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Microbiologia con immagini

Conoscenze di base sul mondo dei microrganismi e descrizione delle tecniche principali necessarie per il loro studio. La cellula batterica: capsula, flagelli e fimbrie, parete, membrana cellulare, genoma. Metodi di sterilizzazione. Terreni di coltura. Determinazione della massa e della concentrazione cellulare. Curva di crescita batterica. Metabolismo microbico. Criteri di classificazione e metodi... Vedi di più

Esame di Microbiologia con laboratorio docente Prof. G. Mastromei

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ESTRATTO DOCUMENTO

27/9/2016 STERLIZZAZIONE

Situazione in cui vengono uccisi o rimossi tutti gli organismi viventi ed eventuali virus, nel campione.

E' una riduzione della carica microbica, non ci sono sterilizzazioni parziali, o lo è o non lo è.

Qualunque tecnica utilizzata intacca in parte anche il campione quindi prima di effettuare una

sterilizzazione bisogna chiederci perchè lo facciamo? Qual è il nostro obiettivo? Cosa ho necessità di

togliere?' e scegliere il metodo migliore.

METODI DI STERLIZZAZIONE

1.CALORE

Cosa succede ad una popolazione di organismi quando viene scaldata?

Possiamo vedere dal grafico che all'aumentare della temperatura la morte delle cellule avviene più

velocemente. TEMPO DI RIDUZIONE DECIAMLE, è il tempo necessario per uccidere il 90% delle cellule. La

percentuale di riduzione è costante, non il numero di cellule che viene ucciso. Come si vede, la

sterilizzazione non è totale. Ma la scala logaritmica arriva a 0,001.

RELAZIONE TRA TEMPERATURA E TASSO DI LETALITA'

Se metto un campione di spore batteriche, resistenti al calore, posso fare un controllo perchè se il calore

uccide le spore allora ucciderà anche i batteri che sono meno resistenti.

STRUMENTI

-Fiamma: incenerisce le cellule, rischia di incenerire anche il campione quindi serve per materiali resistenti

alla fiamma (ago, pinze ecc). Viene usato negli inceneritori per smantellare materiali ospedalieri. Spesso

però il calore della fiamma può far disperdere le cellule prima ancora di ucciderle quindi ci sono dei filtri per

impedire che questo accada.

 CALORE SECCO

Usando una stufa a 160° per 2-3 ore. L'aria è un cattivo conduttore e servono quindi tempi molto lunghi,

inoltre elimina acqua ma la cellula senza acqua vive meglio quindi è più resistenze e ci vuole maggior

tempo. Si possono sterilizzare campioni in contenitori poiché è difficile mantenere la camera sempre

sterilizzata. In questo caso devono essere utilizzati contenitori resistenti al calore come vetro o metallo.

 CALORE UMIDO

In questo caso si usa un AUTOCLAVE. Funziona come una pentola a pressione, il campione si trova dentro

ad una camera in cui c'è del liquido, come l'acqua che una volta scaldata crea vapore. Poiché la camera è

chiusa ermeticamente, per la legge dei gas perfetti il liquido non evapora ma aumenta la pressione e di

conseguenza anche la temperatura che arriva circa a 120° (= 1 atm), impiegandoci circa 30min. Il tempo è

ridotto perché l'aria viene spinta fuori dalla pressione e sostituita dal vapore, inoltre le cellule sono ricche di

acqua grazie al vapore e muoiono prima. Questo processo però non uccide le spore.

UCCISIONE DEI MICRORGANISMI CON CALORE UMIDO

Cellule vegetative Spore

Lieviti 5 min 50-60° 5 min 70-80°

Muffe 30 min 62° 30min 80°

Batteri (mesofili) 10 min 60-70° 2-800 min 100°/ 0,5-12min 121°

Riguardo alle spore fungine si parla di spore vegetative che non si riproducono quindi sono diploidi poichè i

gameti sono aploidi.

2.PASTORIZZAZIONE

Non è una vera e propria sterilizzazione poiché serve solo per l'abbattimento della carica microbica. Nasce

con PASTEUR, per questo assume questo nome. Egli si accorse che i microrganismi vivevano molto bene nel

latte e utilizzò un trattamento a circa 60-65° per 30 min.

Adesso nella pastorizzazione istantanea si scalda fino a 71° per 15 secondi. Il latte pastorizzato non è sterile

infatti non dura molto, i batteri patogeni vengono eliminati ma non i lattobacilli che acidificano con o senza

aria. Il latte ad alta conservazione sta a temperatura ambiente, la sigla UHT indica che è stato trattato ad

altissime temperature. Per effettuare questa sterilizzazione il latte passa su un elettrometallo scaldato e poi

viene rapidamente raffreddato. Il latte ha proprietà organolettiche elevate ed è facilmente modificato.

Alcuni formaggi non possono essere fatti con latte pastorizzato per cui deve essere utilizzato latte crudo. In

questo caso sarà la filiera, cioè l'allevamento, ad essere controllato. Inoltre la stagionatura elimina l'acqua e

questo incentiva la morte delle cellule.

3.RADIAZIONI

Le radiazioni ultraviolette a 260nm (nanometri) non penetrano per cui sterilizzano soltanto le superfici. Le

radiazioni ultraviolette formano nelle cellule i dimeri di timina che vengono eliminati dalla cellula, ma se ne

formano molti i danni saranno irrecuperabili. Per esempio questo metodo viene utilizzato nella CAPPA

BIOLOGICA, dove ci sono sorgenti di raggi ultravioletti che servono per eliminare eventuali microrganismi.

Vengono usati anche i RAGGI X e γ, questi sono raggi molto penetranti e causano la formazione di ioni

uccidendo le cellule. I raggi γ sterilizzano le siringe già nelle confezioni. Sono molto pericolose per gli

uomini. Sono usati a livello industriale e richiedono molte spese. Questo processo è utilizzato a volte anche

su frutta e verdura ma in rari casi.

4.FILTRAZIONE

Operazione meccanica per eliminare i microrganismi dal liquido. Membrana filtrante con piccolissimi buchi

(0,54-0,22 micrometri)

Il liquido viene messo nell'imbuto e viene messo in una beuta a vuoto in modo che il liquido venga

risucchiato e spinto verso il basso. I virus possono passare perché hanno dimensione dei nanometri.

A livello industriale vengono usate altre membrane perché questa così piccola intoppa facilmente, cioè si

tappa. Quelle che usano sono più larghe e si usano nell'industria del vino e della birra. Alla fine della

produzione bisogna eliminare i lieviti, si può usare la pastorizzazione ma va a modificare anche un po'

l'alimento, invece con la filtrazione no, ma la conservazione è più limitata.

SOSTANZE CHIMICHE DISINFETTANTI

1.FENOLO E DERIVATI

E’ stata la prima sostanza ad essere stata utilizzata, rompe la membrana della cellula e denatura le

proteine. Viene usato con il materiale organico e rimane spesso attivo sulla superficie.

Ha un odore pungente e crea irritazioni per questo sono state trovate delle sostanze alternative.

2.ALCOOL

Come l'etanolo o l'isopropanolo, quello che usiamo è denaturato, cioè viene messa una sostanza che lo

rende rosa e lo fa rivendere a basso costo perché non più utilizzabile a livello alimentare. Non uccide le

spore e più che uccidere i batteri ripulisce la ferita portando via anche loro.

3.ACQUA OSSIGENATA

E’ alcool al 3%, H2O2, rilascia ossigeno e ossidando disinfetta. E' poco stabile e dura poco nel tempo.

4.ALOGENI

il cloro è un gas che se sciolto in acqua diventa acido ipocloroso che libera ossigeno e svolge una forte

ossidazione. Non è eliminabile.

5.IODIO

E' un antisettico cutaneo e fa una iodazione delle proteine cellulari, si lega anche alle proteine della nostra

pelle per questo motivo rimane piuttosto a lungo.

6.SALI DEI METALLI PESANTI

- ARGENTO E MERCURIO, sono piuttosto tossici, soprattutto il mercurio perché non viene smaltito dal

nostro organismo a viene accumulato. L'argento invece veniva utilizzato per fare le posate anche per

questo motivo e le soluzioni di nitrato di argento in soluzione di 1% venivano messe negli occhi dei neonati

appena nati perché durante il parte avrebbero potuto infettarsi a contatto con la madre.

- FORMALDEIDE allo stato gassoso, la conosciamo come FORMALINA in soluzione acquosa. I vapori sono

sgradevoli.

