Concetti Chiave
- Il Western blot è usato principalmente nella ricerca e non nella pratica clinica.
- L'immunofissazione utilizza un gel per separare le proteine basandosi su peso molecolare e carica.
- Il Blotting permette di trasferire proteine su supporti rigidi per ricerche di anticorpi.
- L'elettroforesi capillare è automatizzabile e più efficiente rispetto alla classica elettroforesi su gel.
- L'albumina, una proteina di trasporto, è cruciale nella diagnosi medica, con livelli sotto 20 g/L indicanti prognosi negativa.
Indice
Metodi di analisi delle proteine
Per quanto riguarda i metodi di analisi delle proteine in laboratorio, abbiamo:
• Determinazione delle proteine totali (non trattato)
• Determinazione quantitativa di singole proteine specifiche (non trattato)
• Elettroforesi delle proteine (cfr. dopo)
Tecniche di analisi avanzate
Accenni ad altre tecniche di analisi:
• Western blot – tecnica che non viene utilizzata nella pratica clinica e ha un’applicazione solo nella ricerca;
• Immunofissazione – ha trovato un certo utilizzo la corsa elettroforetica su gel di policlinammide (immunofissazione). Si utilizza un gel in cui avviene la migrazione in base al peso molecolare e alla carica della molecola;
• Blotting – un’altra tecnica che trova applicazione è il Blotting (“blottaggio”) che prevede il trasferimento delle proteine dal gel di poliacrilammide su un supporto rigido in camera umida a voltaggio costante (di solito membrane di idrocellulosa, nylon, carta). Il blotting viene eseguito per alcune ricerche di anticorpi in alcuni contesti come l’autoimmunità. Le proteine vengono separate in base a:
• massa
• carica molecolare
Elettroforesi e sue applicazioni
Esistono 2 tipologie differenti di elettroforesi:
• Elettroforesi su supporto solido
• Elettroforesi capillare (o in fase libera)
L’elettroforesi in laboratorio si possono eseguire anche su supporto solido (gel di agarosio o acetato cellulosa), ma è molto più frequente l’elettroforesi (EF) capillare, in quanto ha il vantaggio di essere automatizzabile. Bisogna infatti ricordare che il principio del laboratorio è quello di rendere disponibile in tempi bevi esami utili per il processo diagnostico e terapeutico; l’elettroforesi classica è un processo lento che richiede personale esperto ed ha una bassa produttività (numero di campioni processabili), mentre nell’EF capillare un campione viene processato nel giro di 3 minuti ed ha una risoluzione migliore rispetto a quella su gel. Segue verso destra la banda dell’albumina.
Importanza dell'albumina
È importante che il medico ne conosca la concentrazione fisiologica di 30-50 g/L, nonché la vita media è di 15/20 giorni. Dal punto di vista funzionale l’albumina è una proteina di trasposto, che lega farmaci, bilirubina, acidi grassi, metalli, agli ormoni tiroidei (pur avendo quest’ultimi una proteina trasportatrice specifica). Quando la concentrazione dell’albumina scende sotto i 20 g/L è un fattore prognostico negativo per la sopravvivenza del paziente.
È una proteina da 66kDa a singola catena polipeptidica e data la sua dimensione riuscirebbe a passare tra i pedicelli dei podiciti del foglietto viscerale della capsula di Bowman, ma ciò non accade a causa della repulsione elettrostatica.
Domande da interrogazione
- Quali sono le principali tecniche di analisi delle proteine menzionate nel testo?
- Quali sono i vantaggi dell'elettroforesi capillare rispetto a quella su supporto solido?
- Qual è l'importanza clinica della concentrazione di albumina nel sangue?
Le principali tecniche di analisi delle proteine menzionate includono l'elettroforesi delle proteine, il Western blot, l'immunofissazione e il blotting.
L'elettroforesi capillare è automatizzabile, più veloce (processa un campione in 3 minuti) e offre una migliore risoluzione rispetto all'elettroforesi su supporto solido.
La concentrazione di albumina è importante perché una concentrazione inferiore a 20 g/L è un fattore prognostico negativo per la sopravvivenza del paziente.
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