Trascrizione Eucarioti e Procarioti

TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Promotore: contiene solo due consensi, entrambi formati da sei coppie di basi

 Consenso -10: si trova a partire dal nucleotide -10; uguale in tutti i

o promotori ed è formato da adenine e timine

Consenso -35: si trova più a monte, a livello del nucleotide -35; è

o specifico di ogni promotore e viene riconosciuto da una determinata

subunità σIV

Quando il consenso -35 è difettoso è presente ancora più a monte

 un altro consenso, l’UP ELEMENTO, a cui si lega direttamente la

RNA-polimerasi tramite le subunità α e nel particolare grazie alle

code α-carbossi-terminale. Ha lo scopo di aiutare il corretto

posizionamento della RNA-polimerasi

In alcuni casi la sequenza -35 e l’elemento UP mancano e si trova una

o sequenza -10 più grande e ciò permette a determinate subunità σ di

posizionare correttamente la RNA-polimerasi.

Nel momento in cui la σIV penetra in modo specifico a livello del -35 la σII si

 appoggia alla sequenza -10 e il peso della RNA-polimerasi è sbilanciato sulla

sequenza -10 causando l’apertura meccanica della doppia elica (dove, non a

caso, c’è una elevata presenza di adenine e timine)

La denaturazione avviene dal nucleotide -10 al +3 e rimane sempre lo stesso,

 con 14 coppie di basi aperte costituendola bolla trascrizionale

NB – non sono necessarie le SSB perché il DNA a singolo filamento si

o trova all’interno dell’RNA-polimerasi e non ha bisogno di essere protetto;

né sono necessarie elicasi perché le coppie di basi vengono denaturate di

volta in volta per una proprietà intrinseca della RNA-polimerasi

Il processo di trascrizione avviene in quattro step: fase di pre-inizio (la più

 critica), fase di inizio, fase di allungamento, fase di terminazione

1. FASE DI PRE-INIZIO

È la più complessa, deve permettere il corretto posizionamento della RNA-

 polimerasi sul promotore

La direzionalità del gene è individuata dai due consensi, prima -35 e poi -10

 Si viene a formare il COMPLESSO BINARIO CHIUSO (costituito da RNA-

 polimerasi e DNA non ancora aperto) che è un complesso reversibile fino a

quando non incontra il promotore corretto

Si verifica una deformazione conformazionale all’interno della RNA-polimerasi

 che provoca l’apertura della doppia elica e formazione della bolla trascrizionale

Si forma così il COMPLESSO BINARIO APERTO e da questo momento l’RNA-

 polimerasi subisce una modifica conformazionale per cui le pinze, superiore ed

inferiore, si chiudono sulla doppia elica di DNA a livello del canale downstream

Questo processo non richiede energia ed è spontaneo, prende il nome di

o ISOMERIZZAZIONE DELLA RNA-POLIMERASI

Quindi si cominciano ad introdurre i vari nucleotidi ma non si è ancora nella fase

 di trascrizione dato che quando l’RNA-polimerasi ha polimerizzato 8/9 nucleotidi

(detti INIZI ABORTIVI) torna indietro e non può proseguire perché è associata

alla subunità σ che la tiene ancorata al DNA

Si passa quindi dal complesso binario aperto al COMPLESSO TERNARIO

 APERTO dato che sono presenti DNA aperto, RNA-polimerasi e RNA aperto

neosintetizzato (che verrà rilasciato)

Dopo una serie di inizi abortivi, quando riesce ad introdurre il decimo

 nucleotide, si stacca dalla subunità σIII e si passa alla fase di allungamento

2. FASE DI ALLUNGAMENTO

La subunità σ una volta che si è dissociata dalla RNA-polimerasi perde anche

 affinità per il promotore e quindi a sua volta si dissocia per andare a legarsi ad

un altro core enzimatico e riprendere un nuovo ciclo

La RNA-polimerasi, solo come core, va ad allungare la trascrizione e a

 sintetizzare l’RNA

Essa si trova associata a FATTORI DI ALLUNGAMENTO:

 Proteina GRE A e B: Trattasi di una proteina che valuta la corretta

o geometria dell’ibrido RNA-DNA e induce un tipo di correzione che è

l’editing dell’RNA; Ne esistono di due tipi:

Editing-pirofosforolitico: immediato; reazione inversa a quella

 di polimerizzazione; il pirofosfato dell’ultimo nucleotide (errato)

incorporato viene sfruttato per esercitare una reazione inversa

mediante l’ossigeno ionizzato nel fosfato β il quale esegue un

attacco nucleofilo sul legame fosfo-estereo a 3’ riformando così un

nucleotide trifosfato che si stacca dall’RNA in crescita, eliminando

l’errore e permettendo l’ingresso del nucleotide corretto.

