Alghe ingegnerizzate: un nuovo sistema generatore di ossigeno per un trattamento efficace del cancro ipossico

2.1 MOLTEPLICI UTILIZZI DELLE MICROALGHE

Grazie al fatto che sono specie molto numerose, hanno un prezzo economico e presentano una notevole

uniformità strutturale, le microalghe sono state utilizzate per molti scopi, tra cui la produzione di

biocarburanti, ottima alternativa sostenibile ai combustibili fossili, utilizzando la CO2 come fonte di

carbonio (Wijffels and Barbosa, 2010). Queste sono state introdotte nella dieta, attualmente solo dieci

specie sono autorizzate al consumo alimentare in Europa ma quelle poche specie ritenute sicure da

mangiare stanno diventando oggetto di ricerca di alternative più ecologiche alle fonti proteiche animali;

sono un’ottima fonte di vitamine A, B, C e B12 e contengono iodio.

Oltre ad offrire fonti sostenibili di proteine e fibre, le microalghe sono anche un’ottima fonte di omega-

3 e omega-6, acidi grassi essenziali il cui apporto, dunque, deve necessariamente provenire dalla dieta.

Possono essere quindi una buona alternativa al pesce a causa dell’aumento dei prezzi di esso e alla

crescente preoccupazione per la sua sostenibilità.

3. SINTESI DELLE RBCM-ALGAE

In seguito, è riportato il metodo innovativo che ha permesso di superare la condizione di ipossia

tumorale mediante la generazione in situ di ossigeno, utilizzando un sistema fotosintetico naturale

basato sulla Chlorella vulgaris ingegnerizzata.

Le microalghe, mediante il rivestimento dato dalla membrana dei globuli rossi, riescono facilmente a

raggiungere il tumore dato che il rivestimento le protegge dalla distruzione da parte delle cellule

immunitarie, permettendo loro di svolgere la propria funzione più a lungo. Inoltre, la C. vulgaris

contiene un’alta concentrazione di clorofilla che assorbe la luce in un ampio spettro di lunghezze

d’onda; dunque, a seguito di irradiazione laser (650nm) vengono prodotte specie reattive dell’ossigeno

(ROS) che aumentano ulteriormente l’efficacia della terapia fotodinamica. Combinando tutto questo

con le terapie convenzionali quali radioterapia (RT) e terapia fotodinamica (PTD), si può ottenere un

effetto significativo sull’efficacia di questi trattamenti. (Pierobon et al., 2018)

3.1 INGEGNERIZZAZIONE DI CHLORELLA VULGARIS

Le RBCM-Alghe sono costituite da due elementi: le microalghe C. vulgaris e le membrane dei globuli

rossi (RBCM).

I globuli rossi sono raccolti per centrifugazione (3000 giri/min), viene rimosso il surnatante e lavato

con PBS ghiacciato fino a che non risulta trasparente. Il precipitato viene disciolto in soluzione tris-HCl

a freddo per estrarre la membrana. I campioni vengono purificati per centrifugazione (9000 giri/min)

per eliminare eventuali aggregati nei surnatanti. (Mohandas and Gallagher, 2008)

RBCM viene raccolto mediante ultrasuoni criogenici per 10-20 min finché il composto diventa

trasparente. La procedura è ripetuta per 3 volte.

RBCM così ottenuto viene miscelato con C. vulgaris in rapporto di volume 1:1 in agitazione per tutta la

notte a 4°C. In questo modo, le alghe sono state ricoperte di uno strato sottile di RBCM. (Gao and

Zhang, 2015)

3.2 CARATTERIZZAZIONE PROTEICA DI RBCM TRAMIDE SDS-PAGE

L’SDS-Page è una tecnica utilizzata in biologia molecolare che permette di separare ed analizzare le

proteine in base al loro peso molecolare. È stata utilizzata per poter verificare se le RBCM-Alghe

fossero state create correttamente, per valutare la purezza del campione e per stimare la quantità di

proteina presente, analizzando l’intensità della colorazione delle bande.

