Dalla genetica alla genomica: il ruolo del DNA microarray nelle cellule tumorali

Evoluzione della genetica alla genomica

Qualche decennio fa gli scienziati cominciarono a studiare i geni tracciandoli, mutandoli, clonandoli, sequenziandoli e verificando che proteine sintetizzassero. Tuttavia, studiavano o un singolo gene o pochi geni alla volta, il che rappresentava uno studio abbastanza lento dal momento che esistono migliaia di geni: ad esempio il genoma umano comprende all’incirca 20000 geni. Il passaggio da genetica (studio dei geni singoli) in genomica (studio dei genomi complessivi) è stato effettuato nel 21esimo secolo grazie all’ipotesi della possibilità di poter studiare molti geni contemporaneamente.

Funzionamento del DNA microarray

Ciò che rende le cellule del nostro corpo differenziate tra di loro è l’attivazione o disattivazione di particolari geni. Un ottimo modo di capire quali geni vengono espressi (e quindi attivati) è partire dagli mRNA sintetizzati in una cellula. Per poter studiare come varia l’espressione genica in cellule differenti i ricercatori hanno messo a punto uno strumento preciso: il DNA microarray.

Preparazione e utilizzo del microarray

Per utilizzare il DNA microarray, abbiamo prima bisogno di: sequenziare il genoma in questione; utilizzare dei computer o delle macchine in generale per capire dove sono i geni, sintetizzare i primer per la PCR, vedere dove la PCR non è avvenuta; separare i doppi filamenti di DNA; utilizzare dei robot per posizionare i campioni di DNA nelle colonne del microarray. Per ricavare un microarray ci sono delle compagnie biotecnologiche che si occupano di costruirli in grandi quantità e metterli a disposizione per l’uso. Questo strumento è costituito essenzialmente da una piastra di silicio in cui ci sono numerosi fori in cui vengono posizionate le sequenze di DNA a cui corrisponde un gene.

Analisi delle cellule tumorali

La genomica è molto importante per capire quali geni vengono espressi all’interno delle cellule tumorali: si usano quindi dei microarray per capire le differenze tra una cellula sana e una tumorale (perché a volte il solo compararle al microscopio potrebbe non tornare utile e non farebbe capire il perché di questa differenza). Prima di tutto bisogna capire cosa sono le cellule tumorali. Queste sono delle cellule la cui crescita e divisione è incontrollata a causa di qualche difetto all’interno del genoma. Nell’esperimento che ci permetterà di distinguere i due tipi di cellule serviranno: una soluzione tampone, 2 colonne per la cromatografia, una soluzione solvente, 2 miscele fluorescenti di diverso colore, una soluzione di lavaggio, una microcentrifuga, un vortex, un bisturi, provette, micropipetta, puntali, uno scanner e un computer.

Procedura di estrazione e analisi dell'RNA

Per procedere bisogna prelevare l’RNA dalle cellule di melanoma(un tipo di tumore alla pelle) e da cellule sane della pelle dallo stesso paziente, in modo tale da avere lo stesso patrimonio genetico. Per farlo bisogna prelevare il tessuto tumorale e il tessuto sano e metterli in provette diverse. Si preleva quindi con la pipetta un po’ di solvente organico (che separerà le varie componenti cellulari) e lo si versa in entrambe le provette contenenti i diversi tessuti. Si prendono poi le provette e si posizionano sul vortex, che permetterà di rilasciare l’RNA attraverso l’agitazione. Successivamente si mettono le provette nella microcentrifuga, che permetterà di separare le componenti cellulari per densità: si ottiene infatti una provetta il cui pellet è costituito dalle proteine, dal DNA (che non rimane in soluzione perché molto più lungo dell’RNA) e altre cose; il surnatante contiene invece l’RNA in soluzione. Con una micropipetta si preleva il surnatante da entrambe le provette e lo si versa in altre due provette: queste conterranno i diversi tipi di RNA (mRNA, rRNA, tRNA).

Isolamento e colorazione dell'mRNA

Essendo che serve solo l’mRNA, bisogna isolarlo dagli altri tipi di RNA: per questo procedimento si usa la cromatografia su colonna. In entrambe le colonne ci sono delle biglie di polimeri artificiali (come l’agarosio) in cui sono inserite delle code di poli-T. Quando si versa il contenuto delle due provette con una micropipetta nelle due colonne, solo l’mRNA si attaccherà alle biglie (perché è l’unico RNA con una coda di poli-A), e nell’eluato (materiale di scarto), ci saranno le altre molecole. Successivamente si versa una soluzione tampone dentro alle due colonne: la soluzione ha il compito di far cambiare il pH e, quindi, di rompere i legami ad idrogeno, facendo scendere così l’mRNA. A questo punto bisogna procedere con la copia in cDNA dei filamenti di mRNA, però prima di farlo si aggiungono i coloranti fluorescenti alle due provette: il rosso per l’RNA delle cellule tumorali, il verde per quello delle cellule sane. La miscela fluorescente comprende dei primer complementari alla coda di poli-A, una trascrittasi inversa e dei nucleotidi fluorescenti: si avranno così dei cDNA fluorescenti. In questo procedimento si sfrutta particolarmente la capacità di una singola molecola di DNA di appaiarsi subito alla molecola complementare (ibridazione).

Ibridazione e analisi finale del microarray

Si procede quindi con la stratificazione sul microarray dei contenuti delle due provette. Quello che si avrà è un microarray con dei punti colorati di rosso (i geni del foro vengono espressi solo nelle cellule tumorali), dei punti colorati di verde (i geni del foro vengono espressi solo nelle cellule sane) e dei punti colorati di giallo (i geni del foro vengono espressi sia nelle cellule sane che in quelle tumorali). Successivamente vengono lavati via i cDNA che non si sono ibridati attraverso una soluzione di lavaggio. Questo passaggio è di solito effettuato più volte. Infine il microarray viene posto all’interno di una macchina collegata a un computer che lo scannerizza, indicando i punti verdi e i punti rossi, e poi, attraverso una sovrapposizione grafica delle immagini, anche i punti gialli. In conclusione, per studiare un certo tipo di tumore, bisogna focalizzarsi soprattutto sui punti rossi, che identificano quei geni attivi nelle cellule tumorali che quindi fanno espandere il tumore.