immunologia e virologia

Virologia del genoma

Il 70% dei virus animali ha un genoma dell'RNA, mentre il 30% ha un genoma del DNA (sette famiglie di virus). Nella maggior parte dei virus a DNA, il genoma è a doppio filamento, sempre aploide, circolare o lineare, con l'eccezione del Parvovirus che ha un filamento singolo lineare e dell’hepadnavirus che ha un genoma parzialmente a filamento doppio. Trascrizione e replicazione avvengono nel nucleo.

Il DNA può essere:

• Doppia elica lineare
• Doppia elica circolare (es. papovavirus)
• Parzialmente a doppia elica circolare (es. Hepadnavirus)
• Singola elica lineare (es. parvovirus, adenovirus, virus dell'herpes, poxvirus)
• Singola elica circolare (es. Circovirus, papillomavirus, hepadnavirus, polyomavirus)

Nella maggior parte dei virus a RNA, il genoma è a singolo filamento ed è sempre lineare. Eccezioni sono i Reovirus che hanno un doppio filamento segmentato e gli Orthomyxovirus che hanno un singolo filamento frammentato.

L’RNA può essere:

• Lineare o circolare, a polarità positiva o negativa.
• Se la sequenza corrisponde a quella dell’mRNA virale, il filamento è definito a singola elica a polarità positiva (può fungere nella cellula direttamente da mRNA). Esempio: virus del mosaico del tabacco.
• Se la sequenza è complementare a quella dell’mRNA virale, il filamento è definito a singola elica a polarità negativa (funge da stampo per la sintesi dell’mRNA). Esempio: virus del morbillo, rabbia; i virus dell’influenza sono virus con genoma a ssRNA negativo.
• Doppia elica (es. Reovirus)
• Frammento a singola o doppia elica (es. orthomixovirus con 8 frammenti, bunyavirus con 3, reovirus con 12)

Struttura e composizione dei virus

La parola latina virus significa veleno. I virus sono entità biologiche caratterizzate da un livello subcellulare di struttura. Sono agenti infettivi responsabili di numerose patologie umane e animali. Si definiscono parassiti intracellulari obbligati, quindi possono moltiplicarsi solo all'interno di una cellula vivente e dipendono dall'apparato biochimico ospite. Devono entrare in contatto con una cellula ospite e penetrare in essa per potersi replicare. Sono di piccole dimensioni (< 0.2 mm), sprovvisti di ribosomi e di sistemi enzimatici deputati alla produzione di energia.

I virus sono in grado di alternarsi in due distinti stati: intracellulare ed extracellulare o infettivo. I virus maturi, cioè le particelle virali complete extracellulari, sono chiamati virioni. Si identificano con le particelle infettanti e si liberano al termine della replicazione virale. Il virione è costituito da materiale genetico formato da un solo acido nucleico metabolicamente inerte (DNA o RNA). Questo deve penetrare in una cellula vivente per esplicare la sua attività ed è contenuto in un rivestimento proteico chiamato capside, che ha il compito di proteggere il genoma virale e di favorirne l’entrata nelle cellule suscettibili.

A causa della natura di parassita obbligato, il virus può esprimere la sua attività biologica solo all’interno di una cellula ospite che permetta la completa espressione del suo genoma e la produzione di nuove particelle virali. Il virus quindi si lega alla superficie della cellula ospite e vi introduce il proprio genoma. Il genoma deve essere in grado di esprimersi e di utilizzare l’apparato sintetico della cellula per la sintesi dei costituenti virali. Questi costituenti si combineranno in modo da formare i nuovi virioni. I virioni prodotti, liberati dalla cellula, estenderanno l’infezione ad altre cellule dell’ospite. La replicazione virale può avvenire solo in cellule sensibili, capaci di far esprimere completamente il genoma virale.

Caratteristiche principali della cellula ospite

• Sensibilità: strettamente condizionata dalla presenza di adeguati recettori cellulari che permettono l’attacco del virus alla cellula ospite (adsorbimento).
• Permissività: dipende da tutti quei meccanismi molecolari-cellulari che risultano adeguati alla completa trascrizione del genoma virale e alla sintesi di tutte le proteine virus-codificate.

