Riassunto esame biologia, prof Modesti, prof. Modesti, libro consigliato Il mondo della cellula di Becker

Codice genetico e trascrizione

Dogma centrale della biologia

(Crick): DNARNAproteine. Un segmento di un filamento di DNA agisce come stampo per la sintesi di una molecola di RNA, che a sua volta dirige la sintesi di una particolare proteina. I processi coinvolti sono replicazione del DNA, trascrizione dell’informazione portata dal DNA nella molecola di RNA e la traduzione di questa informazione dall’RNA alla proteina. Eccezioni: virus a RNA (es. HIV) dotati di trascrittasi inversa.

Codice genetico

Il codice genetico è una serie di regole che definiscono una relazione tra sequenza di basi nucleotidiche delle molecole di DNA e l’ordine lineare degli amminoacidi nelle molecole proteiche. Venne individuato grazie alla scoperta che mutazioni nel DNA potevano portare a cambiamenti nelle proteine:

• Esperimenti di Beadle e Tatum con Neurospora crassa, un organismo capace di vivere in un terreno minimo; B&T trattarono colture di Neurospora con raggi X per indurre mutazioni genetiche, trattamenti che generarono ceppi mutanti incapaci di sopravvivere nel terreno minimo, ovvero avevano perso la capacità di sintetizzare alcuni aminoacidi o vitamine. Dato che aminoacidi e vitamine sono sintetizzati attraverso vie metaboliche, ciascuna mutazione corrispondeva all’inattivazione di un unico enzima, che catalizzava un passaggio responsabile della sintesi di uno specifico composto  Corrispondenza diretta tra ogni mutazione genetica e la perdita di uno specifico enzima: un gene-un enzima.
• Studi di Pauling sull’anemia falciforme; decise di studiare l’emoglobina, la principale proteina dei globuli rossi. Essendo l’emoglobina una molecola carica, la sottopose a elettroforesi e scoprì che l’emoglobina delle cellule falciformi migravano con una velocità diversa rispetto all’emoglobina normale, dunque le due proteine avevano cariche diverse  amminoacidi hanno cariche  la differenza tra le due proteine era nella composizione amminoacidica. Grazie a uno stratagemma di Ingram si scoprì che le due proteine differivano per un solo peptide: valina nella emoglobina falciforme al posto di un acido glutammico. Nuova formulazione dell’assioma un gene-un enzima: 1) l’emoglobina non è un enzima 2) ogni gene codifica per la sequenza di una catena polipeptidica e non necessariamente per una proteina completa  un gene-un polipeptide.

Gene

Unità funzionali del DNA che codificano per la sequenza amminoacidica di uno o più polipeptidi (o per uno o più tipi di RNA che svolgono funzioni diverse da quella di specificare la sequenza amminoacidica di catene polipeptidiche). Data la relazione di sequenza fra il DNA e le proteine la domanda è: quanti nucleotidi sono necessari per specificare ciascun amminoacido in una proteina?

Informazione nel DNA

L’informazione nel DNA deve essere contenuta nella sequenza dei quattro nucleotidi che costituiscono il DNA stesso: A, T, G e C. Queste sono le lettere dell’alfabeto del DNA. Il linguaggio del DNA deve contenere almeno 20 parole, una per ciascuno dei 20 amminoacidi che compongono le molecole proteiche. La parola del DNA codificante deve essere composta da più di un nucleotide. Un codice a doppiette non sarebbe sufficiente in quanto le diverse combinazioni sarebbero 4²=16. Con tre nucleotidi per parola, il numero di parole che può essere prodotto è 4³=64 differenti combinazioni! Più che sufficiente!

EVIDENZA MATEMATICA: Il codice genetico è a triplette, degenerato, non sovrapposto. È un insieme di regole (64 regole) universali per tutti gli organismi viventi che tutte le cellule conoscono e applicano quando devono trascrivere un amminoacido.

Evidenza scientifica della natura a triplette

Crick e Brenner utilizzarono un virus, il batteriofago T4 il cui genoma veniva mutato con dei mutageni chimici, le acridine, che portano all’aggiunta o alla rimozione di un nucleotide. Una mutazione nel genoma, quindi nel DNA, verrà trasmessa anche agli RNA.

La proflavina, è un’acridina che muta il DNA nei batteriofagi T4, attraverso 'mutazioni frame-shift/mutazioni per scivolamento della cornice di lettura'. Sono mutazioni puntiformi perché riguardano un nucleotide. Dal punto in cui c’è l’aggiunta o la sottrazione del nucleotide, gli amminoacidi sono errati e la proteina non sarà funzionale. Gli studiosi notarono che nel momento in cui si inducevano 3 mutazioni, la cornice di lettura non risultava alterata completamente, ma la mutazione riguardava solo una piccola parte del genoma.

