Il DNA ricombinante


La PCR

La PCR è un metodo che consente di replicare il DNA in provetta per mezzo di una polimerasi, ottenendo numerose copie di una specifica sequenza. Essa necessita di: DNA stampo e due primer con un gruppo ossidrile libero a 3’ ai quali aggiungere nuovi nucleotidi. Si compone di diverse fasi:
Fase di denaturazione: separazione delle catene elementari tramite riscaldamento a 90.
Fase di annealing: I primer si legano al DNA e agiscono da inneschi per la DNA polimerasi.
Fase di sintesi: il DNA si replica in modo selettivo.
I primer sono brevi frammenti di DNA costruiti in modo da evitare gli appaiamenti reciproci e la formazione di ripiegamenti che impedirebbero il corretto attacco del primer alla regione complementare presente alle estremità del gene bersaglio. I cicli successivi comportano la separazione delle molecole a doppia catena anche delle copie neosintetizzate e possono essere ripetuti per 20-30 volte, facendo crescere il numero di copie esponenzialmente (2n). Questa pratica é ora più semplice per la scoperta di due innovazione: la Taq polimerasi (enzima che lavora a 72 e non si denatura durante la fase di separazione) e lo sviluppo dei termociclatori automatizzati (produzione di alte variazioni di temperatura).
La PCR viene anche utilizzata per amplificare sequenze corrispondenti a segmenti di RNA: si trasforma un RNA in un cDNA con la trascrittasi inversa e so si amplifica con la reazione a catena della polimerasi (PCR a trascrizione inversa o RT-PCR). La PCR é utilizzata soprattutto nelle analisi di DNA fingerprinting per definire le impronte molecolari; vengono utilizzate delle brevi sequenze o microsatelliti STR che si ripetono di seguito all’altro. I primer consentono di amplificare i microsatelliti per il numero di volte che queste sequenze sono ripetute il quale é proporzionale alla lunghezza del segmento amplificato. Si utilizzano primer con marcatori fluorescenti che consentono di individuare i frammenti di DNA con un laser e quindi differenziare i prodotti di loci diversi di dimensioni simili. In seguito attraverso l’elettroforesi vengono separati in base alla velocità con cui migrano nel campo elettrico.

Sequenziamento del genoma


Sequenziare un frammento di DNA significa determinare l’ordine esatto nel quale si trovano i nucleotidi che lo costituiscono. Negli anni ’70 fu inventato il metodo Sanger che si basava sull’allungamento del DNA da parte di DNA polimerasi la quale interrompeva la sintesi ad opera di didesossinucleotidi.
Strumenti necessari: DNA polimerasi, un primer marcato, 4 deossinucleotidi trifosfato e 4 dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP) coniugati ciascuno con un fluorocromo.
Procedura: dopo la denaturazione il primer si lega e attiva la DNA polimerasi che aggiunge a 3’ i nucletodi complementari. Grazie alla miscela ddNTP+dNTP la polimerasi a caso inserisce il ddNTP al posto del dNTP bloccando la sintesi del filamento complementare e ottenendo frammenti di DNA di varia lunghezza che differiscono per il ddNTP. Oggi si utilizzano i sequenziatori automatici che contengono tubi capillari al cui interno i frammenti di DNA sono separati in una corsa elettroforetica e i ddNTP rilevati con i laser. La sequenza é quindi letta determinando la successione dei colori che viene poi tradotta in sequenza di nucleotidi. Per determinare tutta la sequenza di un intero genoma é necessario che il DNA venga spezzato in migliaia o milioni di frammenti più piccoli che possono essere inclusi in vettori e sequenziati.

Green Biotech


La produzione di specie resistenti ai parassiti é stata conseguita grazie all’introduzione nel genoma di diverse specie vegetali di un gene che codifica una tossina letale per gli insetti, isolata da Bacillus thuringiensis. Le piante con geni Bt (prelevati dal batterio) o resistenti agli erbicidi sono definite organismi geneticamente modificati di prima generazione creati per aumentare l’efficienza e la produttività agricola e per ridurre l’uso degli insetticidi. Esistono anche gli OGM di seconda generazione (alimenti con vitamine o sostanze ossidanti) e OGM di terza generazione creati per far produrre alle piante vaccini o farmaci. Esempi: papaya hawaiana in grado di resistere a virus PRSV che impediva fotosintesi, golden rice cinese per accumulare
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