R-SH+HCHO-> R-S-CH2OH

-BETA-PROPRIOLATTONE, si scioglie in un liquido e dopo si trasforma in ACIDO ACRILICO inattivandosi ma

sterilizzando il liquido

-OSSIDO DI ETILENE, bolle a 10,8° ed è gassoso a temperatura ambiente, è efficace e penetrante. Però

essere esplosivo quindi viene mescolato a CO2. Deve essere usato in una camera chiusa, è un gas che

danneggia i campioni. Usato per trattamenti su campioni di interesse artistico come i libri.

Questi se bagnati sono una fonte di nutrienti per i batteri, bisogna agire molto velocemente ma mancando

i finanziamenti i libri spesso vengono congelati.

USO DI DISINFETTANTI A LIVELLO INDUSTRIALE

– CARTIERE la cellula è facilmente attaccabile si usa ORGANO MERCURI E FENOLO.

– CONCERIE, trattamento di pelle, si usa METALLI PESANTI E FENOLI

– PLASTICHE, si usa DETERGENTI CATIONICI

– PETROLIFERE, i batteri attacca i sistemi di estrazione e gli oliodotti riducendo il flusso di petrolio,

vengono usati MERCURI E FENOLI.

– CONDIZIONAMENTO, dove c'è acqua crescono i batteri, si usa CLORO E FENOLO

– CENTRALI ELETTRICHE, nei condensatori e negli impianti di raffreddamento, si usa il CLORO

TERRENI DI COLTURA

I terreni di coltura sono le soluzioni nutrienti usate per far crescere i microrganismi in laboratorio.

1. TERRENO MINIMO o chimicamente definito, contiene il minimo necessario per la crescita del batterio

ma in realtà viene detto così perché ne conosciamo la composizione chimica

2. TERRENO MASSIMO o complesso, ci sono grandi quantità di nutrienti ed è chimicamente indefinito.

I terreni sono liquidi ma possono essere solidi con l'aggiunta di una sostanza gelificante come l'AGAR,

questa sostanza si scioglie a 85°, il terreno si sterilizza a 120° in autoclave quindi si scioglie e inoltre

solidifica a 45° quindi permette di aggiungere anche altre sostanza termolabili.

Agar viene degradato da pochissimi organismi. Si crea un gel e le cellule non si muovono così quando si

riproducono le cellule figlie rimangono vicine fino a creare una colonia batterica.

INGREDIENTI BASE:

– 1Lt acqua

– 1g HgSO4. 7H2O

– 200mg FeSO4.7H2O

– 10mg CoCl2

– 10 mg elementi in traccia (Mn,Mo,Cu,Co,Zn)

Sono pochissimi ingredienti per la sopravvivenza di un batterio, infatti per sopravvivere hanno bisogno

soprattutto di azoto e carbonio che in questo caso prenderanno dall'aria e dall'acqua. Ma posso fare varie

aggiunte.

- 1g NH4Cl = fonte di azoto

- 5 g Glucosio = fonte di carbonio

- 0,1g acido nicotico = è una vitamina, entra in quantità molto più basse

- 5g estratto di lievito = in questo caso NON è più un terreno minimo perchè metto un sacco di

sostanze insieme di cui non so le quantità precise.

3.TERRENI DIFFERENZIALI

consente la crescita di più microrganismi e di differenziali in base alle loro capacità metaboliche.

Per esempio riconoscere microrganismi che producono ESOPROTEASI. Nel terreno viene aggiunta

ALBUMINA una proteina che si denatura con la sterilizzazione in autoclave ottenendo delle piastre opache.

Le cellule che producono esoproteasi idrolizzano l'albumina formando un alone trasparente intorno alla

colonia.

In un terreno EMB (eosina+ blu di metilene) con lattosio, per trovare i ceppi di E. Coli in grado di

metabolizzare il lattosio osservo quelli che producono acido piruvico e acido lattico e noteremo un colore

differente.

4.TERRENI SELETTIVI

in questo caso nel terreno crescono solo i microrganismi che vogliamo.

Un terreno senza N permette la crescita soltanto dei batteri in grado di prendere l'azoto dall'atmosfera cioè

gli AZOTO FISSATORI.

Un terreno con antibiotico seleziona microrganismi resistenti a quell'antibiotico.

MORFOLOGIA DELLE COLONIE BATTERICHE.

E' tipica di ogni specie ma bisogna anche tenere conto della coltura in cui si trovano.

28/9/2016

OSSERVAZIONI AL MICROSCOPIO

Le cellule hanno poco contrasto, sono

trasparenti, quindi si utilizza una colorazione

(ma modifica un po’ le cellula) oppure si utilizza

un microscopio a contrasto di fase.

Il corpo del batterio interferisce con il raggio

luminoso aumentando il contrasto e quindi la

sua visibilità. COLORAZIONI

COLORAZIONE DI GRAM, alla base della divisione GRAM+ e GRAM- che rispecchia la struttura delle cellule.

La colorazione avviene con delle cellule fissate, non in soluzione, infatti vengono poste su un vetrino in

poco liquido che velocemente può evaporare.

Le cellule devono essere fissate sul vetrino passandolo sulla fiamma per bloccarle saldamente. I trattamenti

verranno fatti sul vetrino e poi osservato il campione al microscopio.

Questa colorazione è determinata dall’involucro, quindi le cellule devono essere in ottime condizioni

1. Cellule trattate con cristal-violetto per un minuto = tutte le cellule sono viola

2. Viene aggiunta una soluzione iodata che si complessa con il cristal violetto che non esce dalla

cellula.

3. Uso l’alcol per decolorare le cellule, il colore va via più velocemente dalle cellule GRAM-. Questo

dipende dalla parete che in gram+ è molto più spessa e con l’alcool i pori collassano rendendola

ancora più spessa di prima.

Nei gram- la membrana esterna è degradata dall’etanolo, quindi il colore esce più velocemente.

4. Controcolorazione, le cellule vengono trattate con SAFRANINA che colora di rosso le cellule gram-.

COLTURA PURA, una coltura che contiene solo un tipo di microrganismo. Una colonia su un terreno solido è

una cultura pura.

PRELEVARE CELLULE DA UN TERRENO SOLIDO O LIQUIDO.

ANSA: bacchetta che finisce con un “anello”

Prima viene sterilizzata sulla fiamma con l’ansa si prendono gli organismi di sospensione poi di striscia su un

una piastra per molte volte finche la striscia porta dietro di se sempre meno colonie e si possono osservare

singolarmente.

TITOLO DI UNA COLTURA BATTERICA

Il titolo indica la concentrazione di cellule in una coltura. Sappiamo che le cellule crescono in un terreno

liquido ma come?

Posso misurare il NUMERO di cellule = se aumentano stanno crescendo

Posso misurare la MASSA delle cellule = se aumenta stanno crescendo

Numero di cellule / ml

TITOLO:

TITOLO TOTALE= vengono contate tutte le cellule sia vive che morte

TITOLO VITALE = vengono contate solo le cellule vive

TITOLO TOTALE

Bulcker introdusse il vetrino per contare le cellule. Le cellule devono essere sospese in un liquido, la zona

centrale è suddivisa con una griglia. Conoscendo l’area e l’altezza trovo il volume del vetrino quindi posso

calcolare le cellule per millimetro.

Il movimento è dato dal liquido, non dalle cellule vive quindi come faccio a capire quali sono vive?

Bisogna vedere se si riproduce. Si prede la cellula e si mette in un terreno solido, solo se si riproduce

avremo delle colonie. Per farlo effettueremo delle diluizioni.

Prendendo un aliquota da ogni diluizione si vede che le colonie diventano contabili gia a 10^-3 si possono

contare e sono 159.

ESERCIZIO.

Ricavare il titolo della coltura.

0,1 ml di diluizione di 10^-5 ottengo 80 colonie.

80x 0,1x10^-5 ml (volume delle colonie originale) = 8x10^7 ufc/ml

DETERMINARE LA MASSA , Il PESO SECCO si ottiene centrifugando le cellule o filtrandole e seccandole a

100°. Il peso secco è il 20/25% di quello umido, una cellula di E. Coli pesa 3x10^-13 g.

Non esistono bilance cosi precise da poter calcolare questo peso, quindi dobbiamo tener conto di masse

più grandi. Una cellula può inoltre aumentare o diminuire il suo peso in base all’ambiente, se c’è più o

meno acqua. Effettuo una filtrazione e metto il filtro in una stufa, piano piano il suo peso scende finche non

rimarrà costante, quello è il suo peso secco.

DETERMINARE IL VOLUME : si centrifuga un’aliquota della coltura in provette graduate e si osserverà il

volume occupato dalle cellule, quindi qui saranno presi in considerazione una quantità di ancora pIù grande

e sarà meno preciso.

