Riassunti di Citologia e Istologia

Università di Catania Luigi Fiorentino

Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

Riassunti di citologia e istologia

Contenuti del corso

Citologia

Caratteristiche biologiche della materia vivente. Aspetti biologici delle componenti inorganiche ed organiche della materia vivente: acqua, sali minerali, glucidi, lipidi, protidi, acidi nucleici. Cenni sui livelli di organizzazione della materia vivente.

La cellula eucariotica animale:

• La membrana plasmatica: Rivestimenti esterni. Le differenziazioni della membrana plasmatica: microvilli, ciglia e flagelli, sistemi di giunzione, membrana basale.
• Il citoplasma: Ialoplasma; ribosomi; reticolo endoplasmatico granulare e agranulare o liscio; apparato del Golgi; lisosomi; perossisomi; mitocondri; inclusioni citoplasmatiche; sostanze di riserva; pigmenti; il citoscheletro ed i suoi costituenti; l'apparato della sfera. Endocitosi ed esocitosi.
• Il nucleo ed i suoi costituenti: La parete nucleare; il nucleoplasma; organizzazione e funzioni della cromatina; i cromosomi; il nucleolo. Attività funzionale del nucleo: fase G1, S, G2 (cenni su: trascrizione, sintesi proteica, duplicazione del DNA). La divisione cellulare: mitosi, meiosi e gametogenesi (generalità).

Metodi e strumenti di indagine

• Osservazione diretta di cellule e tessuti viventi.
• Allestimento di preparati permanenti.
• Le principali colorazioni istologiche.
• Principi generali di citochimica ed istochimica.
• Microscopi ottici ed elettronici: principi di funzionamento e loro impiego in biologia.

Istologia

• I tessuti animali: classificazione e riconoscimento.
• I tessuti epiteliali di rivestimento: caratteristiche generali e classificazione.
• Epiteli ghiandolari: Origine e classificazione delle ghiandole; caratteristiche delle cellule secernenti e vari tipi di secrezione.
• I tessuti connettivi: Le caratteristiche della sostanza intercellulare: parte amorfa o sostanza fondamentale e fibre connettivali; le cellule dei connettivi. Tessuti connettivi propriamente detti. Connettivi di sostegno: cartilagine e tessuto osseo; processi di ossificazione. Tessuto adiposo.
• Sangue: Plasma ed elementi figurati. Endotelio e vasi sanguigni.
• Il tessuto muscolare: Liscio, striato scheletrico e cardiaco.
• Il tessuto nervoso: Vari tipi di neurone; struttura della cellula e delle fibre nervose; sinapsi interneuroniche e neuromotorie. La nevroglia.

Modulo di istologia

L'occhio umano può risolvere particolari fino a 200 micron (0,2mm), si tratta della risoluzione o limite inferiore di visibilità (ε), ovvero la minima distanza alla quale osserviamo distinti due punti vicini tra loro nello spazio. Tali punti messi ad una distanza superiore o uguale a ε si osserveranno distinti. La formula di Abbe ci indica come calcolare il limite inferiore di visibilità: ε = λ / 2n x senα, con lunghezza d’onda nello spettro del visibile. N sta per indice di rifrazione del mezzo, che normalmente è l’aria ed indica la capacità di deviare raggi luminosi secondo angoli più o meno pronunciati, esso dipende dalla densità del mezzo e dalle sue caratteristiche chimico fisiche (aria = 1; vetro = 1,5; olio di cedro = 1,5).

Talvolta, ad ingrandimento di 100x (la 100x / 40x etc. sta ad indicare l’ingrandimento dell’obiettivo) si può lavorare ad immersione nel vetrino, e tra la lente ed il vetrino stesso si rende necessario porre una goccia di olio onde evitare che vetrino e lente vengano a contatto. In quel caso il coefficiente N cambia.

Da ultimo, troviamo α l’angolo di apertura della lente obiettivo formato dai raggi luminosi. L’olio generalmente consente di convogliare nell’immersione, permette di aumentare l’apertura numerica rispetto a quando viene interposta aria, quindi aumenta sensibilmente il potere risolutivo. Con una lente di ingrandimento possiamo scendere fino a 20 micron, con la microscopia ottica scendiamo fino a 0,2 micron (200 nanometri).