Tutti i virus contengono un solo acido nucleico: DNA o RNA. L’associazione dell’acido nucleico con il capside forma il nucleocapside. All'esterno del nucleocapside, in alcuni virus (orthomyxovirus, herpesvirus, poxvirus), si osserva la presenza di una membrana esterna che riveste il capside di natura lipidica detta pericapside o envelope o peplos. Questa membrana deriva dalla membrana della cellula ospite dalla quale è stato rilasciato il virus e contiene proteine chiamate peplomeri, glicoproteine e lipidi. Svolge funzione di riconoscimento antigenico e di penetrazione nella cellula ospite tramite il meccanismo di fusione con la membrana cellulare, grazie alle glicoproteine.

Le proteine che compongono il capside appartengono a uno o pochi tipi. Queste proteine sono identiche e sono dette capsomeri, fatte in modo tale da potersi auto-assemblare assieme in un modo predeterminato. (Capsomero: unità proteica che, ripetuta, forma il capside). Per molti virus, questo processo di auto-assemblaggio è facilitato dai cosiddetti chaperon molecolari, proteine che, pur facilitando la corretta conformazione e l’assemblaggio, non fanno parte della struttura finale. L’insieme del capside e del genoma è spesso definito nucleode. Quando il virus ha solo il capside che lo riveste, viene detto virus nudo; altrimenti, con involucro/envelope/pericapside.

Capside con envelope

I virus con l’involucro non uccidono necessariamente la cellula. Sono più labili rispetto ai virus con nucleocapside nudo. La struttura è sensibile all’essiccamento, all’ambiente acido, ai detergenti, ai solventi e al calore. Il virus sopravvive in ambiente acquoso ma non nel tratto gastrointestinale. Deve rimanere in ambiente umido e si diffonde mediante fluidi come sangue, secrezioni, aerosol, grosse gocce d’acqua. Non ha bisogno di uccidere la cellula per diffondersi.

Capside nudo

Al contrario, il virus nudo è resistente ai detergenti, solventi, all’ambiente acido, all’essiccamento e a alte temperature. Il virus nudo è rilasciato dalla cellula mediante lisi. Può essere diffuso facilmente (tramite fomiti, contatto delle mani, polvere, piccole goccioline d’acqua). Può essere essiccato e mantenere l’infettività e, a differenza del capside con envelope, può sopportare le diverse condizioni dell’intestino.

I virus sono altamente termosensibili; esposti a una temperatura di 55-60°C, dopo 30 minuti o dopo pochi secondi a 100°C, le proteine del capside vengono denaturate e il virus perde la capacità infettante. Stabili a bassa temperatura, vengono conservati a -70°C.

Simmetria virale

Le proteine destinate a formare il capside sono capaci di autocombinarsi (assemblaggio) caratterizzando la simmetria: elicoidale, cubica, complessa e binaria.

• Simmetria elicoidale (prevalentemente a forma di bastoncino): il capside è formato da subunità proteiche identiche chiamate protomeri che interagiscono con gli acidi nucleici e si dispongono lungo un asse elicoidale intorno all’acido nucleico a formare il nucleocapside, che assume struttura tubulare. (I protomeri si dispongono con un andamento a spirale per formare il capside cilindrico nella cui cavità si trova l’acido nucleico. Questa simmetria ha un solo asse di simmetria rotazionale che coincide con l’asse longitudinale del cilindro). Nella maggior parte dei casi, i virus animali con questa simmetria possiedono l’envelope. Gli involucri pericapsidici conferiscono ai virioni forma pleiomorfa. Esempi: virus del mosaico del tabacco (TMV), orthomyxovirus, rhabdovirus.
• Simmetria cubica o icosaedrica (a forma sferica): il capside costituisce una sorta di guscio per il genoma. Le subunità proteiche (i protomeri, singola molecola polipeptidica o aggregato di diverse molecole peptidiche) si raggruppano a formare le unità base del capside, dette capsomeri. I capsomeri si organizzano a costituire una struttura poliedrica regolare con 20 facce costituite da triangoli equilateri e 12 vertici. All’interno è situato il core, aderente in alcuni punti ai capsomeri. È presente nella maggioranza dei virus. I protomeri si dispongono in modo da formare un solido regolare cavo che più si avvicini alla sfera: un icosaedro. I virus con questa simmetria si differenziano per numero e distribuzione dei capsomeri. Alcuni sono virus nudi (es. adenovirus), altri posseggono l’envelope (es. herpesvirus).
• Virus a simmetria complessa: sono i virus con una struttura non classificabile secondo i canoni precedenti. Esempi: poxvirus (virus animali il cui virione possiede una complessa struttura ovaloide o cilindroide appiattito) e batteriofagi (virus contenenti RNA a simmetria cubica e a DNA con struttura complessa).
• Simmetria binaria: è la simmetria dei fagi, virus batterici.