DETERMINAZIONE DELLA MASSA CELLULARE MEDIANTE NEFELOMETRIA O

COLORIMETRIA

Raggio luminoso -> prisma -> varia la lunghezza d’onda

La nefelometria è una metodica ottica di analisi che permette di ricavare la quantità di sostanza oggetto di

analisi misurando la radiazione diffusa per effetto Tyndall. Viene applicata per fasi disperse estremamente

fini, di diametro dell'ordine di decine o centinaia di nanometri e presenta elevati livelli di sensibilità e,

opportunamente standardizzata, può essere anche molto precisa.

La turbidimetria è una metodica ottica di analisi che permette di determinare, in qualità di parametro sia

aspecifico che specifico, il livello di torbidità di un liquido sfruttando l'assorbimento e la riflessione di raggi

luminosi di determinata lunghezza d'onda.

La luce trasmessa diminuisce ad aumentare della massa,

Consideriamo valori di assorbanza direttamente proporzionali alla massa.

CRESCITA BATTERICA

SCISSIONE

Aumenta la massa, si duplica il DNA, formazione di un SETTO, le due cellule identiche si separano e si forma

la prima generazione.

In questo modo non esiste variabilità genetica, non c’è ereditarietà perché non ci sono padri e figli.

DIVISOMA: è dove si crea il setto, una struttura che individua il punto di divisione. I nuovi involucri crescono

da quel punto verso l’esterno. Le nuove cellule hanno mezzo involucro nuovo e mezzo vecchio.

Si possono notare più anelli di separazione contemporaneamente.

PROTEINE CITOSCHELETRICHE: danno la forma alle cellule e attaccano il DNA durante la divisone facendo in

modo che entrambe le cellule abbiamo metà genoma. ( PROTEINE Mre B)

TEMPI DI GENERAZIONE: c’è una forte variabilità in base ai tipi di batteri, la DNA polimerasi non può essere

accelerata, va sempre alla stessa velocità. La duplicazione del genoma di E coli richiede 40 minuti ma il

tempo di generazione è di 21 min, come fa ad assicurare che ogni cellula abbia un intero genoma?

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Questo è permesso perché le force replicative si aprono una di seguito all’altra, non aspettano che la prima

finisca. Le spore sono aploidi, le altre cellule contendono molto più DNA a causa di questo meccanismo.

“Tempo di generazione”, cioè il tempo necessario perché il DNA raddoppi.

Se abbiamo 5 cellule che dopo 30 minuti diventano 1000, abbiamo una sola generazione ma 500 divisioni.

Se abbiamo una cellula e diamo un tetto di generazione di 30 minuti:

Le due linee indicano lo stesso tipo di crescita ma la VERDE è in una SCALA LINEARE mentre la ROSSA in una

SCALA SEMILOGARITMICA e ci permette di trovare il tempo di generazione.

Da una curva esponenziale possiamo trarre un equazione in base ai

dati del grafico.

N= N˳ x 2ʰ

N= numero di cellule finale

N˳= numero di cellule iniziale

n= numero di generazioni

2= indica che la riproduzione è mediante scissione, da 1 ne

otteniamo 2

Questa equazione ci permette di conoscere n, cioè di sapere quante generazione ci vogliono per passare da

N˳ a N. n= LogN - LogN˳

LogN = LogN˳ + nLog2

LogN - LogN˳ = nLog2 Log2

(Log2 = 0,301)

ESERCIZI

In 10 ore una coltura batterica è passata da 10^3 a 10^8 cellule.

Calcola il tempo di generazione (n). G= t/n

n= 8x2 / 0.301 = 20 Tempo di generazioni :

In 10 ore fa 20 generazioni. 10/20 = o,5 Cioè ci mette 30 minuti.

Partendo da una singola cellula, abbiamo una coltura che cresce in modo esponenziale per 36 ore, con un

tempo di generazione di 30 minuti. Calcolare il peso delle cellula al termine di questo tempo.

PESO DELLULA SECCA: 3X10^-13 g

0,5 = 36/n

n= 36/0,5 = 72

N= 1 x 2^72= 4,72 x 10^21

4,72 x 10^22 x 3x10^-13 = 14,16 x 10^9

Fenomeno esponenziale: parte basso e aumenta tantissimo quando trova condizioni ideali per riprodursi.

Non possiamo avere una crescita controllata per tanto tempo.

FASI DI CRESCITA BATTERICA

Fase di latenza

Le cellule sono in un nuovo terreno e devono adattarsi (attivare i processi metabolici per la propria

crescita). Il tempo dipende da vari fattori, per esempio le spore dovranno attivarsi, i dormienti risvegliarsi,

oppure arrivano da un terreno minimo (la latenza sarà poca) o da uno massimo (la latenza sarà più lunga

per attivarli).

Fase esponenziale

Con il proprio tempo di generazioni, abbiamo un aumento rapido del numero di cellule.

Fase stazionaria

Finiscono le sostanze nutritive e non c’è più crescita esponenziale. Per mantenere costante il numero di

cellule vive, o rimangono vive e nessuna muore oppure quelle che muoiono sono tante quante quelle che

vengono generate. Piccola crescita ma uguale morte.

Fase di morte

Le cellule iniziano a morire, possono produrre endospore o entrare i una situazione di quiescenza.

Le cellule non sono sincronizzate e in realtà i passaggi non sono cosi netti, ma graduali.

In natura non esistono colture pure ma COMUNITA’ MICROBICHE, e gli ambienti sono OLIGOTROFI, cioè

manca la nutrizione e la crescita non è veloce, ma ci possono essere momenti di maggior ricchezza e alcune

specie risultano più brave di altre a nutrirsi velocemente, quindi alcuni hanno maggior capacità di

sopravvivenza rispetto ad altri, quelli che muoiono sono quelli che hanno capacità metaboliche minori.

Quando inizia la fase stazionaria, la comunità ha cambiato ambiente perché ha creato delle molecole di

scarto e può aver cambiato anche il pH. Queste molecole di scarto possono essere nutritive per altri

organismi, quindi c’è un riciclo dei materiali.

Ci sono anche altri meccanismi, oltre a quello delle spore, infatti alcune cellule si suicidano volutamente

dopo la fase stazionaria, poiché così la lisi cellulare non peggiore l’ambiente ma anzi dona nutrienti all’altra

parte della popolazione.

Ci sono anche cellule vitali, che entrano in una fase di quiescenza tale che se messe in un terreno di coltura,

non cresceranno, inizieranno a farlo solo in particolari condizioni.

Se una popolazione di cellule fosse sincronizzata si vedrebbe che se la popolazione sincrona, le cellule si

dividono tutte nello stesso instante, ma la crescita della massa è continua quindi il grafico è esponenziale.

La crescita continua è una coltura in cui iene mantenuta costante la fase esponenziale, questo accade se

continuiamo a donare risorse e facciamo in modo che non esauriscano mai.

Se la sostanza è in concentrazioni limitate, queste regola anche il tempo di generazione, più ne mettiamo

più veloce si riprodurrà.

Ogni organismo vivente ha una sua temperatura ottimale di crescita, quindi che può riprodursi, sopra la

temperatura ottimale abbiamo la temperatura max, cioè la massima che può tollerale mentre la minima è

la minima a cui può riprodursi.

La temperatura minima per un cellula batterica significa che la membrana citoplasmatica perde fluidità e

non c’è scambio con l’esterno. Sotto la cellula minima si blocca la crescita microbica ma non si uccide. I cibi

congelati bloccano la crescita ma non avviene sterilizzazione. Le attività metaboliche sono reazioni

chimiche quindi se sono coinvolti gli enzimi sono comunque reazioni che risentono della temperatura. La

temperatura ottimale è quella dove la cellula svolge le sue attività metaboliche nelle condizioni migliori.

Quando saliamo di temperatura in modo eccessivo la cellula muore, le membrane si rompono e le proteine

si denaturano.

Ogni microrganismo ha le proprie temperature minime, ottimali e massime.

Gli organismi mesofili hanno la temp. ottimale ai 30-40°, appartengono tutti i mammiferi.

I termofili hanno temp. trai 50-60°,

gli ipertermofili non possono vivere a temperature inferiori ai 90°, la maggior parte di loro sono archea e

hanno una membrana monostrato. Li troviamo in ambienti

4/10/2016 I FATTORI CHE INFLUENZANO IL METABOLISMO

La temperatura influisce sul tempo di generazione. Man mano che la temperatura sale, il tempo di

generazione scende. Il metabolismo è fatto da reazioni chimiche che dipendono dalla temperatura. Il

metabolismo è causato da reazioni climatiche, quindi LA TEMPERTURA INFLUISCE LE REAZIONI

METABOLICHE. Qual è la temperatura che possono tollerare gli organismi viventi? (fino a che temp può

riprodursi?) Alcuni riescono a resistere a temperature più elevati altri meno.

