Immunologia

Immunità innata ed infiammazione

Si definisce immunità innata, quella risposta immunitaria che è immediatamente disponibile, senza bisogno di una fase di adattamento allo specifico patogeno. Non è specifica per un particolare organismo, per cui risposte identiche possono proteggere contro organismi diversi. Le risposte immunitarie innate non possono espandersi in maniera esponenziale in seguito al contatto con un agente estraneo e possono essere sopraffatte ad esempio da una carica batterica elevata. Non sono dotate di memoria per cui non sono capaci di evocare una risposta più rapida e potente nei confronti di un antigene con cui vengono in contatto frequentemente, e questa è la principale differenza tra risposta innata e umorale.

La risposta immunitaria innata distingue il self dal non-self, come del resto è necessario che faccia anche quella adattativa. L'immunità innata provvede inoltre ad indurre la risposta adattativa se necessario. L'immunità innata consiste di:

• Barriere anatomiche
• Risposte cellulari:
• Fagocitosi
• Reazione infiammatoria
• NK (natural killer) e mast-cellule
• Fattori solubili (complemento)

Barriera anatomica

Le barriere anatomiche fanno parte del sistema immunitario innato. La cute e gli epiteli mucosali sono possibili vie di accesso per microorganismi. Attraverso le giunzioni cellulari, la barriera anatomica è di fatto una barriera meccanica. La maggioranza delle superfici epiteliali sono costantemente esposte a microrganismi. Alcuni di questi si moltiplicano su queste superfici (pelle, intestino); altri devono attraversare le barriere epiteliali per entrare all'interno dell'organismo dove si moltiplicano. Alcuni patogeni sono intracellulari obbligati, altri sono extracellulari.

Barriera meccanica

• Grazie al complesso giunzionale.
• Una interruzione nell'integrità dell'epitelio può permettere l'ingresso di microorganismi;
• Non è necessaria una lacerazione profonda: può essere sufficiente una microabrasione (si verifica, ad esempio, nella trasmissione di malattie sessualmente trasmissibile);
• Pericolose le punture di insetto (che fanno da vettore per altri microrganismi). Es:
• La causa della malattia di Lyme è un batterio spiraliforme, la Borrelia burgdorferi, che infesta le zecche, le quali possono trasmetterlo all'uomo e agli animali.
• La malaria è una malattia provocata da parassiti protozoi del genere Plasmodium. Anopheles. I vettori sono le zanzare del genere.
• Alcuni microorganismi hanno sviluppato sistemi che permettono loro di farsi strada attraverso gli epiteli per raggiungere i tessuti sottostanti (proteasi e altri enzimi).
• Il movimento di muco mediato da ciglia è una protezione meccanica;
• La presenza di ciglia e la loro attività nell'epitelio bronchiale è importante per l'espulsione di eventuali microorganismi tramite la tosse.

Barriera chimica

• Nei succhi gastrici, il pH acido fornisce una protezione per molti microrganismi.
• A livello del tratto urinario è presente l'urea: denaturante (come del resto lo è anche il pH acido).
• Gli epiteli mucosali sono rivestiti da muco. Costituisce una ulteriore barriera protettiva (nello stomaco, protegge l'epitelio anche dall'acido).
• Enzimi: nella saliva e nelle lacrime, il lisozima è un enzima importante che taglia il legame tra NAG e NAM del peptidoglicano (i Gram+ hanno il peptidoglicano esposto).
• La Fosfolipasi A₂ secreta, abbreviata in sPLA₂, idrolizza il fosfatidilglicerolo (principale fosfolipide delle membrane batteriche) 100 volte più rapidamente della fosfatidilcolina (tipicamente abbondante nelle membrane delle cellule di mammifero). SPLA₂ e lisozima sono prodotti dalle cellule delle ghiandole sottomucosali e da cellule epiteliali, oltre che da neutrofili e cellule di Paneth.
• Le defensine, che aggrediscono i batteri prima che entrino nel corpo.
• Si tratta di peptidi antimicrobici di 30-40 aa, ricchi in cisteina che contribuiscono alla difesa dell'ospite contro infezioni batteriche, fungine e virali. Sono prodotte da mammiferi, insetti e piante. Appartengono a due sottofamiglie, α e β.
• α-defensine: presenti nei neutrofili e nelle cellule di Paneth del piccolo intestino.
• Alla base dei villi intestinali si trovano le cripte, il cui pavimento è composto da cellule di Paneth.
• Le cellule di Paneth forniscono una difesa all'organismo contro i patogeni a livello del piccolo intestino. Funzionalmente sono simili ai neutrofili. Quando esposte a batteri o ad antigeni batterici, le cellule di Paneth secernono numerose molecole antimicrobiche nel lume delle cripte.
• Le cellule di Paneth secernono altre molecole coinvolte nella difesa antimicrobica tra cui i già citati lisozima e fosfolipasi A₂.
• β-defensine: prodotte da cellule epiteliali della pelle, del tratto respiratorio, genito-urinario e gastro-enterico.
• Hanno domini idrofobici alternati a domini carichi positivamente (ricchi in Lys e Arg). Questi domini possono inserirsi nelle membrane cellulari dove interagiscono fra loro formando pori che distruggono la membrana portando a morte la cellula. Le defensine legano principalmente le membrane batteriche rispetto a quelle dei vertebrati, in relazione al fatto che le prime sono particolarmente ricche in fosfolipidi carichi negativamente (es. fosfatidilglicerolo e cardiolipina).
• Gli aa delle defensine non sono molto conservati, lo sono le cisteine e qualche altro aa. Sia nelle α- che nelle β-defensine sono presenti cisteine in 6 posizioni conservate. Nelle α-defensine si forma un ponte disolfuro fra la C1 e la C6, nelle β-defensine tra C1 e C5.
• Per evitare che le defensine danneggino le cellule umane, esse sono sintetizzate come precursori inattivi che vengono poi tagliati per produrre il frammento biologicamente attivo.
• I batteri G- sono più sensibili alle defensine perché possiedono una membrana esterna.