Dobbiamo tenere presente della diffrazione della luce presente posta sotto al nostro preparato, un punto a questo microscopio è visibile non come tale ma solo come un cerchietto luminoso con diametro inferiore a ε. Con la microscopia elettronica si arriva a vedere i 0,2 nanometri (con i microscopi più evoluti).

Università di Catania Luigi Fiorentino

Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

I metodi di osservazione

Morfologico: microscopia ottica

Tale tipo di indagine è realizzata dalla microscopia ottica, che si prefigge di conoscere forma, dimensioni, distribuzione e organizzazione strutturale delle cellule e dei costituenti extracellulari. La microscopia ottica permette di risolvere e ingrandire oggetti piccoli e il mezzo attraverso il quale può essere ottenuta risoluzione o ingrandimento è lo spettro elettromagnetico della luce. I microscopi ottici utilizzano tutti delle lampade. Un fascio di luce attraversa il preparato e lo rende visibile. Durante le esercitazioni useremo il microscopio in campo chiaro.

Vari tipi di microscopi ottici

• Binoculare o stereomicroscopio: Serve per ottenere un ingrandimento grossolano del pezzo per poter fare il prelievo. Si possono vedere oggetti in 3D in toto, e si possono effettuare dissezioni per il prelievo di organi.
• In campo chiaro: Ci permetterà di osservare preparati fissati, disidratati, sezionati, inclusi in paraffina, sezionati e colorati. Esso sta alla base di tutti, fu il primo ad essere utilizzato, preparato da Anthony van Leeuwenhoek che ottenne un ingrandimento fino a 300 volte. Tuttavia, essendo la materia vivente ricca di acqua, questo danneggia la visione a questo tipo di microscopio che risulterà trasparente perlopiù. Più efficace per preparati freschi, come i fibroblasti in coltura, sarà il microscopio in contrasto di fase.

Si compone di uno stativo, come tutti i microscopi ottici, dagli oculari e una torretta porta revolver 4x, 20x, 40x e 100x, oculari e dagli obiettivi inseriti in un il tavolino traslatore ove si pone il vetrino e lo si ferma; il condensatore dove abbiamo la sorgente luminosa (il fascio luminoso viene condensato) viene inviato al preparato, raccolto dall’obiettivo e poi l’oculare. La macchina fotografica, la via indiretta per avere la fotografia del preparato. Accanto al condensatore si trovano i diaframmi che permettono di aumentare o diminuire l’intensità luminosa. Vite micrometrica e macrometrica ci permettono la messa a fuoco del nostro preparato.

Microscopio in campo chiaro

• Sistema a fluorescenza trasmessa: Il microscopio in cui possiamo utilizzare in campo chiaro o osservare a fluorescenza che proviene da una lampada a fluorescenza e una lampada a vapori di mercurio che illumina il preparato. I raggi luminosi attraversano mezzi differenti con coefficienti di rifrazione diversi. Il processo di visione avviene così: lampadina-lente del condensatore che concentra i raggi luminosi in un punto del preparato- aria- vetrino- lente dell’obiettivo e infine oculari.
• Microscopio fotonico: Il suo condensatore ha una lente biconvessa che serve a concentrare i raggi luminosi paralleli in un punto del vetrino, detto fuoco, la luce così attraversa il preparato e penetra nell’obiettivo. Gli oculari presentano delle lenti che presentano già un ingrandimento di circa 12/16x, di questo ingrandimento bisogna tener conto quando si fa la fotografia del preparato. Quindi o diamo l’ingrandimento dell’obiettivo oppure ci facciamo tutto il calcolo degli ingrandimenti degli oculari sommati a quelli della lente dell’obiettivo.
• Diaframmi: Si suddividono in diaframma di campo o a iride: servono a far passare la quantità di luce necessaria a illuminare l’intero campo visivo; diaframma di obiettivo: serve a far diminuire la quantità di luce che attraverso il condensatore raggiunge l’obiettivo e migliorare la profondità di campo. Gli obiettivi sono costituiti da lenti composte, ottenute accoppiando lenti convergenti e divergenti, migliorando il potere diottrico e compensando le aberrazioni. Gli obiettivi a secco hanno una lunghezza proporzionale al potere di ingrandimento, per cui utilizzando obiettivi più potenti la lente si avvicina al vetrino copri oggetto e ne consegue che una maggior quantità di raggi luminosi entrano nell’obiettivo facendo aumentare l’ampiezza dell’angolo alfa della legge di Abbe e quindi conseguente aumento dell’an e diminuzione del limite inferiore di visibilità.

