Microbiologia, batteriologia e virologia, Basi biologiche

Citoplasma

Strutturato allo stato di gel non presenta vacuoli.

Povero di organuli cellulari, composto per la maggior parte da acqua con sostanze organiche e

inorganiche, contiene ribosomi e cromosoma batterico.

Strutture citoplasmatiche: Nucleoide → Regione del citoplasma non separata da membrana,

contenente il materiale genetico sotto forma di unico

cromosoma.

Plasmidi → Piccole porzioni di DNA extra-cromosomiale a doppia elica

di forma circolare capaci di sintesi autonoma.

Sintetizzano i fattori di resistenza antibiotica e produzione di

tossine.

Ribosomi → Presenti in un numero elevato, ma assenti sul reticolo

endoplasmatico.

Cromosoma batterico

DNA non racchiuso in una membrana nucleare, ma sparso nel citoplasma.

Singola molecola di DNA ripiegata più volte su se stessa → Aploide.

Presenza di plasmidi nel citoplasma.

Azione patogena e fattori di virulenza

Attività Patogena Carica Microbica

Fattori di virulenza Invasività Altro

Enzimi

Inibizione

Adesività della fagocitosi

Tossine

Virulenza → Grado col quale un MO esprime la patogenicità, influenzato da una serie di fattori.

Schematicamente: Produzione di tossine e Invasività.

Adesività: Capacità di aderire ad un substrato data dalla presenza di pili.

Capacità di inibire la fagocitosi: Data dalla presenza della capsula permette l'aumento di virulenza

dei MO impedendo l'attacco dei fagociti.

Produzione di enzimi extracellulari e fattori diversi: Permettono di invadere più facilmente l'ospite.

- Ialuronidasi

- Coagulasi

- Streptochinasi

- Collanegenasi

- Emolisine

- Leucocidine

Diagnosi batteriologica: Fase Pre-Analitica

Raccolta del materiale biologico

Distretti sterili: Sangue, Midollo, LCR, Liquidi provenienti da tessuti profondi.

Distretti contaminati in fase di prelievo: Vie respiratorie inferiori, urine.

Zone che possiedono una flora residente commensale: Bocca, naso, cute, vie respiratorie superiori,

tratto gastrointestinale e genitale femminile.

Materiale sterile + Prelievo in condizioni sterili + Buon esame batteriologico.

Trasporto in laboratorio veloce + Semina in terreni adatti

Materiali che provengono da distretti colonizzati

Risultati interpretati e necessità di ricercare il contesto della flora contaminante la specie patogena

sospettata.

Raccolta del campione

Dialogo tra clinico e laboratorio.

Dati anamnestici sul paziente.

Strumentazione e dispositivi di raccolta idonei.

Momento del prelievo.

Prelievo prima del trattamento antibiotico.

Prelievo in prossimità del laboratorio e direttamente in sede d'infezione.

Quantità necessaria del materiale in esame.

Evitare contaminazioni.

Terreni di trasporto e mantenimento.

Identificazione del campione

Contenitore opportunamente contrassegnato e confezionato prima del trasporto.

Contenitore identificato con etichetta con relativo codice a barre e foglio di richiesta.

Trasporto del campione

Adeguati contenitori sterili, trasporto rapido a temperatura controllata in apposite buste a due

scomparti per evitare la dispersione del materiale biologico.

Campione non idoneo per l'indagine di laboratorio

Campione non identificabile (assenza di etichetta o richiesta),Trasporto dilazionato

Contenitore improprio

Campione contaminato dalla flora residente o da materiale estraneo

Due campioni identici inviati contemporaneamente (tranne sangue)

Campione non idoneo per l'indagine richiesta

Quantità non sufficiente.

Diagnosi batteriologica: Fase Analitica

Due strategie di approccio alla malattia:

- Direttamente attraverso la ricerca dell'antigene o del MO

- Indirettamente attraverso l'evidenza di una risposta anticorpale in risposta all'antigene microbico.

Sospetta infezione batterica

Diagnosi diretta Diagnosi indiretta

- Sangue Siero del paziente

- Feci Metodo

- Urine immunologico

- Biopsie

- Tamponi - Saggio immunoenzimatico (EIA)

- Saggio radioimmunologico (RIA)

- Saggio di immunodefluorescenza (IFA)

Diagnosi rapida Metodo molecolare

Metodo immunologico

Semina su brodo di

arricchimento, terreno solido

non selettivo e/o selettivo

Isolamento del MO Antibiogramma

Identificazione

- Biochimica

- Immunologica

- Molecolare

Diagnosi diretta

Esame microscopico, isolamento sei batteri su terreni di coltura, identificazione morfologica,

antigenica e biochimica ed antibiogramma.

Visualizzazione diretta del MO al microscopio

Primo screening rapido ed economico.

Visibile l'aspetto morfologico.

Colorazione: Differenziale (Gram)

Acido resistente (Ziehl-Neelsen)

Fluorescente (metodo di Truant)

Tipologie di microscopi: Microscopio ottico composto in campo chiaro

Microscopio a contrasto di fase

Microscopio in campo oscuro

Microscopio ad interferenza

Microscopio a fluorescenza

Microscopio elettronico

Colorazione di Gram

Striscio su vetrino fissato al calore

Violetto di genziana (1min) → Alcool (20sec) → Safranina (2 min)

Gram + → Viola Gram - → Rossi

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Fucsina basica → Evaporazione a caldo (5min) → Alcool (2min) → Blu di metilene (2 min).

Ad ogni passaggio lavaggio con acqua.

Coltivazione dei batteri

Quasi tutti i batteri possono essere coltivati in laboratorio.

