Microbiologia con immagini

Microbiologia

Lezione 20/9/2016

Origine

Studia la vita di organismi non visibili ad occhio nudo, quindi erano necessari degli strumenti. 1700 Lewenhock: invenzione del microscopio.

Teoria generazione spontanea (Spallanzani e Redi)

Forme viventi potevano formarsi da materia organica in decomposizione. REDI: protegge la carne dalle mosche. SPALLANZANI: scalda delle infusioni, il brodo diventa torbido perché i sono già microorganismi che si riproducono, ma se scaldo chiudendo il recipiente i batteri non ci sono. Le teorie contro di lui sottolineavano che se chiudo non c’è aria e quindi non possono esserci esseri viventi. APPERT: introdusse il cibo in scatola, riscalda un contenitore ermetico, senza l’aria non ci sono batteri. PASTEUR: versa il brodo in un’ampolla di vetro sterile, il collo viene ato alla fiamma e modificato nella forma, non è chiuso c’è un contatto con l’aria. Il campione viene scaldato ma non diventa torbido. Se l’ampolla però viene rigirata i batteri entrano perché sono solo nella parte iniziale. Pasteur scopre l’importanza dei batteri nelle malattie e nei processi industriali.

LISTER 1867: Aspsi chiurgica con uno spray di fenolo, una potente sostanza disinfettante. KOCH: mise le basi della batteriologia medica POSTULATI DI KOCH

Caratteristiche dei microorganismi

Sono alla base di tutti gli organismi, le cellule procariote sono le prime comparse sulla terra. GRANDE VARIABILITA’ più di animali e piante, GRANDI QUANTIA’ anche in poco spazio, GRANDE CAPACITA’ DI ADATTAMENTO, infatti basta che ci sia acqua. Sono necessari per la trasformazione delle materie necessarie per la vita, TRASFORMAZIONE LA GEOSFERA, formano depositi minerali, INFLUENZANO IL CLIMA. SIMBIOSI con piante e tra di loro, causa MALATTIE e influenzano il comportamento di piante e animali, cono comparsi prima. GRANDI CAPACITA’ METABOLICHE.

22/09/2016 Biosintesi mureina

Parete

Permette di vivere in ambiente ipotonico sennò scoppierebbe. MUREINA, sostanza della parete Da NAG-6-P avviene uno spostamento del gruppo fosfato, poi successivamente un attivatore opera lascissione del gruppo fosfato e si crea UDP-NAM, ma mancano gli amminoacidi. Questo è un esempio di mureina di “sreptococcusaureo”. Vengono aggiunti gli amminoacidi.

L’enzima RACEMASI cambia la forma dell’amminoacido da L a D, in base alla quantità di substrato. La mureina si trova all’esterno, quindi ci dovrà essere un passaggio tra l’ambiente citoplasmatico e la parete. Il BACTOPRENOLO si lega al nucleotide con due legami P, è una MOLECOLA TRASPORTATRICE che porta la molecola alla parete per allungare la mureina. Per creare il ponte aminoacidico c’è bisogno del NAG che arriva dalla prima fase della biosintesi, parte di quella che si crea viene utilizzata in questo momento e serve per legarsi al NAM.

I legami peptidici vengono fatti da un enzima, i tRNA carichi vengono inseriti a questo punto. La molecola viene portata oltre la membrana fino alla parete e agganciata alla mureina in crescita con la perdita di BACTOPRENOLO-P che poi verrà riutilizzato.

Il legame tra le catene avviene grazie alla TRANSPEPTIDASI, la reazione avviene all’esterno e l’enzima prende energia rompendo i legami tra l’alanina 4 e la 5, per questo troviamo solo 4 amminoacidi per ogni molecola e non cinque, perché l’ultimo si perde quando avviene il legame.

A livello della mureina riconosciamo due tipi di catene che si intrecciano fra loro a formare un sistema "trama/ordito", che determina una notevole rigidità parietale. Le catene in questione sono:

• Catene glicaniche: sono costituite da monomeri di N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM), uniti fra loro da legami glicosidici β(1-4). Questi monomeri sono sempre alternati (non si trovano mai due NAM o due NAG consecutivi) a formare dei dimeri che sono la costituente base delle catene glicaniche. NAM e NAG differiscono solo per la presenza, nell'acido muramico, di un residuo lattilico a livello del C3; questo residuo è molto importante in quanto fornisce un sito di aggancio per le catene peptidiche.
• Catene peptidiche: alle catene glicaniche, tramite il residuo lattilico dell'acido muramico, è legato quello che viene definito tetrapeptide, in quanto catene costituite da 4 aminoacidi, che si legano al gruppo COOH dell'acido muramico tramite legame peptidico. Queste catene sono fondamentali per la formazione dei legami crociati: ogni catena glicanica è legata ad altre catene glicaniche parallele, tramite legami che si instaurano fra i tetrapeptidi delle due catene. Nel caso dei batteri Gram+ le catene peptidiche non formano legami diretti fra loro, ma sono unite tramite un ponte di pentaglicina, legato al terzo aminoacido di una e al quarto dell'altra. Da notare che, malgrado possano esserci delle variazioni a livello della composizione della catena tetrapeptidica, il terzo aminoacido, solitamente una L-Lys, deve essere un aminoacido bibasico, ovvero avere due gruppi aminici, uno per il legame con l'aminoacido precedente e uno per il legame con il ponte di pentaglicina. Da notare che solitamente il tetrapeptide è composto da L e D aminoacidi che si alternano.

Nella tabella possiamo vedere come la parete tra GRAM+ e GRAM- sia di diverso spessore e contenga una differente quantità di mureina, questa differenza però non incide sulle funzionalità della parete.

Gram+ vs Gram-

La parete è una struttura spessa e uniforme. La parete è più sottile.

Gram+

I batteri Gram-positivi sono in grado di trattenere la colorazione del cristalvioletto a causa dello strato di peptidoglicano presente nella loro parete cellulare. Oltre alla mureina sono presenti ACIDI TEICOICI: sono una componente importante nella parete dei batteri gram positivi. Essi sono molecole che attraversano completamente la parete e sono dei polimeri di alcoli polivalenti legati tra loro attraverso un gruppo fosfato. Si dividono in due gruppi:

• Glicerol - teicoici: chiamati così perché l'alcol che forma tali polimeri è il glicerolo.
• Ribitol - teicoici: l'alcol che forma il polimero è il ribitolo.

Avendo una carica negativa, questi acidi rendono negativa la parete dei gram positivi. Essi non sono presenti nei gram negativi. Per la loro sintesi richiedono molto fosfato. In sua carenza i batteri producono in alternativa acidi teicouronici.

Poiché gran parte delle molecole che servono per la nutrizione sono macromolecole, queste devono essere scisse in molecole più piccole per poter oltrepassare la parete, nei Gram+ queste molecole vengono scisse all’esterno, ma innanzitutto gli enzimi diminuiscono per diffusione più ci si allontana dalla parete e inoltre dopo essere scisse, tutti gli organismi intorno possono beneficiare delle molecole ottenute e gran parte del lavoro andrà perso.

Gram–

La mureina nei gram-negativi è monostratificata; non tutti gli acidi muramici portano legato un tetrapeptide, e di conseguenza la quantità dei legami crociati è molto minore rispetto a quella dei gram-positivi. C’è un membrana esterna, simile all’interna ma non uguale. Qui troviamo uno spazio periplasmatico, in questo modo riescono ad utilizzare tutto ciò che trovano e scindono per nutrirsi senza che vada perduto, in questo spazio infatti troviamo moltissimi enzimi e permette un trasporto migliore della molecole all’interno.

Ci sono inoltre delle condutture, delle proteine chiamate PORINE che permettono il passaggio all’interno delle molecole. Troviamo anche lipopolisaccaridi, polisaccaridi legati a lipidi, il polisaccaride è la struttura esterna più visibile e sarà la prima ad essere vista all’esterno, quando la cellula muore, il lipide viene rilasciato come tossina.

Negli ARCHEA abbiamo un’eccezione, infatti c’è uno pseudopeptidoglicano, al posto del NAM hanno il NAT, Acido N-acetiltalosaminuronico. Il legame è β 1-3 ed è insensibile al lisoezima.

La membrana citoplasmatica

È un sito di ancoraggio per le proteine e serve anche per la FORZA PROTOMOTRICE per i movimenti, la fotosintesi ed altri processi metabolici. È uno doppio strato fosfolipidico formato da glicerolo più fosfato che formano lo strato IDROFILICO e acidi grassi interni che formano lo strato IDROFOBICO.

STRUTTURA A MOSAICO FLUIDO, le molecole non hanno una collocazione ben definita. Anche qui gli ARCHEA differiscono dai bachteria, infatti hanno una diversa membrana. -il legame tra glicerolo e acido grasso è ETERE e non estere. -l’acido grasso è una molecola di FITANILE ed è ramificato mentre nelle atre membrane sono lineari -D-GLICEROLO tetraetere 2 fitanili legati da due legami covalenti formano una sola molecola, quindi alcuni archea hanno una membrana MONOSTRATIFICATA, questo implicherà una minor fluidità.