Con l’ingrandimento 100x generalmente si utilizzano oli per l’immersione, ciò significa che la lente dell’obiettivo viene immersa nel nostro preparato ma non viene a contatto con esso per l’apposizione di una goccia d’olio tra essa e il preparato stesso. L’olio ha coefficiente di rifrazione uguale al vetro ciò consente di aumentare l’an (apertura numerica) rispetto a quella dell’aria e dunque aumenta il potere di risoluzione.

Microscopio in campo scuro

Ci permetterà di vedere delle differenze in chiaro-scuro perlopiù con batteri e cellule libere. Il preparato viene illuminato da raggi inclinati che lo colpiscono lateralmente. Abbiamo immagini dovute a raggi diffratti, il nostro campo ci appare nero mentre il preparato ci appare luminoso, chiaro. Ciò è permesso da un diaframma (disco opaco) posto al di sotto della lente del condensatore, che lavora solo sui raggi di luce non riflessi o diffratti e consente solo alla luce periferica di penetrare nell’obiettivo.

A contrasto di fase

Ci dà una certa tridimensionalità per preparati freschi di cellule e colture in vitro come i fibroblasti.

A luce polarizzata

Ci permette di vedere determinate strutture e studiare particolari tessuti come quello osseo e muscolare striato. Si utilizza la luce polarizzata ovvero luce che vibra su un solo piano. Monta due dispositivi di polarizzazione:

• Il polarizzatore: Montato sotto al condensatore;
• L’analizzatore: Posto tra obiettivo e oculare.

La modificazione del raggio incidente avviene quando questo passa attraverso un polarizzatore o prisma di Nicol o polaroide. Ci permette di osservare il tessuto muscolare striato scheletrico esso è dato dall’alternanza di bande isotrope (bande I isotrope o monorifrangenti) e bande A (bande anisotrope o birifrangenti) in cui l’indice di rifrazione e assorbimento della luce variano a seconda della direzione di provenienza della luce stessa e sono costituiti da molecole disposte in maniera ordinata. Si definiscono isotropie invece quelle parti/ bande/ in cui l’indice di rifrazione e assorbimento della luce sono sempre gli stessi per tutti gli assi di provenienza della luce e sono costituite da molecole disposte in maniera disordinata.

a b c sono strutture anisotrope perché vediamo come le molecole si dispongono ordinatamente su più piani. La figura D invece è una struttura isotropa.

Un campo di applicazione massima del microscopio a luce polarizzata è l’osteone del tessuto osseo. In una sezione trasversale di un osteone si può osservare la caratteristica croce di Sant’Andrea, vediamo una serie di lamelle concentriche e ordinate che compongono il tessuto osseo poi le parti scure date dalle fibre collagene che sono isotrope perché hanno una disposizione diversa e disordinata tra una lamella e l’altra dell’osteone orientate parallelamente o perpendicolarmente rispetto al piano di polarizzazione.

Così come anche nel tessuto muscolare striato troviamo la particolare struttura tra bande I isotrope e A anisotrope.

Microscopio a fluorescenza

Si usa anche per i batteri in divisione in cui vengono messi in evidenza particolari strutture sfruttando la capacità di alcune cellule di emettere bioluminescenza se eccitate dalla luce. Illuminiamo il nostro preparato con luce ultravioletta ad una determinata lunghezza d’onda. Il preparato viene eccitato e le cellule, non tutte, emettono fluorescenza.

È una proprietà per la quale alcune molecole colpite da luce a 250/400 nanometri, eccitate, emanano in risposta un fascio di luce fluorescente che rientra nello spettro del visibile. La sorgente della luce ultravioletta è una lampada a mercurio. Le immagini ci appariranno colorate su fondo scuro, e il colore della luce di fluorescenza dipende dal filtro di eccitazione che seleziona le lunghezze d’onda necessarie per eccitare le molecole o i fluorocromi o dal fluorocromo stesso.