Decifrazione del codice genetico

Dovendo attribuire il significato a ciascuna tripletta, sono partiti dalle triplette monotone (cioè con i tre nucleotidi uguali). Lo stampo usato inizialmente era un polinucleotide sintetico monotono, un mRNA fatto da un unico nucleotide, l’uracile UUU. In questo modo, non avevano problemi in quanto questi codoni avrebbero codificato una sola proteina. Trovarono che una sequenza monotona di UUU codificava la fenilalanina. Allo stesso modo trovarono che la sequenza monotona di AAA codificava la lisina, CCC  prolina. Le triplette GGG creavano però dei problemi e non fu possibile trovare l’amminoacido sintetizzato.

Trascrizione e traduzione nei procarioti e negli eucarioti

Nei procarioti, trascrizione e traduzione sono spazialmente e temporalmente unite. Negli eucarioti, invece, avviene prima la trascrizione nel nucleo e poi la traduzione nei ribosomi nel citoplasma. Tra questi primi due processi ce ne sono altri e sono dei processi di maturazione. Quindi nei procarioti non si parlerà di modificazioni/maturazioni post-trascrizionali.

Trascrizione

Sintesi di RNA diretta da DNA

• È la prima fase, cronologicamente parlando, del dogma centrale della biologia. Non è una traduzione, intesa come cambio di un linguaggio (come avviene nella traduzione dove da un linguaggio di nucleotidi si passa a un linguaggio di amminoacidi) perché si passa da DNA a RNA. In questo processo anabolico l’energia è fornita, come nella duplicazione, dall’uso di nucleotidi con 3 gruppi fosfato come monomeri di base (l’idrolisi di questi gruppi fosfato fornisce energia).
• Tra i due filamenti di DNA, solo uno farà da stampo e ciò non è indifferente in quanto se venissero presi filamenti diversi verrebbero fuori RNA diversi. È importante quindi che la polimerasi identifichi qual è il filamento giusto che deve fungere da stampo da trascrivere.
• La trascrizione richiede: RNA polimerasi, DNA stampo, ribonucleosidi trifosfati (ATP, GTP, CTP, UTP), fattori di trascrizione (non presenti nei procarioti).
• Nei procarioti c’è solo una RNA polimerasi che trascrive tutti i geni per tutti i tipi di RNA, mentre negli eucarioti ce ne sono 3.

Come avviene la trascrizione?

A monte del gene da trascrivere c’è il promotore a cui si lega l’enzima RNA polimerasi. Questo stesso legame permette all’enzima di aprire la doppia elica (non come nella duplicazione, dove viene usato l’enzima elicasi). Dopo che l’RNA polimerasi si lega al promotore inizia la trascrizione. Non c’è bisogno di un innesco e quindi, pur essendo l’RNA polimerasi un enzima che lavora in direzione 3’5’ come la DNA polimerasi, non ha bisogno di una sequenza iniziatrice.

Procarioti

Nei procarioti c’è una sola RNA polimerasi che è un grosso enzima costituito da diverse subunità: alfa, beta, beta primo e sigma. Il fattore sigma si attacca all’oloenzima e serve per far partire la trascrizione nel punto giusto sul promotore.

Come la DNA polimerasi era in grado di correggere gli errori (capacità di proof-reading), anche l’RNA polimerasi è in grado di effettuarli, ma sono più libere di fare errori, nel senso che questa ‘’eccezione alla severità del processo’’ è permessa in quanto biologicamente meno rilevante. L’RNA polimerasi trascrive più volte un gene, non come la DNA polimerasi che fa la duplicazione una sola volta per ogni cellula e quindi deve essere più accurata.

Come nella duplicazione, anche nella trascrizione, a seguito della parziale apertura della doppia elica, si generano dei superavvolgimenti che vengono rilassati dalle topo isomerasi. Ci sono diverse fasi:

• Legame: legame dell’RNA polimerasi a un sito promotore (una specifica sequenza di basi che determina dove debba iniziare la sintesi di RNA e quale filamento debba essere trascritto). Convenzionalmente il promotore viene detto ‘’a monte’’ della sequenza trascritta. Le caratteristiche fondamentali del promotore sono: sito di inizio (di solito un adenina), le due sequenze di sei nucleotidi a -10 e a -35.
• Inizio: una volta che le molecole di RNA polimerasi si sono legate a un sito promotore e in quel punto la doppia elica del DNA si è srotolata, comincia la fase di inizio della sintesi di RNA. Uno dei due singoli filamenti viene usato come stampo, usando ribonucleosidi trifosfati (NTP) come substrati. Non appena i primi due NTP sono uniti con legami idrogeno alle basi complementari del filamento di DNA stampo al sito di inizio della trascrizione, l’RNA polimerasi catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico tra il gruppo ossidrilico in 3’ del primo NTP e il fosfato al 5’ del secondo. La polimerasi, man mano che vengono aggiunti altri nucleotidi, si muove lungo il promotore fino alla fine.
• Allungamento: ora l’RNA polimerasi procede lungo la molecola di DNA, la cui elica si srotola poco alla volta. L’enzima si muove lungo il filamento di DNA stampo in direzione 3’5’. Dato che l’appaiamento delle basi complementari tra questo stampo e la catena di RNA che si sta neosintetizzando, il filamento di RNA viene allungato nella direzione 5’3’, così ciascun nucleotide successivo viene aggiunto al 3’. Mentre la catena di RNA cresce, gli ultimi nucleotidi aggiunti rimangono appaiati al filamento di DNA stampo, creando un corto ibrido. Naturalmente è solo un tratto (meno di 10 nucleotidi) di RNA che resta attaccato.
• Terminazione: l’RNA polimerasi arriva in fondo all’unità di trascrizione, trova il gene terminatore e finisce il proprio lavoro. Il DNA stampo si riappaia all’altro filamento. Esistono due modi per terminare la trascrizione in base all’utilizzo o meno di una particolare proteina, fattore rho:
  • Fattore rho che si lega all’RNA polimerasi che si stacca dal filamento stampo. Questo accade in alcuni geni.
  • Ci possono essere delle unità finali del gene ricche di guanina e citosina e nell’RNA trascritto si forma una struttura a forcina (doppia elica intrafilamento grazie ai legami a ponte di idrogeno). Questa zona ricca di guanine e citosine è seguita (nel filamento stampo) da un’altra sequenza ricca di adenina. Questa è la zona in cui il legame con l’uracile del RNA sintetizzato è molto debole e quindi il complesso riesce a staccarsi facilmente.

Trascrizione eucariotica

Differenze fondamentali con la trascrizione procariotica:

• Differenti RNA polimerasi.
• Promotori eucariotici più diversificati.
• Necessario intervento di fattori di trascrizione.
• Interazioni proteina-proteina.
• Necessaria maturazione del RNA.

Diversi tipi di RNA polimerasi

• RNA polimerasi di tipo 1 che trascrive i geni che codificano l’rRNA 28S 18S 5,8S.
• RNA polimerasi di tipo 2 che trascrive i geni che codificano l’mRNA e il microRNA.
• RNA polimerasi di tipo 3 che trascrive i geni che codificano il tRNA, rRNA 5S, snRNA.
• RNA polimerasi mitocondriale.
• RNA polimerasi dei cloroplasti.

Queste tre forme di RNA polimerasi sono dette isoforme. I promotori possono essere orientati in direzioni opposte e i filamenti trascritti saranno diversi tra di loro.

Negli eucarioti ci sono vari tipi di promotori a seconda di quale forma di RNA polimerasi deve legarsi: RNA polimerasi I consta di due parti, un promotore core posizionato a cavallo del sito di inizio e un elemento di controllo a monte. Dopo il legame degli appropriati fattori di trascrizione a entrambe le regioni, la RNA polimerasi si lega al promotore core. RNA polimerasi II ha una corta sequenza iniziatrice Inr (che consiste in una sequenza di pirimidine), in combinazione con una TATA box. RNA polimerasi III ha promotori che si trovano a valle della sequenza di inizio.

RNA polimerasi sono grossi enzimi classificati in base alla sensibilità al veleno 'amanitina':

• RNA polimerasi I molto sensibile.
• RNA polimerasi II non molto sensibile.
• RNA polimerasi III ancora meno.

Questi enzimi lavorano tutti nel nucleo, ma l’RNA polimerasi I lavora in modo specifico nel nucleolo (zona in cui si assemblano i ribosomi, quindi lavora con l’rRNA). La II e la III lavorano nel nucleoplasma.

Fattori di trascrizione

(indicati con TF) sono proteine sempre richieste affinché l’RNA polimerasi possa legarsi al promotore, o a sequenze distanti a monte del promotore, e iniziare la trascrizione:

• RNA poli I richiede un fattore proteico che riconosce una sequenza di 18 nucleotidi.
• RNA pol II richiede più fattori:
  • Fattori di trascrizione generali che insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, che lega il promotore essenziale ed è sufficiente alla trascrizione. Es. TFIID, TFIIA e TFIIB.
  • Fattori di trascrizione specifici: servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale:
    • Riconoscono sequenze specifiche a monte del promotore.
    • Multipli fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene.
• RNA pol III non richiede fattori proteici ma dipende da una regione ricca di UUU.