I microrganismi eucarioti tendono ad accettare temp più elevate ma non superano i 60. Più è complesso un

organismo più sopportano temperature elevate. Se guardiamo i procarioti un aspetto interessante riguarda

i CIANO BATTERI e gli eterotrofi che svolgono la fotosintesi e arrivano ai 70°,poiche il sistema fotosintetico

non funziona a temperature alta, poi i termofili e gli ipertermofili sopravvivono a temperature molto

elevate. Dal punto di vista evolutivo i microrganismi dovevano sopportare temperature molto alte.

Il pH influenza la crescita di un microrganismo, i microrganismi possono vivere in base alla loro specie in

diversi livelli di pH. Il metabolismo all’interno di una cellula si svolge a pH 7, quindi la cellula deve

mantenere un certo pH tra quello interno e quello esterno, questo lavoro è svolto dalla membrana. La

situazione è diversa per quanto riguarda i sali, per esempio NaCl, i microrganismi si dividono in tre gruppi in

base alla concentrazione ottimale di NaCl

- Non Alofili, come E. Coli

- Alotolleranti, sopportano NaCl all’interno di un piccolo

intervallo, la loro velocità di crescita massima è in

assenza di NaCl, se questo aumenta influenza la velocità

di crescita.

- Alofili, a loro piace una certa quantità di NaCl, questo

vuol dire che senza NaCl non crescono ma iniziano a

farlo in modo ottimale quando questo aumenta.

- Alofili estremi, hanno bisogno assolutamente di NaCl e

più ce n’è meglio è, iniziano crescere solo a

concentrazioni molto elevate.

Un altro fatto è l’OSSIGENO, una molecola molto importante e distingue i microrganismi in base alla loro

risposta all’ossigeno. Questi non sempre utilizzano l’ossigeno per sopravvivere.

Cinque crescite differenti in cui un microrganismo in un

liquido che stato inoculato con cento batteri,

1. Tutti i batteri stanno nella parte alta della

provetta, la zona più vicina all’aria perché hanno

bisogno di ossigeno per vivere, microrganismi

AEROBI

2. Tutti i batteri stanno sul fondo, il punto più

lontano dall’aria, sono microrganismi che non

vogliono l’ossigeno, ANAEROBI

3. microrganismi dispersi in tutta la provetta, ma

una percentuale maggiore si trova nella parte

alta, questi sono microrganismi che possono

vivere senza e con l’ossigeno, ma se possono scegliere preferiscono l’ossigeno, e sono detti

ANAEROBI FACOLTATIVI

4. microrganismi concentrati un po’ sotto la superficie, questi sono detti MICRO AEROBI, cioè vivono

a concentrazioni ridotti di ossigeno, quindi una concentrazione minore di quella atmosferica.

5. Microrganismi diffusi in tutta la colonia liquida, senza una preferenza di localizzazione. Sono

chiamati ANAEROBI TOLLERANTI, non hanno bisogno di ossigeno per crescere, ma non gli dà

neanche noia, vivono in presenza o in assenza di ossigeno.

Alcuni di questi microrganismi creano dei problemi dal punto di vista di crescita nelle colture, specialmente

quelli che non tollerano la presenza di ossigeno e per loro è un veleno, alcuni invece smettono solo di

crescere ma sopravvivono e ricominciano a riprodursi se l’ossigeno viene tolto.

METABOLISMO

Tutte le reazioni chimiche che avvengono all’interno di un microrganismo, producono energia o molecole

organiche a partire da molecole semplici, quindi richiedono energia.

PROCESSI CATABOLICI richiedono energia per svolgere i PROCESSI ANABOLICI. L’ATP è una delle principali

molecole che la cellula utilizza per i processi metabolici.

Per trasformare c’è bisogno di ENERGIA DI ATTIVAZIONE che verrà abbassata grazie all’intervento degli

enzimi.

CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLE VIE BIOSINTETICHE (FONTE DI CARBONIO) UTILIZZATE

- ETEROTROFI, come fonte di carbonio non usano la CO2 ma una sostanza organica

- AUTOTROFI, come fonte di carbonio usano la CO2 sfruttando la fotosintesi o il catabolismo di

sostanze organiche

CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI IN BASE ALLA FONTE DI ENERGIA UTILIZZATA PER GENERARE ATP

- FOTOTROFI, usano la luca

- CHEMIOTROFI, usano substrati organici o inorganici, reazioni di ossido-riduzione.

METABOLISMO CHEMIORGANOTROFO

Traggono energia da materia organica.

Sono organismi che generano energia mediante

reazioni di ossido riduzioni e sono capaci di produrre

materia organica solo trasformando altra materia

organica. La materia organica è usata per la biosintesi

di altre molecole organiche e la produzione di ATP

viene generata dal flusso di elettroni, cioè reazioni di

ossido riduzioni a cascata che possono attivare

recettori diversi. Il carbonio viene ritrasformato in CO2 quindi viene restituito all’atmosfera.

METABOLISMO CHEMIOLITOTROFO

Traggono energia da materia inorganica.

Questa situazione si ritrova nei microrganismi

perché l’energia viene ricava dalle reazioni di

ossido-riduzione dei composti inorganici e la

produzione di materia organica viene attraverso

l’utilizzo di CO2, quindi si po’ produrre materia

organica al buio.

METABOLISMO FOTOTROFO

Sono in grado di effettuare fotosintesi utilizzando energia

luminosa.

Tipi di metabolismo utilizzati dai microrganismi

chemiotrofi

- Fermentazione, l’accettore finale di elettroni è

un composto organico che deriva dal composto

di partenza.

- Respirazione aerobia, l’accettore finale di

elettroni è l’ossigeno

- Respirazione anaerobia, l’accettore finale è un

composto, di solito inorganico diverso

dall’ossigeno.

La respirazione richiede più ATP della fermentazione.

FERMENTAZIONE

Mediata da alcuni microrganismi e interessante da un

punto di vista applicativo. Il prodotto finale della via

metabolica è una molecola di interesse economico.

Quando si parla di questo tipo di metabolismo, la

molecole iniziale è il GLUCOSIO, questo subisce

degradazione tramite la GLICOLISI, non è l’unica via ma è

la principale. Da una molecola di glucosio si ottengono

due molecole di ACIDO PIRUVICO. Entrambe le

fermentazioni partono da questa molecola. 1 GLICOLISI

FERMENTAZIONE OMOLATTICA

Tutto l’acido piruvico viene trasformato in ACIDO LATTICOA,

viene utilizzato dagli STREPTOCOCCHI e LATTOBACILLI, viene

usato per la produzione di formaggio.

FERMENTAZIONE ALCOLICA

L’acido piruvico viene ossidato con a perdita di CO2 e

l’acetaldeide che si forma viene ridotta a ETANOLO. Questo

processo è utilizzato per le bevande alcoliche come BIRRA o

VINO, ma viene usato anche nella PANIFICAZIONE. Per i

LIEVITI.

FERMENTAZIONE PROPIONICA

È una via complessa (non interessano i passaggi intermedi), inizia con

3 molecole di acido piruvico e si ottengono due di ACIDO

PROPIONICO , una di ACIDO ACETICO e una di CO2.

E’ utilizzata da PROPIONIBACTERIUM che riesce a svolgere una via

metabolica dall’acido lattico, che ritrasforma in acido piruvico e poi

svolge la propionica. L’emmenthal svizzero si forma attraverso

questo processo, la CO2 che rimane intrappolata darà la

caratteristica dei buchi.

FERMENTAZIONE MISTO-ACIDA

Il metabolismo non produce tanti prodotti, ma ha la possibilità di

produrre varie prodotti e questo dipende dalle condizioni ambientali.

Può produrre una serie di acidi, come ACIDO SUCCINICO, ETANOLO,

ACIDO ACETICO, H2+CO2 e ACIDO LATTICO.

FERMENTAZIOE BUTILEN-GLICOLE

Da due acido piruvico si ottiene GLICOLE 2,3-BUTILENICO.

FERMENTAZIONE BUTIRRICA, BUTANOLICA E ACETONICA.

Da 4 acidopiruvico si ottengono vari prodotti, è caratteristica del

CLOSTRIDIUM. Questa fermentazione insieme alla precedente apre

la possibilità di avere molti prodotti differenti, in particolare il 2,3

butilenico.