Le proteine RBCM, Alghe e RBCM-Alghe sono state preparate con un detergente (SDS, sodio dodecil

solfato) che denatura le proteine e le carica negativamente. Questo permette loro di migrare verso il

polo positivo di un campo elettrico. Successivamente, con uguali quantità di massa, sono state caricate

nei pozzetti su un gel di poliacrilamide. A seguito dell’applicazione di corrente elettrica, i campioni

sono quindi stati fatti correre su un gel SDS-Page al 10% utilizzando come tampone di corsa un

tampone tris-glicina-SDS; le proteine più piccole, essendo meno ostacolate dal gel, migreranno più

velocemente rispetto alle grandi.

In seguito, il gel è stato colorato per 1 h con colorante blu di Coomassie che si lega alle proteine e le

rende visibili, seguito da decolorazione per tutta la notte. Il gel è stato poi visualizzato utilizzando un

sistema di imaging che permette di vedere le bande proteiche.

3.3 MISURAZIONE DELLA VITALITÀ DI RBCM-ALGHE

La misurazione della vitalità è fondamentale perché permette di verificare che le alghe rimangano

attive per garantire l’efficacia del trattamento e per monitorare le condizioni ottimali per la loro

crescita.

Le RBCM-Alghe sono state poste in un incubatore illuminato a 27°C. Allo stesso tempo, un volume

uguale di RBCM-Alghe è stato seminato in piastre a 96 pozzetti.

La vitalità di RBCM-Alghe è stata determinata esaminando l’assorbanza a 600 nm; maggiore è

l’assorbanza, maggiore è la quantità di alghe presenti. È stato poi utilizzato un colorante (PI) che viene

assorbito dalle cellule morte e così diventano fluorescenti. Al microscopio le cellule morte appaiono

colorate di rosso mentre quelle vive restano incolori. Successivamente sono state contate il numero di

cellule vive e morte nelle immagini acquisite al microscopio tramite ImageJ. (Koo et al., 2006)

4. RISULTATI OTTENUTI

4.1 LE RBCM-ALGHE HANNO CAPACITÀ DI OSSIGENAZIONE

Le alghe sotto luce rossa (LED 660 nm) mostrano un’attività fotosintetica superiore rispetto alla luce

bianca. Questo accade perché la lunghezza d’onda della luce rossa corrisponde alla lunghezza d’onda

assorbita dai pigmenti fotosintetici, come la clorofilla. Questi pigmenti catturano l’energia luminosa e

la utilizzano per convertire l’anidride carbonica e l’acqua in glucosio e ossigeno. La luce bianca

contiene anche lunghezze d’onda che non vengono assorbite dai pigmenti, risultando quindi meno

efficaci per la fotosintesi.

Dunque, le RBCM-Alghe sotto luce rossa in 60 minuti producono un’elevata quantità di O2,

raggiungendo un livello di concentrazione di ossigeno di 12,1 mg/L (in modo sia tempo- che

concentrazione-dipendente), tasso superiore a quello osservato in luce bianca (9,9 mg/L). Inoltre, la

capacità di ossigenazione delle RBCM-Alghe non ha mostrato differenze significative rispetto a quella

delle alghe non rivestite, non è stata notata nessuna diminuzione della capacità di ossigenazione con la

profondità; quindi, continuano a produrre O anche quando la luce deve penetrare a 2 e 4 mm e infine è

2

stato osservato che le alghe continuano a mantenere la capacità di produrre O anche dopo 6 giorni di

2

conservazione a 4°C. Questi risultati dimostrano che le RBCM-Alghe sono un sistema molto efficiente

per rilasciare ossigeno in modo controllato nell’ambiente circostante. (Pierobon et al., 2018)

4.2 VALUTAZIONE DELLE RBCM-ALGHE IN COLTURE CELLULARI

Le proprietà delle RBCM-Alghe sono state analizzate in un ambiente controllato, ovvero in coltura

cellulare. In particolare, è stato valutato se queste particelle fossero sicure per le cellule e se fossero in

grado di svolgere le funzioni per cui sono state progettate.

