Appunti metà lezioni Genetica molecolare umana

PROBABILITÀ DI MATCH CASUALE

Random match probability (RMP)

Probabilità che un individuo nella popolazione abbia lo stesso genotipo dell’individuo che sto analizzando - il

calcolo si basa sulle frequenze alleliche dei loci che stiamo analizzando nella popolazione: tanto piu l’allele è

raro tanto più aumenterà il potere del test. Perciò i match sono quantificabili in termine di probabilità - qual è

la probabilità che un profilo come quello creato a partire da materiale biologico rinvenuto corrisponda al

profilo generico di un individuo preso a caso nella popolazione? Si applica la regola del prodotto per eventi

indipendenti partendo dal database di frequenze alleliche - è necessario che vengano rispettate due

condizioni di indipendenza: gli alleli di ciascun locus sono assortiti a caso nei genotipi e gli alleli di diversi loci

sono assortiti a caso gli uni rispetto agli altri nella popolazione. In sostanza non deve esserci ereditarieta

forzata.

La probabilità del genotipo relativo ad ogni locus STR si calcola dalle frequenze dei diversi alleli applicando la

legge di Hardy Weinberg - probabilità di un profilo genetico = prodotto delle singole Probabilità di ogni

genotipo relativo ad ogni locus STR

Nel senso che il mio profilo genetico Q sara dato da un tot di STR definiti, percio io vado a calcolare la

frequenza nella popolazione di ogni STR per vedere quanto è raro quel determinato genotipo.

La probabilità di identità è la probabilità che due individui presi a caso nella popolazione abbiano lo stesso

genotipo. Anche Se due profili metchano completamente è necessario comunque dare un termine statistico.

La probabilità del genotipo relativo ad ogni locus STR si calcola dalle frequenze dei diversi alleli con la legge

di Hardy - Weinberg.

Se i loci sono indipendenti la probabilità d’identità combinata si calcola semplicemente con la probabilità che

quell’allele si presenta nella popolazione moltiplicato per ogni str.

TEST DI PARENTELA E PATERNITÀ

Nella paternità, il fatto che non matchi solo un microsatellite può essere dovuto ad una mutazione percio

l’esclusione di paternità viene fatta quando almeno due o tre microsatelliti non corrispondono tra padre e

figlio.

Il caso di esclusione il test si conclude, ma in caso di compatibilità è necessario visualizzare i risultati in

termini statistici calcolando l’indice di paternità (PI, in cui si considera un locus) e l’indice di paternità

combinato (CPI, in cui si considerano più loci).

Indice di paternità: si calcola attraverso il rapporto di due probabilità, ovvero:

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- Numeratore: probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele obbligato, essendo il vero padre (Mendel,

0,5)

- Denominatore: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione tramette l’allele obbligato essendo il

vero padre (frequenza dell’allele nella popolazione, Hardy Weinberg - si guarda nel database la frequenza

di esso)

Essendo che si base un locus non è abbastanza per ottenere una informazione che abbai un peso rilevante

circa la compatibilità Osservata allora si considerano più loci: (CPI) - si ottiene come prodotto dei singoli PI.

Un calore di CPI maggiore di 100 viene considerato abbastanza alto da ritenere il padre effettivo.

DIAGNOSI MALATTIE GENETICHE

Si parte da acidi nucleici (dna o rna), proteine, cromosomi, metaboliti o altri prodotti genici e si fa un test

genetico.

I test genetici sono utili per l’identificazione dei portatori sani, la diagnosi e la prognosi di malattie ereditarie,

la predizione rischio-malattia e la correlazione genotipo-Fenotipo.

I test diagnostici consentono di stabilire una diagnosi o si confermare un sospetto clinico in un individuo già

affetto - quindi ho un sospetto e lo confermo con un test diagnostico. Spesso prevedono un’analisi

citogenetica per individuare un’anomalia cromosomica e possono essere effettuati durante il periodo

prenatale, peri natale o durante tt la vita.

I test preclinici - pre sintomatici sono applicati a malattie con esordio tardivo se il soggetto in quel è

asintomatico ma in realtà porta la mutazione.

I test predittivi sono quei test per l’individuazione di un genotipo che non causa direttamente la malattia ma

che nel caso di specifiche condizioni ambientali aumenta il rischio di sviluppare una patologia. Come il deficit

i da glucosio 6 fosfato deidrogenasi (favismo).

I test per identificazione degli eterozigoti vengono fatti x individuare i portarti sani di una malattia recessiva

che pero al 25% potrebbero trasmetterla al figlio.

È meglio utilizzare dna o rna per i test genetici? Il dna è piu facile da ottenere da qualsiasi cellula ed è piu

stabile dell’RNA - se si volesse analizzare ad esempio una mutazione a carico di un sito di splicing si

dovrebbe utilizzare l’RNA che pero deve passare per cDNA ma per farlo ce bisogno di grosse quantità di

RNA. Inoltre esso è espresso in maniera differente in tutte le cellule. Il dna è il miglior materiale di partenza.

MUTAZIONI NOTE

Per verificare la presenza di una o più varianti note e specifiche - si sa già dove cercare x la mutazione -

fattori importanti pg 141 x me non sono così importanti.

Quali sono le metodologie?

Utilizzo di RFLP - se la mutazione crea o abolisce un sito di restrizione

1. PCR allele specifica (ARMS)

2. OLA

3. PCR quantitativa nel caso di delezioni o inserzioni

4.

