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DNA.

L'oncosoppressore p53

La proteina p53 è un fattore di trascrizione, cioè esprime la sua azione attraverso la trascrizione di

nuovi geni, che regola il ciclo cellulare, è codificata dall'omonimo gene, che è il più studiato al

mondo per il fatto che oltre a regolare varie fasi del ciclo, la sua azione è legata alla morte cellulare

e alla riparazione del DNA. P53 si comporta da oncosoppressore e mutazione a carico di questo

gene si trovano nei tumori umani. Il gene che codifica per questa proteina viene trascritto e tradotto

in tutte le cellule, ma la proteina corrispondente si trova in piccole quantità perchè è degradata dal

proteosoma, ubiquinata dalla E3 ligasi Mdm2 che è codificata da un proto-oncogene.

Amplificazioni del gene Mdm2 possono provocare la formazione di tumori. Quando p53 viene

fosforilata da Chk2 (chinasi 2 del checkpoint) provoca l'allontanamento di Mdm2 così da non esse

più ubiquinata da questa, p53 si accumula quindi nel nucleo e fa si che inizi la riparazione del DNA

con la trascrizione dei nuovi geni. Nel caso in cui il numero di mutazioni è talmente elevato da

rischiare comunque un riparo incompleto del genoma, la cellula decide di "suicidarsi" per il bene

dell'organismo, si evita quindi che possibili mutazioni che attivino proto-oncogeni siano trasmesse a

cellule figlie facendo aumentare il rischio di insorgenza di neoplasie tumorali.

Come già detto, p53 è un fattore di trascrizione vale a dire che esprime la sua azione attraverso la

trascrizione di nuovi geni, uno di questi è il p21 che svolge un ruolo fondamentale nel blocco del

ciclo, infatti inibisce i complessi Cdk-ciclina legandosi ad essi. Grazie a questo inibitore le cellule

bloccano il ciclo per avviare la riparazione del DNA. P53 è quindi fondamentale nel regolare

l'espressione di questo gene. Replicazione del DNA

Come è noto, il DNA è la molecola depositaria dell'informazione genetica che viene ereditata di

generazione in generazione. Le caratteristiche del DNA soddisfano a pieno il fluire

dell'informazione genetica. Il meccanismo con cui il DNA si replica, tiene conto anche della

possibilità di insorgenza di errori, che in tale ambito chiamiamo mutazioni e che opportunamente

selezione vengono inserite all'interno del genoma. La selezione delle mutazioni è alla base del

processo evolutivo.

Negli anni '40 la scarsa conoscenza morfologica della molecola di DNA rendeva difficile dimostrare

che essa fosse effettivamente la depositaria dell'informazione genetica. Solo dopo che Watson e

Crick descrissero la doppia elica, si capì chiaramente la sua funzione e si formulò un'ipotesi relativa

alla duplicazione. Tale ipotesi prevede la rottura dei legami idrogeno che tiene unite le due eliche in

modo che i singoli filamenti possano agire da stampo per la duplicazione di nuovi filamenti. Il

risultato è un modello semiconservativo della molecola di DNA.

Caratteristiche generali della duplicazione del DNA

Nella replicazione, il DNA funge da stampo, la sequenza nucleotidica di un filamento di DNA viene

infatti copiata mediante appaiamento complementare delle basi Adenina con Timina e Guanina con

Citosina, così da formarne un nuovo filamento complementare.

Questo processo avviene nel momento in cui ciascun nucleotide nel filamento stampo di DNA

riconosce il nucleotide complementare libero (non polimerizzato) e nel momento in cui i due

filamenti della doppia elica si separano, creando una bolla di replicazione all'interno della quale si

svolgono tutte le attività legate alla replicazione. La separazione della doppia elica permette

l'appaiamento delle basi con l'appropriato nucleotide in arrivo, che viene allineato e polimerizzato.

Il primo enzima che polimerizza i nucleotidi, è il DNA polimerasi.

Negli anni '60 si scoprì una regione di replicazione che si muove lungo tutto il filamento di DNA,

questa regione ha una forma ad Y ed è stata chiamata forcella di replicazione; è proprio all'interno

della forcella di replicazione che il DNA di entrambi i nuovi filamenti viene sintetizzato grazie

all'azione di un complesso multienzimatico che contiene DNA polimerasi. In una bolla di

replicazione avremo ovviamente due forcelle, perchè i filamenti che si creano sono due, ogni

forcella procede sempre in direzione 5'P-3'OH. Il procedere delle forcelle è bidirezionale.

Affinchè le forcelle proseguino il loro percorso, il DNA si deve despiralizzare cosicchè possa

avvenire la separazione dei due filamenti, infine, per fare in modo che il DNA torni in forma

rilassata agiscono particolari enzimi chiamati topoisomerasi, in assenza di topoisomerasi potrebbero

crearsi dei grovigli che non permetterebbero l'avanzare delle forcelle. Esistono due tipi di

topoisomerasi: le topoisomerasi I che agiscono allentando la torsione del DNA tagliando solo uno

dei filamenti, dopo che il DNA si è rilassato viene poi riparato; le topoisomerasi II tagliano e

riparano tutti e due i filamenti.

Dal momento che tutti e due i filamenti vengono sintetizzati in direzione 5'P-3'OH, ce ne sarà uno

che segue la forcella e che quindi viene sintetizzato in modo continuo (filamento guida o leading

chain), e uno che invece viene sintetizzato man mano che si rende disponibile altro stampo e quindi

viene sintetizzato per frammenti chiamati frammenti di Okazaki (filamento ritardo o lagging chain).