Editing-idrolitico: tardivo; individua il missmatch e richiama

 endonucleasi che tagliano l’RNA sintetizzato

NUSA: (sostituisce σ) favorisce pause durante le quali avviene l’editing

o NUSG: fa ricominciare la RNA-polimerasi dopo le pause

o

3. FASE DI TERMINAZIONE

Alla fine dell’operone sono presenti specifiche sequenze di terminazione, i

 TERMINATORI, e ne esistono di due tipi

RHO INDIPENDENTI (intrinsechi): nel DNA sono presenti due sequenze

o ripetute invertite distanziate da una porzione variabile (STRUTTURA A

DIADE); Il trascritto formerà la STRUTTURA A FORCINA che rappresenta il

segnale di terminazione dato che l’appaiamento tra stampo e RNA si

riduce da 9 a 3 basi; L’RNA-polimerasi cambia quindi conformazione e

rilascia l’RNA neosintetizzato (NUSA favorisce la terminazione)

RHO DIPENDENTI: è una proteina con attività elicasica che necessità di

o ATP; Si lega al sito RUT (che contiene poche guanine e molte citosine),

cammina lungo l’RNA, incontra il terminatore, si dissocia e con la sua

attività elicasica libera l’RNA dal DNA.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

I geni sono sempre singoli e ognuno contiene a monte una sequenza di

 regolazione

A valle del promotore è presente la sequenza codificante, quindi inizialmente

 c’è un primo tratto che è presente nel messaggero ma non è tradotto dai

ribosomi, la regione 5’ UTR

Segue quindi il codone di start e poi il messaggio che nella maggior parte degli

 eucarioti è interrotto da porzioni chiamate ESONI (sequenze che fuoriescono dal

nucleo per essere tradotte e quindi contengono il messaggio molecolare) che si

intervallano agli INTRONI (che saranno rimossi durante il processo di

MATURAZIONE DEL MESSAGGERO; alcune funzionano da RNA regolatore)

Dopo il codone di stop, ovvero l’ultimo esone, sempre nel messaggero è

 presente un tratto che non viene tradotto, la regione 3’ UTR,

Promotore: più grande in termini di coppie di basi e contiene molti più

 consensi a cui si legano proteine che coadiuvano il processo della trascrizione

(soprattutto pre-inizio). Alcune di queste sequenze sono particolari perché vi si

legano delle proteine che funzionano da interruttori molecolari, i FATTORI DI

TRASCRIZIONE INDUCIBILI, che possono essere:

Enhancer: se intensificano la velocità di trascrizione basale

o Silencer: se inibiscono il processo di trascrizione

o

Sequenze di consenso presenti a livello del promotore:

 -26 e -30 → TATA box: consenso basale, fondamentale per il corretto

o posizionamento della RNA-polimerasi; ha posizione variabile a seconda

del promotore; è costituita da 4 subconsensi:

BRE: o elemento di risposta al fattore B (importante per

 individuare la direzionalità del gene); a monte del TATA

TATA: la TATA box vera e propria, vi si verifica l’apertura

 meccanica della doppia elica e quindi la formazione della bolla di

trascrizione

-60 → CAAT box: vi si legano particolari proteine che rendono più

o efficiente la trascrizione

-90 → GC box: ripetizioni della sequenza GC e vi si legano proteine che

o rendono efficace ed efficiente la trascrizione stessa;

INIZIATORE: che contiene il primo nucleotide che deve essere trascritto

o e dove si posizionerà il sito attivo della RNA-polimerasi

+30 → DPE: presente nei promotori privi di TATA box

o ELEMENTO A VALLE: a cui si legano subunità di specifici fattori di

o trascrizione basali, in modo che venga posizionata correttamente la RNA-

polimerasi.

FATTORI DI TRASCRIZIONE BASALI: hanno il compito di posizionare

 correttamente l’RNA-polimerasi II e quindi di indurre il passaggio dalla fase di

inizio a quella di allungamento:

1. TF II D: fattore multiproteico, costituito da 1 TBP (Tata Binding Protein) + 11

TAF; è la proteina chiave che riconoscere il TATA box

a. La TBP si lega al TATA box e penetra a livello del solco minore;

b. Ciò causa una inclinazione del DNA che si appiattisce

c. L’appiattimento causa una tensione tale che viene scaricata mediante la

rottura meccanica dei legami idrogeno a livello dei nucleotidi T-A e si ha

la formazione della bolla di trascrizione

d. Le proteine TAF quindi espongono dei gruppi chimici che richiamano altri

fattori ↓

2. TF II A: si lega a monte delle TATA, a livello del BRE e interagendo con le

proteine TAF espone nuovi gruppi chimici che richiamano ↓

3. TF II B: si lega a livello del solco maggiore su BRE e sul TATA box a livello del

solco minore

4. Questa asimmetria fa in modo che tutti i fattori di trascrizione presenti formano

una piattaforma che indica ai successivi qual è la direzionalità della trascrizione

5. Gli specifici gruppi chimici della piattaforma che si è venuta a creare richiamano

un quarto fattore

6. TF II F: presenta due braccia con una delle quali lega la RNA-polimerasi II e con

l’altra riconosce i gruppi chimici della piattaforma; dunque non fa altro che

portare la RNA-polimerasi sul promotore e quindi la posiziona in modo tale che il

primo nucleotide si trovi a livello del sito attivo

7. A questo punto vi è il COMPLESSO BINARIO APERTO, c’è già la bolla

trascrizionale e quindi la RNA-polimerasi inizia subito la trascrizione

8. Anche in questo caso, però, si hanno diversi INIZI ABORTIVI, dato che è

bloccata dai fattori di trascrizione fino a quando non interviene ↓

9. TF II E: si localizza a livello della pinza superiore ed espone gruppi chimici che

richiamano ↓

a. TF II H: ha attività elicasica ed è costituito da 9 subunità, una di queste è

la CDK-7: che ha attività chinasica e fosforila la regione C-terminale

(o CDT) della RNA-polimerasi II in modo tale che si stacchi dai fattori di

inizio

10.In questo modo, senza più essere legata ai fattori, l’RNA polimerasi può

proseguire, introdurre il primo nucleotide e si passa dalla fase di inizio a quella

di allungamento

FATTORI DI ALLUNGAMENTO

 Sono fattori che partecipano e mediano la trascrizione dei geni eucariotici che

 codificano pe