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Immunologia

Questi appunti trattano di immunità innata e acquisita, selezione clonale, malattie autoimmuni, organi linfoidi con immagini e mi hanno permesso di passare l'esame con il punteggio di 29/30 e sono basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. De Bernard dell’università degli Studi di Padova - Unipd. Scarica il file in formato PDF!
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Esame di Immunologia docente Prof. M. De Bernard

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Molti batteri hanno evoluto sistemi per sfuggire al riconoscimento dell'immunità innata che è

funzionale allo sviluppo dell'immunità adattativa.

Alcuni batteri hanno ridotto il grado di acilazione del lipide A dell'LPS (impossibilità di

• legame con TLR4).

Altri, hanno sviluppato la capacità di interferire con la cascata di segnale evocata dal

• recettore per culminare poi nell'attivazione della trascrizione di geni. Molti di questi sono

batteri extracellulari ma che hanno sviluppato un sistema di iniezione: assemblano sulla

loro superficie delle “siringhe molecolari” cave all'interno con cui iniettano molecole

effettrici batteriche nel citoplasma cellulare. Molti di questi batteri, hanno evoluto molecole

che permettono di interferire con il signalling (iniettano nella cellula proteine che mimano o

degradano membri della cascata di segnale avviata dai TLR).

Ci sono batteri che hanno evoluto sistemi per non essere fagocitati, mentre altri hanno

• evoluto sistemi per sfuggire dal fagosoma.

I TLR o si trovano già legati sui fagosomi (TLR3, TLR7/8, TLR9) o vi possono arrivare con la fagocitosi

microbica (TLR2 e TLR4).

I TLRs non solo legano i PAMPs, ma anche molecole endogene dell'ospite. Devono esistere dei

sistemi di regolazione che evitino che la risposta immunitaria si monti contro l'ospite stesso.

Queste molecole che possono ingaggiare un TLR sono state chiamate DAMPs (la D sta per

damage).

Alcuni TLRs sono coinvolti nel percepire anche segnali generati durane un danno cellulare

• (segnali endogeni o allarmine o DAMPs).

Le due principali fonti di ligandi endogeni per i TLRs sono i componenti della matrice

• extracellulare e proteine o altri componenti intracellulari.

Infiammazione e danno tissutale causano la degradazione e accumulo di numerosi

• componenti di matrice. Frammenti a basso peso molecolare dell'acido ialuronico, del

biglicano, del versicano (un proteoglicano prodotto da alcuni tumori) possono legare il TLR2

e/o il TLR4. Frammenti di eparan-solfato, un polisaccaride acido che si trova nelle

membrane cellulari e nella matrice, attiva le DCs attraverso il TLR4. high-

Inoltre, numerose proteine intracellulari si ritiene attivino i TLRs: tra queste c'è la

• mobility group box 1 (HMGB1) protein, un componente della cromatina che normalmente

risiede nel nucleo ma si pensa possa essere liberata all'esterno da cellule danneggiate o

necrotiche.

Recentemente è stato riportato che anche il DNA mitocondriale (rilasciato da cellule

• necrotiche) può comportarsi da segnale endogeno e legare ed attivare un TLR.

Lo stesso TLR che lega un DAMP e un PAMP dà risposte di tipo diverso (se così non fosse avremmo

frequenti malattie autoimmuni). Com'è possibile? Non è chiaro. È stato suggerito che un DAMP può

legare un TLR, ma può legare anche un altro recettore concomitantemente: in questo modello ci si

aspetta che il legame con l'altro recettore avvii un segnale intracellulare che interferisce con il

primo evocato dal TLR. L'interferenza della cascata scaturita dal legame del DAMP con il secondo

recettore dovrebbe essere parziale: viene comunque attivato NFkB e comunque c'è la trascrizione

di citochine infiammatorie (1, 6, TNF-α) in modo che ci sia infiammazione, senza che si avvii una

risposta immunitaria adattativa.

Riassumiamo: la risposta innata non specifica è richiesta per indurre una risposta adattativa.

Protezione innata: L'infiammazione causata da prodotti batterici, o da un danno tissutale, è il

risultato del rilascio di citochine da parte dei macrofagi impegnati nella fagocitosi, ma anche da

altre cellule (mastociti, neutrofili...) che, attraverso opportuni recettori (TLRs e NLRs), rivelano la

presenza di PAMPs. Le citochine e componenti del complemento (C3a C5a) inducono un aumento

della permeabilità (con conseguente accumulo di fluidi e proteine nell'interstizio) e, insieme alle

chemochine, attraggono altre cellule (polimorfonucleati, monociti e linfociti). Il fluido che si

accumula contiene le molecole del complemento ed altri prodotti antimicrobici. Questa parte

dell'infiammazione è direttamente protettiva.