Queste due vie metaboliche hanno alcuni prodotti molti interessanti

per l’industria chimica. E’ possibile usare le vie fermentative per

produrre la maggior parte delle sostanze che derivano dalla

produzione di microrganismi. Da un punto di vista storico molte vie

sono usate dall’industria tedesca nella seconda guerra mondiale.

FERMENTAZIONE ETEROLATTICA

LEUCONOSTOC ed alcuni lattobacilli la utilizzano, partendo da

glucosio danno ACIDO ACETICO, ETANOLO, ACIDO LATTICO E CO2.

Diversa dall’omolatica che produce solo acido lattico.

FERMENTAZIONE DI ENTNER-DOUDOROFF

Riguarda anche la glicolisi perché il glucosio viene degradato in acido

piruvico e gliceraldeice 3-fosfato, quello che si ottiene è ETANOLO e

CO2. E’ usata per la fermentazione d alcune bevande alcoliche.

AEROBIOSI E ANAEROBIOSI

- Aerobi obbligati, necessitano di ossigeno (bacillo della tubercolosi, alcuni bacilli sporigeni). Alcuni

bacilli delle vie aeree.

- Anaerobi obbligati, crescono in assenza di ossigeno (clostridi), i micoaerofili necessitano di una

bassa tensione d’ossigeno.

- Anaerobi facoltativi, vivono in presenza e in assenza ma preferiscono la presenza di ossigeno.

Possono effettuare fermentazione o respirazione aerobia.

- Anaerobi tolleranti, crescono sia in presenza che in assenza d’ossigeno, ma operano solo la

fermentazione (molti lattobacilli).

L’ossigeno è una molecola estremamente reattiva e all’interno i una cellula può essere ridotto e

trasformarsi in acqua ossigenata che a sua volta si trasforma diventando molto reattiva.

Si accumulano i composti intermedi altamente reattivi nelle cellule che non sono in grado di svolgere tutte

le funzioni quindi la cellula muore. Prima la terra era senza ossigeno, la vita è nata in assenza di ossigeno.

Ci sono una serie di enzimi all’interno di una cellula che possono permettere l’eliminazione di questi

intermedi, per esempio la CATALASI. Un esperimento per vedere se un organismo produce catalasi oppure

no, le sue cellule vengono disciolte in una goccia di acqua ossigenata, se l’organismo non produce catalasi,

la goccia rimane intatta nel caso contrario si formano delle bolle e viene liberato ossigeno.

Per vivere in presenza di ossigeno i microrganismi hanno dovuto sviluppare vari enzimi per le vie

metaboliche.

Capacità dell’accettore finale di catturare gli elettroni, Enzimi che eliminano i residui

questo è il finale della respirazione. La molecola più

efficace è l’ossigeno, la respirazione anaerobica quindi è quella con maggior potenziale, poi ci sono una

serie di altre reazioni dove gli accettori finali sono altre molecole inorganiche dove il processo ha

un’importanza fondamentale.

BIOMINERALIZZAZIONE, il trisolfuro di arsenico può derivare da lavorazioni industriali e in presenza di un

batterio particolare viene trasformato in ARSENATO, che è solido precipita. Questo è utile per analizzare

acque contaminate.

FOTOTROFIA

Utilizzazione della luce per produrre energia, quando parliamo di batteri si parla di fototrofia, non tutti i

batteri fototrofi producono energia attraverso la fotosintesi, infatti nel processo fotosintetico entra in gioco

la clorofilla. Quando parliamo de batteri di parla di BATTERIOCLOROFILLA A, che è diversa da quella della

piante solo per alcuni sostituenti.

La clorofilla insieme ai carotenoidi servono per catturare l’energia luminosa. I batteri fotosintetici si

possono trovare raggruppati in base al colore, poiché i pigmenti catturano l’energia luminosa a diverse

lunghezze d’onda.

La fotosintesi vegetale utilizza l’acqua per condurre elettroni, ci sono procarioti che fanno fotosintesi

vegetale, cioè i ciano batteri mentre gli altri fanno la fotosintesi batteri e NON PRODUCONO OSSIGENO,

perché o non lo usano perché è un ciclo chiuso o perché il donatore di elettroni è un’altra molecola. I

batteri fotosintetici tendono ad avere come enzimi coinvolti nella via metabolica raggruppati, sono delle

membrane lamellari, ripiegamenti della membrana citoplasmatica, sono dei ripiegamenti che agiscono

nella via fotosintetica ma in alcune cellule batterica troviamo delle vescicole, CLOROSOMI, che racchiudono

gli enzimi per questa via metabolica. I CLOROPLASTI si trovano nei microrganismi che vivono in ambienti

scarsamente illuminati. L’energia luminosa viene catturata e poi utilizzata per generare un flusso di

elettroni che a sua volta genererà ATP. Gli elettroni partono e ritornano alla partenza oppure essere

rilasciati.

In un processo di questo genere viene prodotto zolfo che precipita, all’interno vengono accumulati granuli.

La cellula batterica è capace di sintetizzare gli amminoacidi non esistono vie separate per uno stesso

amminoacido ma ci sono vie metaboliche che producono più gruppi di amminoacidi.

5/10/2016 Capacità metaboliche varie.

I batteri sono in grado di sintetizzare tutto ciò di cui hanno bisogno utilizzando varie sostanze di partenza, la

cellula spende molto tempo per sintetizzare.

Hanno un piccolo genoma, ma molto ricco di informazioni, questo perché hanno pochissimo DNA non

codificante (non ci sono quasi mai introni).

La trascrizione e la traduzione avvengono simultaneamente, questo permette una regolazione molto rapida

e favorevole per la crescita che dev’essere veloce.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

 COSTITUTIVA, GENE A

L’enzima è sempre attivo e il gene è sempre tradotto, non c’è regolazione perché il gene serve sempre.

 INIBIZIONE A FEEDBACK, GENE B

Il processo passa da vari intermedi e c’è bisogno di molti enzimi che operano uno dietro l’altro. Permette

una regolazione rapida, infatti bloccando il primo enzima si blocca di conseguenza tutto il processo, il

prodotto finale fa da repressore di se stesso. L’enzima iniziale viene comunque prodotto, ma legandosi ad

un molecola piuttosto che ad un'altra, cambia la sua conformazione e non è più utilizzabile nel processo.

(ALLOSTERIA: un enzima con due siti, uno per attivarlo ed uno per inibirlo, il secondo è più compatibile e ne

modifica la struttura in modo che l’enzima non possa più catalizzare la reazione, ma l’enzima non viene

distrutto)

 REGOLAZIONE A LIVELLO DELLA TRADUZIONE, GENE C

In questa situazione la proteina tradotta non è attiva. La proteina prodotta ha una sequenza amminoacidica

NON utile, chiamata INTEINA (come gli INTRONI nel DNA) e deve essere rimossa. Questa sistema viene

usato per esempio per la DNA girasi, (enzima che rilassa i super avvolgimenti che si creano durante la

replicazione davanti alla DNA polimerasi), a sua inteina viene eliminata solo se c’è bisogno di questo

enzima.

Un altro tipo di regolazione prima della traduzione, riguarda il sistema iRNA. Vengono prodotte delle corte

sequenze di RNA compatibili con quelle sul mRNA e sono spesso le zone di attacco dei ribosomi (Shine e

Dalgarno), cosi che se i ribosomi trovano una doppia elica di RNA non si attaccano e non avviene la

traduzione.

 SISTEMA DI CONTROLLO A LIVELLO DELLA TRASCRIZIONE, GENE D

Viene impedica la trascrizione del gene

REPRESSIONE DELL’ENZIMA

Se faccio crescere dei batteri incapaci di sintetizzare arginina in un terreno privo di arginina, vedo che

questi producono gli enzimi per produrla, ma se inizio ad aggiungerla nel terreno, la produzione degli

enzimi si interrompe.

In un terreno senza lattosio vedo che solo nel momento in cui aggiungo il lattosio c’è la presenza

dell’enzima β-glattosidasi.

Operone: una sequenza che comprende più geni coinvolti nello stesso processo metabolico e sono tutti

sotto lo stesso controllo, vengono accesi o spenti simultaneamente.

ARGININA (autoregolazione)

Se nel terreno non c’è argnina, il repressore non si lega

all’operatore e la trascrizione procede. Se c’è arginina il

repressore viene attivato dall’arginina stessa ( co-repressore), in

questo modo può legarsi all’operatore e spengere la trascrizione

dell’operone.

LATTOSIO

Il repressore quando viene sintetizzato è subito attivo e di lega

all’operatore. Se c’è lattosio, questo si lega al repressore e

funzionando da induttore che fa staccare il repressore e la

trascrizione inizia.