Per la valutazione della citotossicità sono state utilizzate diverse linee cellulari come cellule tumorali

mammarie 4T1, fibroblasti, macrofagi murini J774, ad esse sono state aggiunte le RBCM-Alghe in

diversa quantità e incubate per almeno 24 ore, per vedere se e quanto potessero danneggiare queste

cellule. Successivamente è stato aggiunto il colorante MTT (metil tiazolil tetrazolio) che diventa viola

solo nelle cellule vive, seguito da un’ulteriore incubazione a 37°C per 4 ore; misurando l’intensità del

colore è stato possibile capire quante cellule fossero morte a causa delle RBCM-Alghe.

È stato misurato l’effetto delle RBCM-Alghe anche sui globuli rossi per verificare se esse causano la

loro distruzione; per il test di emolisi, il sangue di topo è stato centrifugato e lavato tre volte con PBS

per raccogliere i globuli rossi. Questi ultimi sono stati messi a contatto con RBCM-Alghe; dopo

incubazione per 4 ore, tutta la sospensione miscelata è stata centrifugata ed è stato valutato se essi

fossero andati incontro ad emolisi tramite un lettore di micropiastre. (Mohandas and Gallagher, 2008)

I risultati hanno confermato che le RBCM-Alghe, anche in concentrazioni elevate, non hanno causato

la morte delle cellule, non hanno indotto la secrezione di interleuchina-1B (una citochina

infiammatoria) dai macrofagi e non hanno causato la lisi dei globuli rossi, indicando che il rivestimento

delle alghe è stabile e non danneggia le membrane cellulari.

Dato che le RBCM-Alghe possono attivamente svolgere la fotosintesi in condizioni fisiologiche, è stata

valutata la loro capacità di modulare le condizioni cellulari ipossiche. È stata utilizzata una sonda

fluorescente chiamata [Ru(dpp)3]Cl2 sensibile all’ossigeno: quando le cellule sono incubate con le

RBCM-Alghe ed esposte alla luce rossa, la fluorescenza della sonda diminuisce significativamente nel

tempo, raggiungendo il minimo dopo circa 2 ore. Questi risultati indicano che le RBCM-Alghe

contrastano l'ipossia grazie alla loro eccellente capacità di ossigenazione con l’esposizione alla luce

rossa.

Successivamente un saggio clonogenico è stato utilizzato per valutare l’apoptosi indotta dalle

radiazioni dopo l’alleviamento dell’ipossia cellulare da parte delle RBCM-Alghe; il saggio clonogenico

è un test biologico utilizzato per analizzare la capacità di sopravvivenza e proliferazione delle cellule

dopo essere state esposte ad un agente dannoso come in questo caso le radiazioni. Come previsto, le

cellule tumorali mammarie 4T1 coltivate in condizioni ipossiche sono molto più resistenti alle

radiazioni rispetto a quelle coltivate in condizione di normossia. Dunque, le RBCM-Alghe hanno

eliminato gran parte della resistenza delle cellule tumorali alle radiazioni e questo è un risultato atteso

dal momento che la mancanza d’ossigeno è nota per proteggere le cellule dalle radiazioni.

In seguito, è stata utilizzata la colorazione immuno-fluorescente per valutare il danno al DNA indotto

dall’irradiazione a raggi X riflesso da r-H2AX, un marcatore delle rotture del DNA a doppio filamento;

questa rottura è un grave danno al DNA che, se non riparato, può portare alla morte cellulare. Pertanto,

in accordo con il saggio clonogenico precedentemente effettuato, il miglioramento dell'apporto di

ossigeno rilasciato dalle RBCM-Alghe induce un maggior danno al DNA, sensibilizzando le cellule

tumorali alle radiazioni. (Liu and Chen, 2016)

È stato scoperto che l&rsquo