1 - ANALISI DI RESTRIZIONE - RFLP

Ad esempio un soggetto con mutazione del gene CFTR crea un sito di restrizione per l’enzima DdE1 che va a

tagliare nel caso di mutazione. Nei Soggetti normali il prodotto della pcr non viene tagliato e quindi avrà peso

molecolare piu elevato, mentre nei soggetti eterozigoti avremo 3 bande e in quello omozigoti 2.

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Non sempre però le mutazioni generano o tolgono un sito di restrizione e a volte è possibile inserirne uno

artificiale x mutagenesi mediante PCR. Ad esempio nell’anemia di Fanconi di tipo C si ha una mutazione In un

introne che va a variare l’adenina con una timina e non si va a generare un sito di restrizione - si generano

due primer, il forward che è normale e si appaia affianco al sito di interesse, e il reverse che invece contiene

una variazione di base che permetterà di generare un sito di restrizione.

In una situazione normale quindi grazie a sequenza normale e a primer reverse modificato si genererà il sito

di restrizione per l’enzima sca1, mentre nel caso di mutazione no, perche la T al posto della A mi abolisce

totalmente il sito.

2 - PCR ALLELE - SPECIFICA (ARMS: amplification Refractory mutation sistem)

Tutto si basa sul fatto che nella PCR è essenziale avere un appaiamento perfetto per l’ultima base in 3’ tra

sequenza e primer - grazie a questo si può identificare una mutazione andando a creare un primer che si

appaia perfettamente alla sequenza wt e un primer che si appaia perfettamente a quella mutata e si andrà a

vendere quale si amplifica. 5 3

3 - OLA (oligonucleotide ligation assay)

Permette di andare ad evidenziare quegli alleli che differiscono di una sola base. Si producono due primer

che sono fiancheggiati e complementari alla sequenza target. Il primer al 5’ ha l’ultima base che deve

corrispondere al sito in cui avviene al mutazione e ha la sua estremità in 5’ che è associata a del materiale

inerte (ossido di petaetilene, che aumenta il peso molecolare del prodotto di legazione), mentre l’altro primer

che è fiancheggiante il 3’ contiene al 3’ un marcatore fluorescente.

In presenza di dna denaturato i due primer di affiancano - in più si inserisce nella miscela una ligasi che

permetterà ai due filamenti di legarsi tra loro Ma funziona solo se si due filamenti si sono appaiati

completamente alla sequenza complementare. Si osserverà il prodotto della ligazione attraverso elettroforesi

capillare.

Questo era nel caso di una non mutazione con i due primer che non contengono il sito della mutazione.

Se invece la mutazione ce si usa un secondo primer che è uguale a quello di prima in 5’ ma che ha la base

corrispondente alla mutazione e ha il modificatore del peso molecolare più pesante di quello wt.

Quindi se non si ha la mutazione il primer non wt non riuscirà a legarsi, se si ha la mutazione il primer wt non

riuscirà a legarsi - se siamo in condizioni di eterozigosi si avranno entrambi i primer legati e si avrà mobilità

elettroforetica diversa.

4 - MULTIPLEX LIGATION DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION MAI EFFILIIIIIII.nu

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online

Serve per verificare se ci sono delezioni o amplificazioni. Se creano degli oliogonucletiudi che si andranno ad

ibridare a varie regioni del gene. Sono sequenze vicine tra di loro quindi potranno far avvenire una legazione

- ci sono dei primer universali che non sono del nostro genoma ma che sono artificiali e poi ci sono degli

mummmm

stuffer, percio ad ogni bersaglio che analizzo mi da un determinato pm.

Faccio denaturare il mio dna e lo metto in presenza dei primer, poi faccio rinaturare e avvenire la ligazione - si

produrrà una miscela di frammenti legati che possono essere tt amplificati con la stessa coppia di primer. In

sostanza io inizialmente ho le mie sequenze che voglio analizzare che faccio legare con una sequenza

complementare che pero alle estremità contiene anche uno stuffer x determinare il pm e delle sequenze che

poi nella pcr mi fungeranno da sequenze universali per i primer. Lego tutto con una ligasi e poi faro una PCR

con i primer universali marcati, così da poter analizzare con sicurezza tutte le sequenze esoniche di quel gene

che sto analizzando.

Il risultato finale sara letto grazie alla fluorescenza dei frammenti Con piu o meno alto pm analizzati con

sequenziatore capillare. Se ho una delezione in una regione otterrò picchi molto piu bassi del previsto.

MUTAZIONI NON NOTE

1 - SEQUENZIAMENTO DIRETTO DEL DNA MEDIANTE METODICA SANGER

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Metodo piu usato per la ricerca di mutazioni - si identifica il gene candidato e si amplificano nei pazienti i

singoli esoni, sottoponendoli ad analisi mediante Sanger.

Si posizionano i primer entro le 20 pdb dall’estremita dell’esone di interesse e si ottiene un

elettroferogramma.

In caso di sostutuizione si noterà una base sostituita rispetto a quella standard. Si ha un problema nel caso di

frameshift perche si hanno dei doppi picchi perche si ha il sequenziamento sull’allele mutato e su quello wt.

Questa tecnica si usa per lo studio di un solo gene di pochi esoni.

2 - NEXT GENERATION SEQUENCING

Toglie i problemi riscontrati in Sanger - è un sistema di sequenziamento massivo ed indiscriminato