FATTORI di trascrizione

I fattori sono proteine che favoriscono l’attacco della polimerasi al

promotore.

Davanti al promotore ci può essere un sito di legame per la

proteina attivatrice che si lega solo se attivata da un

induttore, per esempio il lattosio.

Lattosio + proteina > vanno sull’attivatore > la polimerasi si

attacca

Se il sito è lontano, l’attivatore funziona lo stesso perché il

filamento di DNA si ripiega.

RETROVIRUS

Portano nel loro DNA delle sequenze attivatrici e questo può

portare l’attivazione di geni silenti negli eucarioti.

CRESCITA DIAUXICA

Se metto poco glucosio e molto lattosio, una volta che il glucosio sarà finito,

le cellule inizieranno ad utilizzare il lattosio e inizierà anche ad aumentare il

livello della β-galattosidasi.

AMPciclico agisce sull’operone lattosio come un ATTIVATORE. Questo

permette alla polimerasi di attaccarsi solo se è in grandi quantità, poiché la

quantità di AMPciclico è inversamente proporzionale alla quantità di

glucosio.

OPERONE TRIPTOFANO

Fenomeno di attenuazione, una sequenza che va dal promotore al primo gene strutturale, chiamata

SEQUENZA LEADER permette di capire alla polimerasi se deve proseguire o fermarsi.

La sequenza LEADER presenta 2 codoni per il triptofano, è un oligopeptide corto che ha solo una funzione di

regolazione.

Ci sono quattro zone, se si appaiano la 3 e la

4 la trascrizione si interrompe, questo accade

perché i tRNA carici di triptofano si sono

legati e il ribosoma scorrendo ha impedito

alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3.

Se i triptofani mancano, il ribosoma si ferma,

la sequenza 2 si appaia con la 3, forma la

forcina che fa solo rallentare la polimerasi

che poi prosegue la trascrizione.

Questo sistema di attenuazione lo troviamo

anche in altri amminoacidi, come TEORINA,

ISTIDINA e FENILALANINA, ma nelle loro

sequenze leader sono presenti molti più codoni questo perché sono amminoacidi molto più frequenti

rispetto al triptofano e sono codificati da più codoni quindi devono richiamare tutti i tRNA. Inoltre in questo

caso c’è solo un controllo di attenuazione mentre nel triptofano è presente anche un controllo a livello

della polimerasi. Nella biosintesi del triptofano trovano però anche un altro operone che ha come controllo

solo quello a livello del repressore, si pensa infatti che all’inizi ci fossero due operoni, uno con un controllo

ed uno con l’altro e probabilmente hanno duplicato il controllo sul repressore anche sull’altro per facilitarsi.

CONTROLLO GLOBALE DI E.COLI

FATTORE SIGMA: i geni hanno promotori diversi quindi diversi fattori sigma (dimensioni diverse, il peso è

indicato dal numero piccolo in alto)

QUARUM SENSING:

è un segnale che viene mandato dalle cellule a tutte le altre di una stessa popolazione per attivare o

spengere un determinato gene. Si basa sulla densità cellulare e sulla produzione di una MOLECOLA

SEGNALE. Nei GRAM- questa molecola è l’OMOSERINA LATTONE ACETILATO (AHL)

AHL si diffonde all’esterno, quando la concentrazione all’interno sono molto alte vuol dire che anche altre

cellule l’hanno rilasciata e che devono funzionare dei geni.

Alcuni batteri azionano la BIOLUMINESCENZA producendo l’enzima chiamato LUCIFERASI, questi sono

spesso associati agli organi dei pesci, dati da una coltura batterica che produce questi enzimi.

In Pseudomonas questo regola i geni del fenomeno BIOFILM, cioè la capacità di colonizzare terreni senza

nutrizione (vetri, rocce..) queste cellule su queste superficie producono dei polisaccaridi che creano una

pellicola nella quale vivono organismi diversi. Il BIOFILM protegge le cellule da condizioni ostili e cattura i

pochi nutrienti, c’è anche una cooperazione di microrganismi diversi.

Si può regolare la produzione di geni per la VIRULENZA (patogenicità) come in Streptococcus aureo.

SISTEMA A DUE COMPONENTI, proteine trans membrana che trasportano all’interno delle molecole che

funzionano da attivatori o repressori.

CICLI BIOGEOCHIMICI

Sono cicli che descrivono la trasformazione degli elementi necessari per gli organismi viventi attraverso da

processi chimici o biologici.

Sono coinvolti microrganismi di generi e specie diversi, essi sono spesso gli unici agenti biologici capaci di

rigenerare le forme degli elementi necessari ad altri organismi.

CICLO DEL CARBONIO.

La CO si trova nell’atmosfera e questa è la prima fonte di

carbonio. Gli organismi autotrofi servono per trasformare CO2

in materia organica. Cosi come altri agenti, ogni fase del ciclo

dev’essere bilanciata tra gli organismi. La materia organica

viene decomposta e riciclata ma a volte arriva in profondità

nelle falde acquifere rimanendo immune dall’aria, perciò viene

trasformata in IDROCARBURI da microrganismi anaerobi.

Questa viene rilasciata all’esterno aumentando la CO2 che

risulta in eccesso.

CO2 aumenta l’effetto serra poiché trattiene l’energia solare

aumentando la temperatura.

Osservano una piramide dei produttori di CO2 vediamo che

tutto dipende da quelli alla base, infatti i produttori primari

producono CO2 e sono le piante, i secondari sono gli erbivori

che si alimentano di piante e i terzi si basano sugli organismi

dei livelli sottostanti. La CO2 può essere riprodotta e

riutilizzata, la morte di tutti gli organismi porta alla

degradazione e quindi alla formazione di CO2.

CICLO DELL’AZOTO

La fonte di azoto principale è l’atmosfera. Sere per le piante ed

è fondamentale per l’agricoltura, i terreno venivano lasciati

incoltivati a rotazione per ricaricarli di Sali di azoto necessari

per le piante. L’azoto nell’atmosfera si trova sotto forma di N2,

cioè due atomi di azoto legati da tre legami covalenti,

necessaria molta energia per rompere questi legami, alcuni

organismi possono scindere questi atomi e creare ammoniaca.

Si possono formare nelle piante dei NODULI RADICALI DELLE

LEGUMINOSE.

Come può avvenire l’azoto fissazione se l’enzima idrogenasi

deve funzionare in assenza di aria

ma quasi tutti quest organismi

vivono a contatto con l’aria?

Viene prodotta Leg-emoglobina

che cattura ossigeno e lo porta

dove c’è bisogno. L’idrogenasi

funziona senza entrare in contatto

con l’ossigeno.

Ciclo dello zolfo

È presene in natura nei minerali. Viene preso lo

zolfo elementare e prodotti i solfati che

verranno rilasciati dopo la morte in acido

solforico e poi ritrasformato in zolfo.

Nelle miniera a cielo aperto possiamo trovare

dei drenaggi acidi. L’anidride solforica e altri

componenti dello zolfo sono volatili e questi

portano la formazione di acidi e piogge acide.

11/10/2016

 Mutazioni

 Inserzioni e delezioni

 Ricombinazione

 Mutazione pre o post adattativo?

 Test delle fluttuazioni, la mutazione è avvenuta prima del contatto con il mutageno

 Test delle piastre petri (replica plating)

 Test di SIB SELECTION (Ripeteva il replica planting ma utilizzando terreno liquido.)

 Cavalli Sforza e Ledemberg 1956

Tutti questi esperimenti hanno portato alla conclusione dell’idea pre-adattativa

Nel tempo ci sono stati altri esperimenti.

Ceppo LAC-di e coli fatto crescere in un terreno con solo lattosio, o avviene una mutazione che gli inizia a

fare usare il lattosio o moriva. Videro che le cellule in questa condizione erano più spinte a generare questa

mutazione quindi la presenza dell’agente selettivo sembra influenzare la mutazione.

In alcuni casi delle mutazioni specifiche possono essere indotte per far vivere meglio una cellula in quell

ambiente. STATO DI IPERMUTABILITA.

La cellula in situazione di stress attiva una frequenza di mutazioni più elevata. La frequenza base di

mutazione è di 10*-8, questa si alza molto e va a colpire l intero genoma.

Sicuramente in qualche cellula ci sarà la mutazione giusta. Tasso di mutazione: frequenza con cui può

avvenire una mutazione all’interno di una popolazione di cellule.

