Ruolo delle polimerasi nella replicazione del DNA e mutazioni associate

Funzione della DNA polimerasi

• La DNA polimerasi aggiunge un nucleotide alla estremità 3’OH della catena in crescita: La direzione di crescita è sempre e solo 5’ → 3’.

• L’aggiunta dei nucleotidi non avviene a caso ma rispettando la complementarietà con il filamento opposto che fa da stampo.
• Gli errori per inserzione di nucleotidi sbagliati sono rari e sono corretti dalla DNA polimerasi (esonucleasi) grazie alla rimozione del nucleotide errato in direzione 3’ --> 5’ (proof-reading o”correzione delle bozze”).

Varietà di DNA polimerasi

• Esistono varie DNA polimerasi sia nei procarioti che negli eucarioti e molte altre proteine la cui attività serve alla replicazione del DNA.

I batteri hanno polimerasi I,II,III.

Attività esonucleasiche= una nucleasi un enzima che degrada il DNA, dall’esterno, parte dal nucleotide all’estremità.

L’esonucleasi I 5’3’ cioè stessa direzione della polimerasi. Serve per rimozione degli inneschi, che in natura sono a RNA. La polimerasi III (I e II ciascuna sono codificate da un gene) la III codificata da più geni che codifica per una delle subunità l’oloenzima.

Esistono tante altre polimerasi IV e V, hanno un ruolo nella riparazione del DNA.

La polimerasi I è l’unico ad avere attività esonucleasica 5’ 3’.

Non è l’enzima principale per la replicazione dei batteri ma enzima necessario per rimuovere gli inneschi.

Mutazioni e loro effetti

• Difetti dovuti a mutazioni nei geni per le polimerasi e le proteine che partecipano al processo della replicazione sono generalmente letali perché la replicazione è una funzione essenziale della cellula.
• Esistono però mutanti particolari, detti termosensibili, nei quali le polimerasi interessate dalle mutazioni funzionano alla temperatura fisiologica, ma oltre (42°C) presentano anomalie. Questi mutanti sono serviti a definire esattamente il ruolo delle varie polimerasi e anche di altre proteine che partecipano alla replicazione.

• Ad esempio il mutante polAex1 della DNA Polimerasi I di E.coli è w.t. a 37°C. A 42°C presenta attività di sintesi di DNA quasi normale ma perde l’attività esonucleasica 5’-->3’. A 42°C i mutanti polAex1 muoiono, quindi questa attività esonucleasica 5’-->3’ della Pol I è essenziale.

Scoperta di nuove polimerasi

• Lo studio di molti mutanti della replicazione dimostrò che dovevano esistere altre polimerasi in aggiunta alla Pol I: furono così scoperte la Pol III e la Pol II. – Ad es. un mutante (polC) replica normalmente il DNA 25°C ma non a 42°C: le cellule a 42°C interrompono la replicazione del DNA e poco dopo muoiono. Si scoprì che PolC è un mutante della Pol III (locus dnaE), che inattiva la sintesi di DNA 5’ → 3’.

• L’enzima “principale” della replicazione del DNA è proprio la Pol III, non la Pol I.

Origini della replicazione

• La replicazione non inizia ovunque, ma in appositi siti, le origini.

• Il DNA che costituisce le origini ha una sequenza particolare, spesso ricca in A e T per facilitare l’apertura localizzata della doppia elica, dovuta al legame di specifiche proteine.