Barriera microbiologica

La flora batterica intestinale garantisce una risposta immunitaria innata: la competizione di questi batteri residenti contro i patogeni è rilevante. I microrganismi che vivono nel corpo umano costituiscono il microbioma umano. Il corpo umano contiene circa 10¹⁴ microrganismi, che superano nel numero le cellule umane (10¹³) e costituiscono circa il 3% della massa del corpo. Il microscopico "zoo" che vive nell'uomo comprende migliaia di specie diverse. I batteri commensali inducono il differenziamento di linfociti T regolatori che inibiscono l'attività di linfociti T effettori che i commensali possono attivare.

Funzioni del microbioma:

• Competizione con batteri patogeni.
• Stimolazione del turnover epiteliale.
• Sintesi vitamine (vitamina K, vitamina B₁₂).
• Processamento nutrienti: degradazione composti proteici, produzione di fenoli, ammoniaca, acidi grassi, amminoacidi, etc.
• Modulazione della risposta immunitaria dell'ospite (es. riduzione risposta infiammatoria mucosale, contributo all'avvio della risposta immunitaria adattativa nei confronti di patogeni).
• La composizione del microbioma sembra avere un'influenza sul SNC. Alcune teorie suggeriscono una connessione tra autismo e microbioma. Una serie di evidenze, oltre agli eventi locali evidenziati negli altri punti, porta a pensare che la composizione del microbioma (principalmente intestinale) possa modulare comportamenti e aspetti del SNC.

Prima linea di difesa: macrofagi

Se un microorganismo supera queste barriere, trova una prima linea di difesa che è costituita dai macrofagi. Al di sotto degli epiteli, infatti, si trovano macrofagi. Sono cellule molto conservate: lo scopritore è Metchnikoff, il "padre della fagocitosi". Aveva osservato che quando inseriva una spina all'interno del corpo di un mollusco, questa veniva circondata da delle cellule. Queste cellule, oggi sappiamo, sono emociti (assimilabili ai macrofagi). Un emocita di ostrica e un macrofago di topo sono simili: la similarità fra fagociti di invertebrati e di mammiferi è sorprendente. Essi usano anche molti meccanismi battericidi identici come la produzione di radicali di ossigeno. I macrofagi non sono specifici, eliminano anche gli eritrociti senescenti dell'ospite, per fare un esempio. L'attività generale è specifica, ma non direzionata.