A=M/D

A: tasso di mutazioni

M: num. di mutazioni

D: num. di divisioni

La mutazione colpisce una delle due eliche di DNA

Un grosso problema degli antibiotici è la comparsa di cellule resistenti

Non è facile calcolarlo poiché noi vediamo il mutante ma da una mutazione si originano più mutanti, quindi

è difficile calcolare il numero di mutanti e il numero di mutazioni.

MUTANTI DI RESISTENZA, resistenti ad antibiotico o sostanze chimiche. Si ottengono in un solo passaggio,

ONE STEP, o più passaggi, MULTI STEP. I termini indicano che i primi sono mutanti che è possibile

selezionare mettendo la cellula direttamente a contatto con l agente selettivo. Ci sono casi pero che se

metto una coltura in un terreno con l agente selettivo non avviene nessun mutante perchè si vede che la

resistenza é data dalla mutazioni di più geni, quindi é piu difficile trovare queste cellule. Prima di seleziona

quelli per una poi per altra, fino ad ottenere mutanti per tutti i geni necessari. I multi step sono dati da un

fenomeno di DUPLICAZIONE GENICA. Certe volte all interno di un genoma un gene viene duplicato, cioe

compare una seconda copia, se gene é in una sola copia, non da abbastanza resista, quindi viene duplicato

in modo da produrre abbastanza sostanza per poter resistere.

MUTANTI AUXOTROFI, necessitano di una sostanza nutritiva per sopravvivere.

MUTANTI DI FERMENTAZIONE, non sanno usare un particolare zucchero

MORFOLOGICI, hanno una diversa morfologia di colonia.

TEMPERATURA SENSIBILE, esprimono la mutazione solo ad una certa temperatura noj permissiva.

 TEST DI AMES

 Processi di trasferimento del DNA (trasformazione, trasduzione, coniugazione)

 ESPERIMENTO DI GRIFFITH, esperimento per dimostrare che il DNA è il principio trasformante,

pesavano fosse la capsula che contenere le formazioni. Batteri naturalmente trasformabili:

GRAM+ e GRAM-, alcuni sono trasformabili artificialmente

TRASFORMAZIONE

STATO DI COMPETENZA è lo stato fisiologico in cui si deve trovare la cellula, uno stato di quorum sensitive

in cui delle molecole inducono la sintesi dei geni per la competenza. La competenza si sviluppa ala fine della

fase esponenziale.

Una volta che il dna si lega ai recettori della cellula, la parte del dna si taglia ed entra dentro l altra cellula in

singola elica e li viene duplicato. La trasformazione funziona solo tra dna della stessa specie.

Il fenomeno della trasformazione è stato studiato in laboratorio e si è visto che il dna complessato rende il

dna molto resistente. É un fenomeno molto diffuso in natura. Questo meccanismo fa parte dei sistemi che

la cellula attiva per poter sfruttare altre sostanze e averle più a lungo visto che si svolge alla fine della fase

di crescita.

Questo fenomeno all’ inizio era usato dalla cellula come sostanza di nutrimento poi la cellula ha iniziato ad

usarlo come molecola informazionale ma solo se é della sfessa specie, senno se la mangia.

PLASMIDI, si replica indipendentemente dal genoma ma si trova all’interno della cellula ed é fatto da dna.

La molecola é circolare per la maggior parte delle volte, ma ci sono anche plasmidi lineari. Non è una

molecola indispensabile ma porta informazioni aggiuntive che possono essere utili per la cellula.

CONIUGAZIONE

Presero due colture auxotrofe per sostanze opposte, ogni coltura messa in un terreno minimo non

sopravviveva ma se venivano mescolate e poi messe nel terreno, appaiono prototrofi, questo perché c’è

stato uno scambio tra queste cellule, questo ha portato alla conoscenza del fattore F.

F+ può fare coniugazione, può creare un pilus con una f-, questo si contrae e il dna plasmidico passa alla

cellula ricevente.Il dna circolare ha un meccanismo

di duplicazione chiamato A CERCHIO ROTANTE.

Tutte le duplicazioni avvengono da una sequenza

chiamata ORI non é mai casuale. Avviene un taglio

su una delle due eliche formando un nick.

Dentro un F+ ci possono essere HFR. Queste si

trovano per una caratteristica cioè perché

trasferiscono anche parte del loro dna genomico.

GRAFICO CNIUGAZIONE INTERROTTA, collocazione

dei geni, mappatura.

Le cell cercano plasmidi perché arricchisco molto le

loro informazioni.

Plasmide R.

Con l’INTRODUZIONE DEGLI ANTIBIOTCI la

risposta da parte del clinico bisognava capire

quale antibiotico uccideva il batterio e quindi

quale non era resistente. Furono isolati dei

batteri che erano resistenti pero a più di un

antibiotico, fino ad ottenere antibiotici

differenti.Fino a quel momento la resistenza

studiata era data da gemi che di trovano sul

genoma ma si accorsero che questi geni per la

resistenza si potevano trovare sui plasmidi e venne chiamato FATTORE R.

Nel plasmide c’é anche buona sequenza TRA cioè sono plasmidi coniugativi come il fattore F. É la sequenza

c’e permetta a coniugazione. Se poche cellule hanno il plasmide in poco tempo traferiscono il plasmide a

cell che non lo hanno. La resistenza non si traferisce per divisione ma orizzontalmente nella stessa

popolazione. Questo é un grosso problema. Gli antibiotici sono spesso usati in abito agricolo piuttosto che

medico. Alcuni plasmidi rendono anche resistenti al mercurio ed ad altri ioni metallici pesanti. Il mercurio di

per se non é tossico ma tende a legarsi a proteine e il mercurio complessato é tossico.

Ci sono anche plasmidi ad attività catabolica, cioè riescono a degradare sostanze strane, ottenendo da

quelle energia ed atomi di carbonio. Alcuni sono capaci di degradare il 70% dei composti del petrolio

grezzo.

Plasmidi ed iperplasia delle piante. Il plasmide P Trasferisce informazioni da un cell proc a una cell eucar.

Questi plasmidi sono usati, dopo aver tolto i geni che causano il tumore della cell vegetale, e usati per

trasferire informazione genetica nuova

Plasmidi e patogenicità, alcuni plasmidi rendono le cellule virulenti.

Il trasf di DNA plasmidico è molto ampio, avviene anche tra specie diverse, quindi inform genetica é

facilmente trasferibile tra microrganismi, c è un passaggio orizzontale.

TRASPOSONI

Seq di DNA che si spostano da un punto all’altro. Un tratto è fiancheggiato da seq IS, sta per insection

sequence, sono state trovate per la prima volta nella trasformazione. Tra due IS c’é un elemento mobile. La

trasposizione prevede individuazione di una bersaglio nel genoma che viene duplicata alla sua estremità.

La trasposizione può avvenire con due processi diversi, o si sposta dal punto di origine al punto bersaglio

oppure viene copiato ed è conservativa.

12.10.2016

Sequenze ripetute all’interno del dna possono essere anche ripetute ma in senso opposto quindi può

avvenire un appaiamento all’interno dello stesso dna, può avvenire un crossing-over e di conseguenza un

rovesciamento delle due sequenze.

Le due sequenze possono essere anche nella stessa

direzione e questo porterebbe all’eliminazione della

sequenza.

Salmonella può cambiare la composizione della flagellina,

la proteina del flagello, salmonella può sintetizzare due

tipi di flagellina, cambiando tipo mette in difficoltà

immunità, non può tradurre due tipi ma uno o l'altro.

H1 flagellina di tipo 1, questo gene e espresso solo se il

gene H2 è spento. Tutta la regolazione quindi dipende dal

controllo di H2.

H2 vive a stretto contatto con un altro gene che codifica

un repressore e sta subito dopo il gene H2, quindi una

volta che viene trascritto H2 viene trascritto anche il

repressore che andrà a reprimere il gene H1. Davanti ad

H2 c’è un promotore unico, davanti a questo c’è un gene chiamato HIN(invertible segment) con davanti un

suo promotore.

Quando la concentrazione di HIN e molto elevata, porta all’inversione di 180 gradi poiché all’inizio e alla

fine ci sono due sequenze ripetute invertite. Nella zona che si rovescia e incluso il promotore del gene HIN

che andrà in direzione opposta e la proteina H2 e il repressore non verranno più trascritti, quindi-non ci

sara piu repressione. SISTEMA FLIP FLOP o inversione di fase. (flagello in fase uno o flagello in fase 2)

ENZIMI DI RESTRIZIONE

enzima che taglia il dna in punti specifici riconosciuti da questi enzimi. ci sono tre classi e quelli

strettamente di restrizione sono quelli di classe 2, perché sono quelli che tagliano in modo più preciso.

