenza necessaria per la migrazione, cosicché maggiore è il peso molecolare di una molecola di DNA più lentamente essa si fa strada attraverso il gel. Questa metodica è così sensibile che possono essere separate anche molecole di DNA che differiscono per un solo nucleotide.

Identificazione di geni specifici

Un esempio di come l’elettroforesi su gel possa essere usata per identificare i frammenti di DNA che contengono un particolare gene, come il gene che codifica l’insulina umana. In una prima fase vengono identificati i frammenti di restrizione che contengono sequenze nucleotidiche del gene dell’insulina, Una volta separati i frammenti di DNA con elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene fatto adsorbire su un foglio di nitrocellulosa e quindi incubato con una sonda di DNA marcato che contiene la sequenza insulinica. La localizzazione della radioattività è rilevata con autoradiografia.