La fluorescenza decade più o meno rapidamente (quenching) in quanto queste molecole trasferiscono l’energia ad altre molecole circostanti sottoforma di agitazione termica, tornando così allo stato fondamentale. La luce accentua questa dispersione quindi i preparati vengono allestiti, conservati e osservati in penombra e al buio. Ogni molecola fluorescente ha un proprio spettro di eccitazione (gamma di frequenze in cui si eccita), e spettro di emissione (entrambi con un picco massimo). Ogni sostanza è dotata o di fluorescenza primaria quando questa viene emessa naturalmente (vitamina, riboflavina, clorofilla e la stessa ematossilina eosina) o di fluorescenza secondaria si induce artificialmente utilizzando il fluorocromo (orange acridina, Hoechst si lega al nucleo e fluoresce in blu-verde, rodamina, fluorescina).

Le lectine sono delle proteine (glicoproteine) di origine vegetale che si legano in maniera particolare a determinati zuccheri, vengono coniugate con fitc (isotiocianato di fluorescina) e fatte incubare con il tampone nel campione con zucchero inibitore, poi vengono incubate in tampone a pH specifico e t.a. al buio e formano legami con zuccheri specifici nel preparato evidenziando con fluorescenza le strutture alle quali si legano.

L’impiego della fluorescenza è molto importante se calata nel concetto di immunofluorescenza diretta (se si usa solo l’anticorpo complessato con fluorocromo) e indiretta (se si deve utilizzare anche l’anti-anticorpo complessato con il fluorocromo).

Il nostro preparato può presentare in superficie particolari molecole dette antigeni. Per metterli in evidenza si effettua nel primo caso la coniugazione tra l’anticorpo-anti-proteina e un fluorocromo con successiva incubazione del campione al buio a 37 gradi per un determinato lasso di tempo. In questo frangente, in presenza della proteina o glicoproteina da esaminare, il complesso fluorocromo-anticorpo si lega alla proteina stessa sul preparato se essa è presente e se essa non si è ancora legata ad altri componenti non fluorescenti.

Ad esempio, la falloidina si lega specificatamente all’actina, quindi potremmo usarla nel nostro preparato con fluorocromo per evidenziare in fluorescenza l’actina. Nel secondo caso, generalmente usato per mettere in evidenza i microtubuli degli aster durante la fase mitotica si coniugano anticorpi anti-tubulina complessati con fitc che conferiscono una colorazione blu al materiale genetico e verde ai microtubuli.

Microscopio confocale a scansione

Ancora meglio del precedente perché oltre a sfruttare la fluorescenza permette una osservazione per piani di una particolare cellula, quindi avrò una struttura tridimensionale da ricostruire piano per piano al computer. Utilizza una luce laser prodotta da una miscela di gas argon e kripton in grado di generare raggi luminosi anche all’interno dello spettro del visibile, tra i 488 nanometri ai 700 ma anche raggi uv tra i 361 e i 365 nm.

Il microscopio permette di osservare campioni spessi, come ad esempio piccoli animaletti e possiamo utilizzando fluorocromi adatti osservare interi tessuti. Grazie alla luce laser che con la sua coerenza e alta intensità consente di evitare fenomeni di aberrazioni e diffrazioni è possibile avere un’immagine nettamente più nitida rispetto all’utilizzo della lampada comune e ciò permette anche un notevole miglioramento nella risoluzione e nella profondità di campo.

La luce laser viene fatta convergere in un punto piccolissimo del nostro campione e viene analizzata a quella data profondità consentendo la messa a fuoco solo di quel punto. Grazie ad un sistema scanner tale punto viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell’obiettivo in modo tale da effettuare una scansione completa di tutta la sezione ottica. Il laser fornisce al computer una sequenza di immagini puntiformi che per la nostra retina sono no sense.

I raggi luminosi provenienti dal piano focale e da piani paralleli e prossimi ad esso vengono convogliati ad uno specchio dicroico poi scomposti e focalizzati nel piano dalla minuscola apertura del diaframma pinhole. A questo punto l’immagine viene inviata la sovrastante fotomoltiplicatore che converte i segnali luminosi in elettrici, amplificandone l’intensità e trasmettendolo al calcolatore che lo trasforma in foto digitale osservata in un monitor.

Può essere usato anche con fluorocromo, la luce laser è sufficientemente intensa da eccitare il fluorocromo solo nel punto di sua massima concentrazione che corrisponde al piano di messa a fuoco dell’obiettivo. In questo modo le aree al di sopra e al di sotto del piano focale appaiono scure e non contribuiscono alla costruzione dell’immagine.

La scansione dei diversi piani focali permette poi la ricostruzione dell’immagine al computer. La caratteristica quindi è quella di poter ricostruire l’oggetto per piani.