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Determinazione carica batterica totale

1. Semina campione in piastra
-Prelievo campione, effettuato in volume ampio e tenendo agitata la massa. Deve essere fatto 24-36 ore prima dell’analisi e conservato a 5-6°C.
-Diluizione del campione attraverso la tecnica delle diluizioni successive, spiegata in figura:
-Preparazione del substrato, che può essere AGAR CONTA o STANDARD PLATE COUNT AGAR. Si preparano nello stesso modo, seguendo le istruzioni presenti sul contenitore. Si pesa la dose indicata in etichetta e la si mette in acqua in una beuta, poi si mette in autoclave a 121°C per 15 minuti. Successivamente si mette la beuta a bagnomaria a 45°C, oppure se l’analisi deve essere eseguita successivamente si mette la beuta in frigo. Se necessario, stabilizzare il pH con appositi reagenti.

-Semina campione diluito, si seminano generalmente due diluizioni (solitamente contigue) e si preparano 5 piastre per diluizione. Sotto cappa sterile nella piastra si mette 1 ml di latte diluito a 10-4/10-6 per latte da Parmigiano Reggiano o 10-5 per latte alimentare, poi si aggiungono 15-20 ml di substrato e si fanno movimenti laterali, rotatori, verso l’alto e verso il basso per permettere al campione di mescolarsi con il substrato.
-Le piastre, una volta solidificato l’agar, vanno messe impilate capovolte (per evitare che la condensa cada sul substrato) in termostato a 30°C per 70-72 h oppure a 32°C per 48 h.
-Conteggio delle UFC, moltiplicando il numero di unità formanti colonie per il fattore di diluizione (es. se ci sono 4,7 UFC a 10-4, allora 4,7 X 10000= 470000 batteri/ml di latte). Si può poi fare la media dei diversi campioni.
2. Reazioni colorimetriche o prova della reduttasi
Sono metodi qualitativi. Ne esistono due tipi, che si basano sull’attività metabolica dei batteri, cioè sulla produzione di reduttasi.
2A. Blu di metilene
-Preparazione provette con 10 ml di latte conservato in frigo;
-Aggiunta 1 ml di soluzione commerciale di blu di metilene. Si preparano 4-5 provette per ogni campione, e si tappano con apposito cotone da laboratorio o tappi metallici.
-Incubazione a bagnomaria, a 38-40°C per circa 7 h. A intervalli regolari si effettuano le seguenti letture:
1^ lettura a 20 minuti;
2^ lettura a 1 ora;
3^ lettura a 2ore, e successive fino a 7 ore.
-Si misura il tempo di decolorazione del latte, infatti se dopo 20 minuti il latte inizia già a decolorarsi significa che la carica batterica è elevatissima e c’è una produzione di reduttasi in grado di decolorare il latte (quindi pessima qualità). Se invece il colore è mantenuto per 7 ore la qualità è ottima.
2B. Resazurina
La resazurina è venduta in pastiglie di colore blu.
-La pastiglia di resazurina è messa in provette con 50 ml di H2O distillata, formando la soluzione reagente.
-Nelle provette si mettono 10 ml di latte e 1 ml di resazurina, e il latte diventa azzurro.
-Incubazione a bagno maria a 37°C per 1 ora.
-Lettura effettuata immediatamente quando si rimuove la provetta dal bagnomaria, e si guarda il colore:
Bianco, sigla EE, con carica batterica elevatissima, pessima qualità;
Rosa, sigla EL, carica batterica elevata, mediocre qualità;
Azzurro, sigla N, carica batterica bassa, normale qualità.
È il metodo più usato nel latte da Parmigiano Reggiano

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