Trascritto primario

Molecola di RNA appena prodotta dalla trascrizione. Maturazione dell’RNA: tutte le modificazioni chimiche necessarie per produrre un RNA funzionale.

Tipi di RNA

• RNA ribosomiale costituisce i ribosomi 70-80%.
• RNA di trasferimento tRNA porta gli AA ai ribosomi nella traduzione 10-20%.
• RNA messaggero mRNA porta il messaggio dal DNA ai ribosomi 10%.
• RNA trascritto primario hnRNA (RNA eterogeneo nucleare, contiene dei tratti che non verranno tradotti nella proteina).
• snRNA (small nuclear RNA) chiamati anche ribozimi.

Maturazione dell’rRNA

Trascritti da RNA pol I e RNA pol III (5S). Tre dei quattro rRNA sono codificati da una singola unità di trascrizione, sintetizzata nel nucleolo dalla RNA polimerasi I come unico trascritto primario chiamato pre-rRNA. Le sequenze di DNA che codificano per questi tre sono separate nell’unità di trascrizione da segmenti chiamati spaziatori trascritti, costituiti da sequenze ripetute (la presenza di una singola unità di trascrizione per tre geni diversi assicura la produzione di questi tre rRNA in quantità uguali).

La maturazione del pre-rRNA prevede numerose reazioni di taglio per rimuovere gli spaziatori trascritti. Viene rimosso circa il 48%. Il pre-rRNA viene anche maturato mediante l’aggiunta di gruppi metilici  metilazione. È stato visto sperimentalmente che la metilazione protegge specifiche regioni della molecola di pre-rRNA dal taglio. Vengono tagliati gli spaziatori trascritti (grazie a piccoli RNA che vengono poi degradati). I piccoli RNA che svolgono questo lavoro sono chiamati snRNA (small nucleolar) e sono ribozimi (RNA con attività enzimatica catalitica).

• La maturazione del pre-rRNA nel nucleolo è accompagnata dall’assemblaggio dell’RNA con le proteine per formare le subunità ribosomali.
• Una volta assemblate le due subunità, vengono esportate nel citoplasma.

Maturazione del tRNA

RNA pol III. I tRNA sono macromolecole molto piccole (<100 nucleotidi). Grazie alla presenza di nucleotidi intrafilamento complementari, le basi si appaiano con legami idrogeno che danno vita a strutture ad ansa, contribuendo a formare una struttura secondaria a trifoglio. Le zone in cui ci sono nucleotidi complementari formano una sorta di struttura a doppia elica. Grazie a questa particolare struttura secondaria, le estremità 3’ e 5’ sono vicine.

• L’estremità 3’ OH è molto importante perché nella sintesi corretta è lì che l’amminoacido verrà attaccato (l’amminoacido che deve essere portato è stabilito dal codone, secondo le regole del codice genetico).
• C’è la regione anticodone (o ansa dell’anticodone) le cui basi si appaieranno ai codoni dell’mRNA, ovvero la sequenza sarà complementare a quella del codone (che porterà la tripletta per lo specifico amminoacido).

La struttura terziaria è a forma di L.

Come avviene la maturazione del tRNA?

1. Al 5’ una corta sequenza leader di 16 nucleotidi è rimossa.
2. Al 3’ OH la doppietta UU viene sostituita con la tripletta CCA, che è la tripletta che serve per unire l’amminoacido giusto da parte dell’enzima amminoacil sintetasi.
3. Modificazioni dei nucleotidi (circa il 10-15% viene modificato): i nucleotidi del tRNA vengono modificati chimicamente in fase post-trascrizionale: metilazione (sia di basi che di zuccheri a livello di ribosio, uracile, adenina, guanina, producendo ribotimidina), formazione di basi insolite come diidrouracile, ribotimidina, pseudouridina e inosina.
4. Escissione di un introne all’interno dell’ansa dell’anticodone.

La cellula riesce a tradurre tutti i codoni con un numero inferiore a 61 triplette. Cioè esistono 61 codoni nell’mRNA ma una trentina di anticodoni nel tRNA (ovvero esistono una trentina di tRNA diversi). Questo è possibile per l’ipotesi del vacillamento, per la presenza della base vacillante (3^o)  wobble hypothesis. Esistono tRNA che hanno lo stesso anticodone ma riescono ad appaiare con più codoni diversi grazie a variazioni nella base 3^o nella tripletta che determina un amminoacido specifico.