Terreni: Liquidi (campione arricchito di batteri) e Solidi (crescita in colonie separate o pure).

Strumenti per l'isolamento microbico

Ansa, Becco bunsen, Tampone sterile, Pipette graduate, Pipette pasteur, Piastre petri.

Terreni

Terreni di arricchimento → Promuove lo sviluppo non selettivo di tutti i batteri.

Terreni selettivi → Consentono la crescita della specie batterica da isolare.

Terreni differenziali → Contengono sostanze che reagiscono a particolari reazioni chimiche.

Terreni cromogeni → Terreni differenziali che presentano substrati con composti cromogeni.

Isolamento in coltura ed identificazione del MO

Successo della coltura dipende: Da raccolta/trasporto del campione.

Selezione del terreno.

Esigenze di crescita.

Semina del campione a 37°C x 24h, valutare le caratteristiche delle colonie ed eventuale crescita in

terreni diversi.

Le colture pure forniscono i campioni per testare la suscettibilità antimicrobica.

Valutazione delle colonie: Dimensione, Forma, Colore, Margine, Rilievo, Superficie, Trasparenza,

Consistenza ed aderenza al terreno.

Determinazione delle proprietà metaboliche

Test della catalasi → Degradazione del perossido d'idrogeno ad acqua e ossigeno.

Test dell'ossidasi → Produzione di prodotto con colore scuro.

Test dell'ureasi → Idrolisi dell'urea in ammoniaca e biossido di carbonio.

Test della coagulasi → Formazione di un coagulo se batteri incubati in presenza di plasma.

Test basati sulla presenza di vie metaboliche → Kit commerciali usati per l'identificazione in base

all'attività biochimica.

Substrati inoculati con l'isolato batterico e dopo

5ore si traccia il profilo metabolico.

Sistemi automatizzati (VITEK) → Inoculo batterico trasferito in piccole schede con pozzetti

contenenti terreni; un fotometro misura i cambiamenti di colore

dei pozzetti dalla scheda.

Test di suscettibilità agli antibiotici

1. Metodo della diffusione per dischetti (Kirby-Bauer)

Suscettibile: Formazione di alone di inibizione attorno al dischetto.

2. Determinazione della concentrazione minima inibente (MIC)

Concentrazione più bassa di antibiotico capace di impedire completamente lo sviluppo batterico.

Test che consiste nella semina di provette contenenti terreno idoneo e concentrazione scalate di

antibiotico.

Diagnosi diretta – Individuazione degli antigeni microbici

Diagnosi di infezione effettuata ricercando molecole presenti nei materiali patologici.

Test di agglutinazione → Lattice e altre particelle facilmente rivestibili con anticorpi per

l'individuazione di antigeni.

L'aggiunta del campione alle particelle provoca agglutinazione visiva.

Tecnica ELISA

Immunofluorescenza

Individuazione di DNA o RNA microbico

Individuazione di sequenze brevi, uniche e specifiche di un determinato patogeno.

Metodi di ibridazione diretta → Frammento di DNA complementare a quello di interesse con

all'interno una sonda marcata.

Metodi di amplificazione → Amplificazione di sequenze bersaglio, strumenti analitici più potenti

del rilevamento diretto mediante ibridazione diretta.

Rapidi, Efficienti, Facile esecuzione, Specifici, Costosi, Possibili falsi

positivi.

Identificazione di anticorpi sierici

Possono fornire la prova di un'infezione in corso o pregressa causata da un MO specifico.

IgM normalmente transitorie indicative di infezione primaria recente.

IgG comparsa tardiva, raggiungono un picco in 4-6settimane e persistono per tempi prolungati.

Infezione attiva → Diagnosi di incremento delle IgG di almeno 4 volte in 2 campioni successivi.

Virologia generale

Generalità

Parassiti endocellulari obbligati (realizzano il loro ciclo vitale all'interno delle cellule degli

ospiti e a spese dell'ospite).

- 1892: Agenti infettivi, più piccoli dei batteri, vennero chiamati virus filtrabili.

- 1898: Dimostrato che i virus si moltiplicano nelle cellule infettate.

- 1900: Alcuni virus sono in grado di infettare le cellule batteriche (fagi o batteriofagi).

Dimensioni ridotte: 10-300 nm.

Struttura

Virione → Struttura cellulare; costituito da un nucleo centrale (core) che contiene l'acido nucleico

(DNA e RNA); il core è circondato dal capside (involucro proteico) costituito da

capsomeri (unità proteiche).

Nucleocapside → Insieme del nucleo e del capside.

Pericapside → Virus che posseggono una membrana lipoproteica.

Virus Rivestiti → Virus che possiedono il pericapside.

Virus Nudi → Virus senza pericapside.

Struttura del nucleocapside

Virione Elicoidale → Aspetto di bastoncini rigidi o filamentosi; i capsomeri si dispongono ad elica

e l'acido nucleico si trova nel core o nel solco interno dell'elica.

Virione Poliedrico → Generalmente di forma sferica con diametro da 25 a 300 nm; il capside ha

struttura geometrica (icosaedro) formata da capsomeri uguali o diversi tra

loro.

Virione Complesso → Soprattutto virus batterici associano una struttura poliedrica ed elicoidale;

assumono forme caratteristiche con testa poliedrica e coda elicoidale.

Pericapside

Involucro membranoso che avvolge i nucleocapsidi; porzione della membrana plasmatica della

cellula ospite.

- Doppio strato fosfolipidico → origine cellulare.

- Proteine al suo interno → origine virale.

- Pericapside è particolarmente diffuso fra i virus animali.

Genoma virale

Possiedono un solo tipo di acido nucl