La fagocitosi è una serie di eventi che comincia con l'avvolgimento, da parte del macrofago, del microrganismo. Si verifica grazie al fatto che il macrofago protrude degli pseudopodi fino ad avvolgere il microrganismo chiudendolo in una vescicola isolata dall'ambiente esterno (il fagosoma). Questo evento non è causale, ed è importante perché all'interno di questa vescicola si andranno a riversare tutta una serie di enzimi e molecole attive che hanno lo scopo preciso di eliminare il patogeno. Queste sostanze, come i radicali dell'ossigeno, sono pericolose anche per i tessuti dell'ospite: l'invescicolamento garantisce protezione all'ospite. Se per qualche motivo il materiale che il macrofago tenta di internalizzare è troppo grande, il risultato è che il corredo microbicida del macrofago si riversa all'esterno e danneggia l'ospite. Enzima chiave è la NADPH-ossidasi, un enzima della membrana dei fagociti che lega il suo substrato (NADPH) dalla parte citoplasmatica della membrana rilasciando i prodotti verso l’esterno della cellula e nel fagosoma (il fagosoma è rivestito dalla membrana cellulare internalizzata). Il fagosoma si fonde al lisosoma, formando una nuova vescicola, il fagolisosoma.

I meccanismi battericidi sono ascrivibili a due categorie: quelli ossigeno-dipendenti e quelli ossigeno-indipendenti (che hanno a che fare con il corredo enzimatico lisosomiale). Avviene un riconoscimento del patogeno: il macrofago è infatti dotato di una serie di recettori. Ci sono:

• Mannose receptor: questi recettori legano carboidrati microbici contenenti il mannosio, frequenti nei batteri.
• Scavenger receptor: lega ligandi carichi negativamente, come ad esempio l'acido lipoteicoico dei Gram+.
• Fc receptor: recettore per la porzione Fc degli anticorpi (porzione che non lega l'antigene del patogeno). Questo non lega direttamente il microrganismo, ma lo fa con il tramite di una molecola anticorpale. Gli anticorpi si comportano da opsonine: molecole che rivestono un antigene e ne favoriscono la fagocitosi. In linea generale, le opsonine lo fanno in virtù del fatto che sui macrofagi ci sono recettori (es. C3b, IgG)
• CR1: è un recettore che riconosce la molecola del complemento C3b. Questa viene prodotta in una cascata enzimatica che prende il nome di cascata di attivazione del complemento. Il complemento definisce un insieme di proteine legate tra loro attraverso reazioni enzimatiche a cascata. La molecola C3b si inserisce sia nelle membrane esterne dei Gram-, che nelle pareti dei Gram+. Anche questa molecola funziona da opsonina perché può legarsi al patogeno, e per essa esistono recettori sulla superficie del macrofago.
• Mac-1 integrin: riconosce la molecola del complemento iC3b.

Il riconoscimento del patogeno, diretto o indiretto (tramite opsonina) porta ad una trasduzione del segnale che si traduce nell'attivazione del macrofago, che spinge il macrofago a fagocizzare il patogeno.

Meccanismi ossigeno-dipendenti

Il macrofago attivato procede alla formazione della vescicola. Sulla membrana plasmatica che diventerà quella del fagosoma si va ad assemblare il NADPH-ossidasi, un complesso multienzimatico i cui componenti, prima della trasduzione del segnale, non sono composti a costituire l'enzima attivo. Il NADPH si produce attraverso la prima tappa dello shunt esoso monosfato (G6P → 6Pgluconato); nel fagocita a riposo il 99% del glucosio va lungo la glicolisi a piruvato, mentre solo l’1% entra nello shunt esoso monofosfato. Quando il fagocita è attivato il 10% del glucosio entra nello shunt con conseguente aumento della concentrazione citoplasmatica di NADPH.

L'enzima NADPH-ossidasi catalizza la reazione: O₂ + NADPH → O₂^- + NADP⁺ + H⁺.

Un altro enzima, superossido-dismutasi, interviene in una reazione che converte l'anione superossido appena prodotto in acqua ossigenata: 2O₂^- + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂.

H₂O₂ e O₂^- non sono molto efficienti nell’uccidere i batteri, tuttavia:

• O₂^- + H₂O₂ → OH^• + OH^- + O₂ (reazione di Haber Weiss catalizzata da metalli, Fe e Cu). Il radicale ossidrile è molto reattivo.
• H⁺ + Cl^- + H₂O₂ → HOCl + H₂O (reazione catalizzata dalla mieloperossidasi, enzima contenuto nei lisosomi dei fagociti e quindi rilasciato nei fagolisosomi). Il radicale ossidrile e l'ipoclorito (o in generale gli alogeni ossidati) sono antisettici molto efficaci. La mieloperossidasi non è abbondante solo nei macrofagi, ma anche nei neutrofili. Quando il muco è verde: se il patogeno è un batterio, in genere vengono reclutati molti neutrofili; il muco verde è dovuto al fatto che la mieloperossidasi è un enzima che possiede un gruppo eme verde.