La fluidità è influenzata dalla temperatura, gli archea infatti stanno alle temperature di circa 100°, la membrana bistratificata è solida a temperature normali e si scioglie ad alte temperature, mentre bistratificata è fluida ad alte temperature e solida a temperature normali.

Trasporto

L’acqua è l’unica molecola in grado di passare tranquillamente, dopo di lei c’è il glicerolo che passa con una difficoltà mille volte superiore, poi ioni, amminoacidi ecc..

• Trasporto semplice
• Traslocazione di gruppo, la molecola viene modificata all’interno prima di essere rilasciata
• Sistema ABC, viene consumata energia per il trasporto.
• Uniporto
• Antiporto, una molecola entra ed un'altra esce
• Simporto, ne entrano due contemporaneamente

Un esempio per la traslocazione di gruppo è il GLUCOSIO, prima di essere rilasciato viene modificato in glucosio6p.

DNA di Eschierichia Coli

Il DNA di Eschierichia Coli è circa 1mm, nei plactomicete il nucloide è racchiuso in una membrana simile a quella eucariote. Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono simultaneamente e la sua degradazione può avvenire anche durante la sintesi. Devono rispondere velocemente ai cambiamenti, il messaggero viene detto POLICISTRONICO, contiene informazioni per più proteine contemporaneamente.

["Policistronico”: si riferisce alla complementazione cis/trans, metodo della genetica classica per misurare i geni e la loro posizione, cis o trans se la complementazione era sulla stessa molecola o su molecole differenti.]

Negli EUCARIOTI la trascrizione e la traduzione avvengono in due momenti differenti e pure in luoghi differenti, il messaggero infatti deve subire alcune modificazioni per eliminare gli introni. Il DNA è superavvolto, serve per la compattazione, il DNA circolare a doppio filamento è una molecola molto grande e deve racchiudersi in poco spazio, si creano delle anse e delle proteine specifiche chiamate “istoni simili” si occupano del superavvolgimento.

Cromosomi batterici

C’è una grandissima varietà, infatti possiamo trovare rari casi in cui le molecole di DNA sono due anziché una, le dimensioni sono molto varie e in alcuni organismi, specialmente quelli che vivono nel terreno, il genoma è più lungo, questo perché devono poter svolgere più funzioni e necessitano di più informazioni.

Citoscheletro

Non si trova sono nelle cellule eucariotiche, infatti è stato trovato anche nei batteri e negli archea. Il suo ruolo principale è durante la divisione cellulare e per dare forma alla cellula.

Microscopia a fluorescenza

Marcatori con un anticorpo permette di marchiare determinate parti che se attraversate da onde specifiche emettono fluorescenza. Si può marchiare con più colori molecole diverse.

Vescicole gassose - Cianobatteri

Nello stagno notiamo un colore verdastro perché ci sono batteri fotosintetici che vivono in ambiente acquatico e devono salire in superficie, hanno delle vescicole all’interno, queste sono costituite da TUBULI, strutture rigide che fanno galleggiare perché alleggeriscono la struttura della cellula che quindi sale verso l’alto.

Endospora di clastidium tetani

Due grossi gruppi GRAM+, Bacillus e Clastridum, in condizioni sfavorevoli formano una spora al loro interno, è una cellula differenziata che cresce dentro la cellula madre che poi morirà e rilascerà la spora. Si può formare in zone diverse, sono molto rifrangenti e si notano bene.

La SPORA è una forma di sopravvivenza quindi dentro c’è una SOLA COPIA di genoma, il DNA è compattato e dal punto di vista metabolico è ferma, c’è poco citoplasma poiché l’acqua andrebbe contro la sopravvivenza ma è comunque necessaria per gli enzimi.

Ha molti rivestimenti per impedire il passaggio di sostanze, si crea quindi un ambiente totalmente ISOLATO. Alcune spore sono resistenti al calore per la poca acqua che contengono, sopravvive a condizioni estreme e per tempi molto lunghi. Se l’endospora viene danneggiata da dei raggi UV, questa deve attivare il proprio DNA per creare degli enzimi che autoripararsi sennò non potrà diventare cellula vegetativa.

Sporificazione

Le prime fasi sono reversibili perché nel caso migliorassero le condizioni può tornare indietro, mentre le successive sono irreversibili.