I virus nudi di origine animale hanno una simmetria esclusivamente di tipo icosaedrico. I virus con envelope possono avere il nucleocapside sia a simmetria elicoidale sia a struttura icosaedrica. I virus più grandi (come i poxvirus) possono avere una struttura morfologica più complessa.

Mantello

Struttura presente su tutti i virus a simmetria elicoidale ed in alcune famiglie con capside a simmetria icosaedrica (es. herpes). La natura del mantello può essere lipidica o glicolipidica. I virus acquisiscono il mantello nella fase tardiva del ciclo d’infezione, dopo l’assemblaggio del nucleocapside. Il mantello origina dalla membrana nucleare nei virus herpes e dalla membrana citoplasmatica nei virus a RNA. Sul mantello sono presenti glicoproteine virali come l’emagglutinina, che permettono l’adsorbimento del virione sulle cellule sensibili. Virus senza mantello comprendono adenovirus e picornavirus.

Classificazione dei virus

La classificazione dei virus è il processo attraverso cui i virus vengono denominati e inseriti in un sistema tassonomico. I virus sono classificati principalmente in base a caratteristiche fenotipiche, quali morfologia, tipo di ospite (virus dei batteri, delle piante, virus animali) e patologia, tipo di acido nucleico, configurazione del genoma (ds, ss), modo di replicazione, simmetria del capside, presenza o assenza del pericapside. Sono due i principali schemi attualmente in uso per la classificazione dei virus:

• Il sistema dell'International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV): sistema che utilizza la struttura dei taxa. La classificazione inizia al livello di ordine, segue poi famiglia, sottofamiglia, genere e specie. Esempio di ordine: Herpes virales.
• La classificazione di Baltimore: è una classificazione dei virus proposta dal biologo David Baltimore che suddivide i virus in sette classi in base al loro genoma, se DNA o RNA, a singolo filamento (single strand, ss) o a doppio filamento (double strand, ds), a senso positivo (+) o negativo (-). Le classi sono indicate con numeri romani:

• Classe I: Virus a DNA a doppio filamento (es: Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae)
• Classe II: Virus a DNA a singolo filamento (es: Parvoviridae)
• Classe III: Virus a RNA a doppio filamento (es: Reoviridae)
• Classe IV: Virus a RNA a singolo filamento a senso positivo (es: Picornaviridae, Togaviridae)
• Classe V: Virus a RNA a singolo filamento a senso negativo (es: Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae)
• Classe VI: Virus a RNA a singolo filamento con intermedio DNA (es: Retroviridae)
• Classe VII: Virus a DNA a doppio filamento con intermedio RNA (es: Hepadnaviridae)

Fasi della replicazione virale

1. Adsorbimento (assorbimento/attacco): il primo passo è l’attacco del virus alla membrana citoplasmatica della cellula (alla superficie cellulare). (Contatto virus-cellula). L'attacco del virus alla cellula avviene tra le proteine presenti sulla superficie del virus - antirecettori - con le proteine complementari sulla membrana cellulare - recettori specifici cellulari. Il contatto consiste in un'attrazione di tipo ionico tra il virus e la cellula. L'attacco non richiede reazioni con produzione di energia ed è possibile solo con cellule che possiedono recettori idonei a reagire con gli antirecettori del virus. L'adsorbimento rende il virus non più neutralizzabile da anticorpi specifici e permette la fase successiva, cioè la penetrazione del virus.
2. Penetrazione: al contrario dell’assorbimento, questo processo richiede energia e quindi che la cellula sia metabolicamente attiva. Si verifica a 37°C e avviene quasi istantaneamente dopo l’attacco al recettore. Il processo di penetrazione dei virus nelle cellule animali avviene con intervento attivo delle cellule dopo la prima fase di adsorbimento. Sono necessarie temperature ottimali per le cellule. A seconda che il virus sia nudo o con envelope, la penetrazione avviene in diversi modi medainte:
   • Traslocazione: l’intero virione oltrepassa la membrana citoplasmatica ed entra come tale nel citoplasma (virus nudi).
   • Endocitosi nel caso di virus privi di involucro pericapsidico (meccanismo simile alla fagocitosi) dove avviene il trasferimento del virus all’interno di vescicole citoplasmatiche.
   • Per fusione con la membrana cellulare nel caso di virus provvisti di pericapside dove l’involucro si fonde con la membrana citoplasmatica, in questo modo il nucleocapside entra nel citoplasma (es: paramyxovirus ed herpesvirus). La fusione richiede l’intervento di specifiche proteine presenti nell' inviluppo del virione, quali ad esempio l'emoagglutinina del virus influenzale. Queste proteine mediano la fusione delle due membrane, virale e cellulare, cosicché il nucleocapside viene rilasciato direttamente nel citoplasma.
3. Esposizione dell'acido nucleico virale (uncoating, spoliazione): fase in cui il capside virale viene totalmente o parzialmente rimosso, ed il genoma viene liberato ed esposto, in modo da poter essere espresso.
4. Sintesi dei componenti virali: fase chiamata anche “eclissi”. Una volta che il genoma virale si è liberato del capside e ha raggiunto la propria sede, inizia la sintesi delle macromolecole virali che si suddivide in 3 fasi:
   • Trascrizione dell'informazione genica (genoma virale) in RNA messaggero.
   • Traduzione dei messaggeri virali con sintesi di proteine funzionali e strutturali (sintesi proteica → viene utilizzata l’RNA polimerasi).
   • Replicazione del genoma virale.