Burst respiratorio

Definisce quelli che sono gli eventi ossigeno-dipendenti nel macrofago attivato:

• Aumento del consumo di ossigeno
• Aumento del catabolismo del glucosio attraverso lo shunt esoso monofosfato
• Rilascio di H₂O₂
• Rilascio di O₂^-

Le specie reattive dell'ossigeno possono danneggiare tutti i tipi di macromolecole: carboidrati, acidi nucleici, lipidi (perossidazione dei lipidi) e amminoacidi (conversione della fenilalanina in meta-tirosina o orto-tirosina). L'NO-sintasi è un enzima che a partire da Arginina e ossigeno produce ossido nitrico. Quest'ultimo è un radicale reattivo, ma può ulteriormente interagire con l'anione superossido formando una specie molto reattiva che è il perossinitrito.

Meccanismi antibatterici ossigeno-indipendenti

Si realizzano grazie ad uno speciale corredo di molecole contenute nei lisosomi che si fondono con il fagosoma dando luogo al fagolisosoma. Le componenti sono:

• Lisozima: scinde il legame fra l’acido N-acetilmuramico e la N-acetilglucosammina presenti in lunghe catene nella parete di molti batteri.
• Bacterial Permeability Increasing Protein (BPIP): permeabilizza la membrana esterna dei batteri Gram-. La porzione N-ter cationica della proteina ha elevata affinità per le membrane di questi batteri che contengono la specie anionica LPS. Inserendosi nella membrana dei Gram- ne aumenta la permeabilità provocando la morte del batterio.
• Defensine: piccole proteine ad azione citotossica.
• Lattoferrina: sottrae il ferro, importante fattore di crescita per molti batteri, ma svolge anche altre funzioni anti-microbiche con un meccanismo che non coinvolge il ferro. L'azione più che battericida è batteriostatica.
• Componenti caratteristiche dei lisosomi, come proteasi, fosfolipasi. Il pH del fagolisosoma è acido (presenza della V-ATPasi, una pompa protonica) e questo ha un effetto denaturante e quindi microbicida.

Meccanismi antimicrobicidi di alcuni batteri

La co-evoluzione ospite/patogeno è molto importante.

• Alcuni batteri producono un enzima chiamato arginasi, che agisce sull'Arginina, che è il substrato della NO-sintasi. L'arginasi ha l'effetto di sottrarre all'NO-sintasi il suo substrato, compromettendo la capacità del macrofago di sintetizzare NO.
• Un altro tipo di enzima che molti batteri producono è la catalasi, che converte l'acqua ossigenata in acqua.
• Alcuni sistemi bloccano l'assemblaggio della NADPH-ossidasi (blocco a monte).

Infiammazione: seconda battuta

L'infiammazione è caratterizzata da dolor (dolore), calor (calore), rubor (rossore), tumor (gonfiore). È necessario un meccanismo atto ad aumentare il numero di cellule ad attività fagocitica dove e quando è necessario. Infatti, i macrofagi presenti al di sotto degli epiteli non sono in numero sufficiente per fronteggiare un attacco. Il reclutamento di cellule è parte integrante del processo chiamato infiammazione. L'immunità innata è un processo già pronto per quanto visto finora. L'infiammazione esula da questo concetto pur facendo parte dell'immunità innata: non è un evento che esiste sempre, ma un processo facilmente inducibile. È necessaria dunque l'esistenza di segnali che avviino l'infiammazione, e la fonte principali di questi segnali sarà logicamente data dai macrofagi.

L'infiammazione è una risposta dinamica di un tessuto vascolarizzato ad una lesione. L'infiammazione non necessariamente ha base microbica (ad esempio in seguito ad un'ustione: ma in questo caso il processo è diverso, e la componente cellulare richiamata è minima, mentre c'è un accumulo di liquido). Non è una malattia: è un processo che ha un ruolo importante che prelude la risposta adattativa. L'infiammazione deve risolversi: i macrofagi producono radicali dell'ossigeno che attraversano le membrane, e quindi vengono anche rilasciati fuori; inoltre, i macrofagi ad un certo punto muoiono e il loro corredo lisosomiale viene rilasciato fuori. Se continuano ad essere reclutate cellule, continuano ad esserci cellule potenzialmente pericolose per il tessuto, e che alla lunga lo sono. L'evento di infiammazione acuta è positivo, ma deve risolversi e non evolvere in infiammazione cronica che comporta un danno tissutale notevole (più problematica in un tessuto che non rigenera destinato ad una sostituzione collagenica, ma anche in un tessuto rigenerante se l'infiammazione cronica non si risolve.