Germinazione

La spora torna vegetativa solo se le condizioni sono tornate favorevoli.

• Segnale di attivazione, necessario ma non sufficiente, infatti la spora deve assicurarsi che sia vero
• Sparisce la rifrangenza
• Si rompono gli involucri

Cristalli parasporali

Bacillus thuringiensis produce delle proteine durante la sporificazione, queste proteine sono tossiche per le larve di lepidotteri i quali sono dannosi per molte colture, quindi spesso vengono usate negli insetticidi per uccidere le larve.

I batteri dormono?

La popolazione batterica si addormenta in condizioni sfavorevoli, cioè ABBASSANO IL LORO METABOLISMO e se le condizioni cambiano ricominciano a crescere, questo cambiamento viene notato da un solo individuo che si riattiva per la comunità, avverte se è le condizioni sono migliorante ma nel caso in cui non fosse così, il batterio risvegliato muore, si sacrifica per la comunità, questo dimostra che ci sono dei segnali che uniscono i microorganismi.

27/9/2016 Sterilizzazione

Definizione

Situazione in cui vengono uccisi o rimossi tutti gli organismi viventi ed eventuali virus, nel campione. È una riduzione della carica microbica, non ci sono sterilizzazioni parziali, o lo è o non lo è. Qualunque tecnica utilizzata intacca in parte anche il campione quindi prima di effettuare una sterilizzazione bisogna chiederci perché lo facciamo? Qual è il nostro obiettivo? Cosa ho necessità di togliere? e scegliere il metodo migliore.

Metodi di sterilizzazione

1. Calore

Cosa succede ad una popolazione di organismi quando viene scaldata?

Possiamo vedere dal grafico che all'aumentare della temperatura la morte delle cellule avviene più velocemente. TEMPO DI RIDUZIONE DECIMIALE, è il tempo necessario per uccidere il 90% delle cellule. La percentuale di riduzione è costante, non il numero di cellule che viene ucciso. Come si vede, la sterilizzazione non è totale. Ma la scala logaritmica arriva a 0,001.

Relazione tra temperatura e tasso di letalità

Se metto un campione di spore batteriche, resistenti al calore, posso fare un controllo perché se il calore uccide le spore allora ucciderà anche i batteri che sono meno resistenti.

Strumenti

• Fiamma: incenerisce le cellule, rischia di incenerire anche il campione quindi serve per materiali resistenti alla fiamma (ago, pinze ecc). Viene usato negli inceneritori per smantellare materiali ospedalieri. Spesso però il calore della fiamma può far disperdere le cellule prima ancora di ucciderle quindi ci sono dei filtri per impedire che questo accada.
• Calore secco: Usando una stufa a 160° per 2-3 ore. L'aria è un cattivo conduttore e servono quindi tempi molto lunghi, inoltre elimina acqua ma la cellula senza acqua vive meglio quindi è più resistente e ci vuole maggior tempo. Si possono sterilizzare campioni in contenitori poiché è difficile mantenere la camera sempre sterilizzata. In questo caso devono essere utilizzati contenitori resistenti al calore come vetro o metallo.
• Calore umido: In questo caso si usa un AUTOCLAVE. Funziona come una pentola a pressione, il campione si trova dentro ad una camera in cui c'è del liquido, come l'acqua che una volta scaldata crea vapore. Poiché la camera è chiusa ermeticamente, per la legge dei gas perfetti il liquido non evapora ma aumenta la pressione e di conseguenza anche la temperatura che arriva circa a 120° (= 1 atm), impiegandoci circa 30 min. Il tempo è ridotto perché l'aria viene spinta fuori dalla pressione e sostituita dal vapore, inoltre le cellule sono ricche di acqua grazie al vapore e muoiono prima. Questo processo però non uccide le spore.

Uccisione dei microrganismi con calore umido

Cellule vegetative Spore Lieviti 5 min 50-60° 5 min 70-80° Muffe 30 min 62° 30 min 80° Batteri (mesofili) 10 min 60-70° 2-800 min 100°/ 0,5-12 min 121° Riguardo alle spore fungine si parla di spore vegetative che non si riproducono quindi sono diploidi poiché i gameti sono aploidi.

2. Pastorizzazione

Non è una vera e propria sterilizzazione poiché serve solo per l'abbattimento della carica microbica. Nasce con PASTEUR, per questo assume questo nome. Egli si accorse che i microrganismi vivevano molto bene nel latte e utilizzò un trattamento a circa 60-65° per 30 min. Adesso nella pastorizzazione istantanea si scalda.