   NB → Trascrizione DNA: avviene nel nucleo; Trascrizione RNA: avviene nel citoplasma.

5. Assemblaggio: una volta sintetizzato un adeguato numero di copie di acido nucleico e proteine virali, i virioni possono essere “montati”. In gran parte dei virus, il capside è la parte montata per prima, tramite l’autoassemblaggio dei capsomeri virali. I capsidi sono successivamente riempiti di acido nucleico virale. Fase in cui avviene l’assemblaggio delle copie del genoma virale e delle proteine strutturali per formare i nuovi virioni. Tutti i virus a RNA si assemblano nel citoplasma delle cellule infettate mentre i virus a DNA si assemblano nel nucleo tranne i poxvirus nel citoplasma.
6. Liberazione della progenie virale dalla cellula ospite: è la tappa conclusiva del ciclo replicativo. Solo con la morte e la lisi delle cellule infette, i cui tempi dipendono dal tipo di virus e dal tipo di cellula, si ha liberazione di virus neoformati nell'ambiente esterno. I virus provvisti di peplos richiedono per il montaggio definitivo delle particelle virali finali l’intervento della membrana cellulare, contemporaneamente alla fuoriuscita del virione dalla cellula infetta (processo di gemmazione). In essi il danno cellulare è meno drammatico ed è in qualche caso compatibile con la sopravvivenza cellulare, mentre nei virus sprovvisti di peplos i materiali prodotti danneggiano profondamente il metabolismo della cellula e ne provocano la morte. La liberazione può avvenire mediante:
   • Esocitosi: liberazione dei virus senza mantello.
   • Lisi della cellula (indotta da proteine virali che alterano la membrana o il citoscheletro).
   • Gemmazione: la liberazione dei virus con mantello.

La durata del ciclo di replicazione virale è estremamente variabile nei diversi gruppi di virus e anche nell'ambito di una stessa famiglia di virus. In linea di massima, varia da 6-7 ore (Picornavirus) a 18-20 ore (herpes simplex) a due-tre giorni (Citomegalovirus). Nel ciclo di replica virale c’è una fase precoce (riconoscimento, penetrazione, rilascio del genoma) e una fase tardiva (replica, sintesi macromolecolari, assemblaggio, rilascio).

Colture cellulari in laboratorio

Tecnica di laboratorio che permette di far crescere e proliferare cellule, sia procariote sia eucariote, in ambiente artificiale controllato. Una coltura cellulare è un gruppo omogeneo di cellule eucariotiche, di origine tissutale, in grado di crescere e moltiplicarsi in vitro per numerose generazioni. È possibile coltivare in laboratorio sia cellule di origine animale che vegetale. Le colture cellulari vengono mantenute in terreno liquido all’interno di contenitori sterili (fiasche, bottiglie o capsule Petri) in particolari condizioni sperimentali che riproducono le condizioni chimico-fisiche dell’ambiente cellulare naturale.

I virus sono incapaci di moltiplicarsi in terreni artificiali, in quanto necessitano di cellule viventi per la loro replicazione. Si utilizzano, pertanto, animali da laboratorio, uova embrionate e colture cellulari in vitro. Per crescere i virus in laboratorio è necessario impiegare animali, uova embrionate o colture cellulari. I virus vengono coltivati in laboratorio per tre motivi principali: diagnosi dell’infezione, ricerca e sviluppo di vaccini.