Perché la cellula ha bisogno di questi enzimi?

Ci sono molti ceppi di escherichia coli indicati con lettere diverse, prendendo i ceppi K e B. se infetto K con

un batteriofago che era stato fatto crescere in un coli K, ci saranno molte progenie virali, se utilizzo un virus

fatto crescere su coli B, si riproduce molto bene su coli B a non su coli K, questo indicava che la produzione

del virus era ristretta al ceppo su cui era stato fatto crescere.

Si scopri che dentro la cellula batterica si creano degli enzimi che tagliano il dna, e non a caso, ma

riconoscono una determinata sequenza che può essere più o meno lunga da 4 a 8 nucleotidi.

quando il batteriofago infetta il dna virale viene attaccato dentro la cellula, in tutti i punti in cui la sequenza

vien riconosciuta . Gli enzimi pero non fanno distinzione quindi possono tagliare anche il dna del batterio.

esistono anche enzimi di modificazione, cioè gli enzimi che metilano il dna in modo che non venga

riconosciuto dagli enzimi di restrizione. se il virus si riproduce pero anche il suo dna verrà metilato quindi

non potrà più essere distrutto.

Questo metodo viene usato in molti casi nell’ingegnera genetica

Gli enzimi di restrizione possono tagliare in più modi, può tagliare in modo piatto oppure creare due

estremità a filamenti singoli complementari, con l aggiunta di un frammento e di altri due filamenti

complementari, avremo un plasmide più grande dell originale e una volta dentro la cellula verrà duplicato,

è l abc del CLONAGGIO.

STROMATOLITI

Sedimenti lasciati dall’attività metabolica dei microrganismi, e fatta da carbonati di calcio, è un fenomeno

estremamente lento e impiega moltissimi anni.

CLASSIFICAZIONE di tipo Linneano.

Definizione di specie:

Due individui sono della stessa specie se sono fecondi e generano un altro individuo

fecondo.

Per quanto riguarda i microrganismi pero non sono sessuali, quindi in base a cosa faccio una classificazione?

La classificazione de microrganismi è molto variabile poiché ci sono sempre nuove scoperte e nuovi metodi

per studiarli.

CONCETTO FILOGENETICO PER LA CLASSIFICAZIONE DEGLI ESSERI VIVENTI.

Se parliamo di filogenesi, stiamo studiando l'origine degli esseri viventi, quindi sapendo due individui di

specie differenti, analizzando i suoi antenati troveremo un antenato comune. Quindi due organismi

saranno tanto più simili quanto più sarà vicino nel tempo il loro organismo ancestrale comune.

SCALA EVOLUTIVA .

Il primo organismo vivente era unicellulare, sicuramente procariote, come lo collochiamo nel tempo? Lo

studio dei reperti fossili e solo di animali e piante, è molto difficile averne uno di una cellula batterica e i

dati on sono mai attendibili. Se guardiamo l'effetto dell’attività dei microrganismi nella terra. Poiché sono

coinvolti nella modifica dell’ambiente, si possono studiare quei depositi delle rocce e il segnale è più

vecchio sono gli stromatoliti. Essendo depositi minerali possono essere collocate nel tempo, e si può

calcolare l'origine della vita a circa quattro miliardi di anni fa.

Nella terra c e pochissimo ossigeno, questi esseri stanno in un ambiente ostile ma loro stanno bene e si

riproducono, tra questi compaiono anche i cianobatteri, sono molto importanti poiché fanno una

fotosintesi di tipo vegetale e producono ossigeno, quindi dopo miliardi di anni, l'atmosfera cambia e

contiene ossigeno. Iniziano a esserci le condizioni idonee per la nascita di animali e piante.

Per miliardi di anni il pianeta era formato da soli microrganismi che piano piano hanno colonizzato tutte le

nicchie ecologiche che poi piano piano hanno iniziato a specializzarsi.

La variabilità degli organismi aumenta avvicinandosi agli anni nostri, questo fa parte dell’evoluzione.

Grazie alla forte plasticità del loro genoma, l’evoluzione ha giocato su questi microrganismi generando una

grandissima variabilità.

IL MONDO A RNA

Una vita pre-cellulare si suppone fosse basato a rna world poiché l'rna può auto replicarsi, riboezimi.

QUANTE CELLULE BATTERICHE CI SONO?

4-6 x 10^30 cellule procariote

secondo alcun autori la quantità di carbonio contenuta nelle cellule batteriche e uguale a quella presente in

tutti gli altri esseri viventi. La diversità microbiotica potrebbe essere 10^12 specie.

OROLOGI EVOLUTIVI

Se questo mondo si volesse osservare guardando organismi che crescono in laboratorio sarebbe in

possibile, ci vogliono ambienti adatti, perciò ne conosciamo soltanto una piccolissima parte.

Per ricostruire la filogenesi di un organismo abbiamo bisogno di un metodo cioè quello degli OROLOGI

BIOLOGICI. Bisogna perciò paragonare i loro genomi, partendo da uno stesso ancestrale, i due genomi

hanno iniziato a modificarsi, più i genomi sono diversi, più l'ancestrale e antico e quindi hanno avuto più

tempo per modificarsi.

Solo una piccolissima parte di quegli organismi esistenti e stata descritta, meno dell’1%.

CARATTERISTICHE DELLA SQUENZA

1. Dev'essere in tutti gli organismi che vogliamo catalogare, più e diffusa meglio e.

2. La sequenza deve codificare funzioni identiche o simili

3. Le sequenze devono poter essere allineate per poterle confrontare

4. la sequenza deve variare con una velocita commisurata alla distanza filogenetica che vogliamo misurare.

Se vogliamo paragonare due individui molto lontani filogeneticamente, se la sequenza varia molto

velocemente e il tempo e molto lunga, potrebbe esserci stata una variazione da A a C, ma C potrebbe

essere tornata A e noi non vediamo il cambiamento, quindi bisogna usare sequenze vicine tra di loro.

Come decisione finale e stata quella di considerare l'rna ribosomiale.

Tutte le cellule fanno sintesi proteica quindi tutte le cellule contengono rna ribosomiale, per cui possiamo

considerare queste sequenze per vedere le caratteristiche comuni. Se noi prediamo il genoma e

consideriamo i geni per l'rna ribosomiale 16s, prendiamo una sequenza molto corta per cui vengono usati

sistemi di amplificazione.

PCR sequenza a catena della polimerasi ci permette di aver e molte copie di una stessa sequenza.

Questa sequenza è chiamata sequenza bersaglio, noi creiamo dei corti polinucleotidi che possono andarsi

ad appaiarsi sui singoli filamenti della sequenza bersaglio (doppia), i singoli oligonucleotidi servono da inizio

per la polimerasi. Se dopo averla duplicata denaturiamo di nuovo e rimettiamo gli oligonucleotidi avremo

una cascata di raddoppiamenti che aumenteranno in modo esponenziale.

Facendo più cicli in modo automatico usiamo una polimerasi che non sia inattiva quando denaturiamo con

il calore il dna, la polimerasi viene da un organismo ipertermofilo, il termo sacquaticus che vive ad alte

temperature.

Se parto da dieci copie, dopo venti cicli ci saranno 10^7 copie.

Supponiamo di avere il dna isolato del rna ribosomiale 16s, avendo i primer da una parte e dall'altra

possiamo sdoppiarli. (Amplificazione 16s rDNA, immagine)

Le parti variabili sono quelle che variano da un microrganismo e l'altro, mentre quelle conservative sono

quelle che rimangono sempre uguali.

Si usano primer universali per i batteri, oppure ci sono primer universali per i batteri azoto fissatori o

comunque per batteri più specifici con alcune caratteristiche.

Mettendo tutto insieme avremo un albero filogenetico che mostra come il mondo dei viventi sia diviso in

tre grossi domini, uno eucariote e due procarioti.

BACTERIA, ARCHEA e EUKARIA.

"LUCA" il primo organismo vivente.

Fin dall'inizio c'è stato un differenziamento tra archea e bactheria, i secondi sono andati subito verso la loro

strada.


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9 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

Conoscenze di base sul mondo dei microrganismi e descrizione delle tecniche principali necessarie per il loro studio. La cellula batterica: capsula, flagelli e fimbrie, parete, membrana cellulare, genoma. Metodi di sterilizzazione. Terreni di coltura. Determinazione della massa e della concentrazione cellulare. Curva di crescita batterica. Metabolismo microbico. Criteri di classificazione e metodi di identificazione dei microrganismi. Genetica microbica.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Petrina08 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia con laboratorio e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Mastromei Giorgio.

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