Replicazione nei batteri

Inizio della replicazione

La replicazione del DNA inizia sul cromosoma batterico a partire da un sito specifico chamato

origine o oriC, questo sito d'inizio viene riconosciuto da una speciale proteina chiamata proteina

d'inizio o dnaA. L'interazione tra sito d'inizio e proteina d'inizio determina l'apertura della doppia

elica in un sito adiacente all'origine che è ricco in A-T, all'apertura della doppia elica intervengono

anche le elicasi, che sono delle proteine che si legano al DNA e promuovo la separazione dei due

filamenti. Per ogni giro che viene svolto, le elicasi utilizzano una molecola di ATP, ed è proprio per

questo che il sito d'origine si trova in una zona della cellula chiamata mesosoma, dove avviene la

sintesi di ATP. Successivamente alle elicasi, intervengono delle proteine, le SSB (single strand

binding, proteine che si legano ad un singolo filamento), che fanno in modo che la doppia elica del

DNA non si richiuda, infatti la grande presenza di legami idrogeno porterebbe ad una chiusura (pur

essendo i legami idrogeno deboli, nel momento in cui ce ne sono in abbondanza la loro forza

aumenta).

La continua apertura della doppia elica porta alla formazione di superavvolgimenti che se non

rimossi ostacolerebbero la duplicazione. Nei batteri agiscono quindi delle topoisomerasi II chiamate

girasi, che allentano continuamente la tensione del DNA.

Una volta che i due filamenti si aprono e la tensione del DNA è controllata, può iniziare l'azione

degli enzimi polimerizzanti.

Attività delle polimerasi

il primo enzima che agisce, è quello che crea un primer, che è un piccolo polinucleotide che procede

in direzione 5'P-3'P ed è legato al DNA tramite legami idrogeno. Dal momento che le polimerasi I II

e III non possono iniziare dal nulla la replicazione, questo primer è fondamentale affinchè cominci

la duplicazione. Il piccolo frammento polinucleotidico che fa da primer altro non è che un

frammento di RNA; l'RNA polimerasi DNA dipendente che è chiamata anche primasi, è l'enzima

che inizia ufficialmente la duplicazione del DNA. L'RNA polimerasi non necessita di un innesco e

forma un piccolo RNA formato da cinque-dieci nucleotidi consentendo alla DNA polimerasi III di

legare il primo desossiribonucleotide al 3'OH. Sulla leading chain (filamento guida), la DNA

polimerasi procede ininterrottamente seguendo la forcella, il discorso si complica invece nel caso

della lagging chain, per la quale è importante capire come mai venga utilizzato RNA come innesco.

Siccome all'inizio della replicazione c'è un'alta probabilità che si verifichino degli errori, gli RNA

utilizzati come primer verrano eliminati. Nella lagging chain che procede per frammenti, sono

necessari molti RNA primer, quindi la polimerasi III continua il suo percorso fino a quando non

incontra un nuovo innesco, a questo punto intervengono le polimerasi I e II che sono in grado di

eliminare l'RNA. Così ogni volta che la DNA polimerasi I agisce eliminando ribonucleotidi, colma

gli spazi vuoti con desossiribonucleasi.

Problemi connessi alla duplicazione per frammenti

Le polimerasi sono in grado di aggiungere progressivamente un nucleotide alla volta, i vari

frammenti che sono stati creati necessitano quindi di essere uniti, di ciò si occupa l'enzima ligasi.

La replicazione per frammenti è stata scoperta da Okazaki che estraendo il DNA di E. Coli vide che

ogni 1000-2000 nucleotidi si trovavano piccoli RNA, lo stesso esperimento inoltre permise di

capire che il DNA batterico è sintetizzato ad una velocità molto elevata, circa 500-1000 nucleotidi

al secondo, ciò permette alla cellula batterica di dividersi circa ogni 30 minuti.

La struttura del DNA pone un altro problema: la DNA polimerasi che polimerizza la leading chain

torna indietro sulla lagging chain? Ci sono ancora diverse ipotesi su questo argomento, la più

accreditata, quella di Alberts, è quella secondo cui la lagging chain crei un'ansa in modo da potersi

capovolgere e permettere alla polimerasi di poter polimerare anche su di essa con direzione 5'P-

3'OH contemporaneamente alla leading chain. La formazione dell'ansa eviterebbe alla DNA

polimerasi un viaggio a ritroso verso la lagging chain.

Attività esonucleasica della DNA polimerasi III: la correzione di bozze

Durante la replicazione del DNA è possibile che si verifichino degli errori nell'appaiamento delle

basi, in linea teorica degli errori avverrebbero con una frequenza di uno ogni dieci milioni di

nucleotidi, nella realtà però avviene con una frequenza 1000 volte minore, quindi uno su dieci

miliardi. Tutto ciò è dovuto al fatto che durante la trascrizione c'è attività enzimatica che si occupa

di correggere eventuali errori, si tratta dell'enzima correttore di bozze che è la DNA polimerasi III,

che possiede attività esonucleasica, ogni volta che si verifica un accoppiamento sbagliato, quindi

non si crea il legame idrogeno o comunque si verifica una situazione di instabilità, la DNA

polimerasi III blocca la polimerizzazione, depolimerizzando l'errore e solo dopo continuare l'attività

replicativa. All'attività di correzione della DNA polimerasi III si aggiungerà anche un'altra attività d