pexolo di pexolo
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Basi molecolari della permeazione e selettività

L’applicazione congiunta dell’elettrofisiologia e della biologia molecolare allo studio dei canali ionici ha consentito di identificare nell’ansa P, una sequenza di circa 20 aminoacidi che collega i segmenti S5 e S6 le parti della proteina canale coinvolte nei processi di permeazione e selettività dei canali ionici voltaggio-dipendenti. Si pensa che l’ansa P formi una U rivolta verso la parte centrale del poro, cosicché le quattro anse P derivanti dalle quattro subunità o domini omologhi dei canali ionici voltaggio-dipendenti concorrono a formare la parete del poro. Un primo indizio della partecipazione di questa regione al poro permeativo fu ottenuto studiando la sensibilità di canali Na mutati al bloccante TTX, noto interagire con regioni del canale importanti nella permeazione degli ioni. Studi elettrofisiologici avevano mostrato che il blocco da TTX era inibito dalla modificazione covalente dei gruppi carbossilici del canale, gruppi che la struttura primaria del canale poneva nell’ansa P. Eseguendo successivamente mutazioni puntiformi che sostituivano l’acido glutammico con glutammina nella posizione 387 all’interno del segmento P si aveva una riduzione di più di tre ordini di grandezza dell’affinità della tossina per il canale.
L’analisi funzionale di numerose altre mutazioni a carico del ansa P portò una convincente evidenza della partecipazione di questo dominio alla permeazione e selettività dei canali Na. In particolare nelle quattro anse P omologhe si ritrovano quattro residui altamente conservati, posizionati su posizioni equivalenti (un aspartato, un glutammato, una lisina e una alanina, usualmente chiamato locus DEKA) e ritenuti critici componenti della permeazione e selettività di questi canali. Nei canali Ca voltaggio-dipendenti la regione corrispondente al locus DEKA dei canali Na contiene invece quattro residui di glutammato, e per questo motivo è chiamata locus EEEE. È ora di particolare interesse che trasmutazioni dei residui di alanina e lisina del locus DEKA a residui di glutammato conferiscono al canale Na le proprietà di permeazione e selettività tipiche dei canali Ca. Un’ultima evidenza del ruolo delle anse P nella permeazione e selettività deriva da studi su chimere costruite su due canali K (NGK2 e DRK1) che presentavano marcate differenze nella conduttanza di singolo canale (circa tre volte) e affinità per il bloccante TEA. La chimera ottenuta per trapianto sul canale K a bassa conduttanza di un segmento di 20 aminoacidi comprendente gran parte dell’ansa P con il segmento corrispondente dell’altro canale dava alla chimera le caratteristiche permeative e di blocco da TEA tipiche del canale donatore.
L’identificazione dell’ansa P con il filtro selettivo dei canali K è stata successivamente confermata dall’analisi cristallografica condotta su un canale K batterico. Sebbene questo canale sia evolutivamente molto distante dai canali K dei mammiferi, esso presenta una piuttosto alta omologia di sequenza con questi ultimi, almeno per quanto riguarda le regioni della proteina che si pensa abbiano rilevanza nella permeazione e selettività. In accordo con le ipotesi descritte prima, la struttura derivante da questa analisi mostra le quattro anse P orientate verso il poro, a delimitare una regione ristretta, il putativo filtro di selettività. Inoltre la cristallografia ci mostra che i residui aminoacidici che delimitano il poro sono disposti in modo tale da esporre al lume del poro i gruppi carbonilici dello scheletro peptidico. Essendo questi gruppi carbonilici debolmente polari (si stima che il dipolo C=O corrisponda a una dislocazione di carica negativa sull’ossigeno pari a -0.1 unità), questo risultato è consistente con quanto predetto dalla teoria di Eisenmann, che, per un canale selettivo al K piuttosto che al Na, predice un sito di legame debolmente carico. Poiché la cristallografia del canale KcsA è stata anche fatta in presenza di ioni permeanti, è anche possibile individuare i probabili siti di legame degli ioni K all’interno del poro. Ben 3 ioni si posizionano all’interno del poro, due nel filtro di selettività e il terzo nel vestibolo intracellulare. Ciò conferma la natura multi-ionica di questo poro, precedentemente ipotizzata sulla base dell’anomalia della frazione molare.
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