Avviene l'attivazione da parte della risposta innata, dell'immunità adattativa: i prodotti batterici che

inducono l'infiammazione possono attivare anche le cellule presentanti l'antigene professioniste

(le cellule dendritiche). Queste sono indotte:

1. Ad aumentare l'espressione delle molecole MHC e delle molecole co-stimolatorie (B7);

2. A migrare verso gli organi linfoidi;

3. A presentare gli antigeni alle cellule T.

Presentazione dell'antigene ai linfociti T helper

Le cellule dendritiche presentano gli antigeni esogeni ai

linfociti T helper. Le molecole coinvolte nella

presentazione di un antigene esogeno ai linfociti T sono:

Le molecole MHC sulla cellula che presentano (APC).

• Le molecole TCR sul linfocita T, che legano non solo

• l'antigene, ma l'antigene nel contesto in cui si trova

(nella molecola MHC-II).

Oltre a questo segnale, è necessario quello dato dalle

molecole co-stimolatorie che interagiscono con molecole

presenti sulla membrana dei linfociti T. Sono necessari i

segnali sia (1) che (2).

Le molecole MHC si formano nel RE, e da qui partono

vescicole che si fondono prima al Golgi e poi alle vescicole

contenenti materiale digerito.

Nel fagolisosoma si genereranno frammenti di diverso materiale, ma sulla molecola di MHC si

possono trovare solo peptidi, mai zuccheri, acidi nucleici o lipidi.

La cellula dendritica fagocita il microrganismo.

• Questo viene distrutto nel fagolisosoma.

• Nel reticolo avviene la traduzione della molecola MHC.

Gli antigeni che sono destinati ad essere presentati attraverso le molecole MHC di classe II

vengono infatti presi dall'esterno attraverso l'endocitosi o la fagocitosi, degradati in peptidi

all'interno di vescicole a pH acido. Tali vescicole si fondono con quelle provenienti dal RE-Golgi (le

vescicole che fuoriescono dal Golgi sono dette compartimenti MIIC) che contengono le molecole

MHC-II.

La molecola MHC-II è fatta a posta per ospitare materiale di tipo proteico: nel momento in cui si

vengono a formare nel reticolo endoplasmatico sarebbe possibile che proteine endogene non

complete o mal conformate si vadano a legare alle MHC-II. Questo però bisogna prevenirlo.

Per evitare che proteine o peptidi self si leghino alla MHC-II, la sintesi di quest'ultima si

accompagna alla sintesi di un'altra proteina, una chaperonina: invariant chain (Ii). Questa, ha la

funzione di coprire la tasca della molecola MHC, in modo da evitare che all'interno della tasca di

MHC si vada ad inserire qualcosa di diverso da quello che sarà l'epitopo.

Dal Golgi si stacca la vescicola contenente la MIIC. In questa vescicola acida, la catena inattivante

(Class II-associated Invariant-chain

viene proteolizzata, lasciando però un piccolo peptide CLIP

Peptide) nell'insenatura.

In cellule dendritiche mutanti prive di HLA-DM le molecole di MHC di classe II rimangono occupate

dai frammenti CLIP sulla superficie cellulare. Dunque, la liberazione dell'insenatura (per

permettere il legame del peptide antigenico) avviene solo se HLA-DM, una chaperonina, è presente

e funzionante nella vescicola. Il legame tra HLA-DM e MHC-II determina un cambio di

conformazione nella molecola MHC-II che permette il distacco del peptide CLIP. Avviene il legame

con il peptide antigenico in assenza di CLIP dal sito di legame, e l'MHC-II viene esposto sulla

membrana plasmatica.

Assemblaggio delle molecole MHC-II

L'eterodimero αβ neosintetizato viene associato nel RE con una catena non polimorfica (è

conservata), l'invariant chain (Ii). Essa ha la funzione di chaperone per l'MHC-II e tiene occupata

l'insenatura che legherà il peptide. Dal reticolo endoplasmatico, attraverso il Golgi, le molecole

MHC vengono rilasciate all'interno di vescicole (MIIC) acide in cui avviene la degradazione

proteolitica di Ii che lascia un corto peptide (CLIP) nell'insenatura. La proteina Ii assicura che

avvenga il trasferimento delle molecole MHC nelle vescicole MIIC. In seguito alla fusione delle MIIC

con i fagolisosomi, il peptide CLIP viene dissociato (grazie al contributo della molecola HLA-DM) e i

peptidi antigenici esogeni interagiscono con la tasca di legame dell'MHC. A questo punto il

complesso MhC-II+peptide viene trasportato alla superficie cellulare.

Una volta che antigeni proteici sono internalizzati da una cellula dendritica, essi vengono

processati in piccoli peptidi ed esposti sulla superficie cellulare.

La presentazione di tali peptidi ai linfociti T helper richiede che essi siano legati a molecole del

complesso maggiore di istocompatibilità di tipo II. Si parla di riconoscimento MHC-ristretto.

Il sistema dell'MHC è alla base del rigetto nel trapianto. Se le cellule del tessuto trapiantato non

hanno i medesimi antigeni MHC del ricevente (ovvero il tessuto non è MHC-compatibile), il tessuto

viene riconosciuto come estraneo, offensivo e viene rigettato. Per questa ragione, per mezzo di un

procedimento detto di tipizzazione tissutale, prima delle operazioni ci si accerta che i due soggetti

(donatore e ricevente) siano MHC-compatibili. MHC = complesso maggiore di istocompatibilità.

È stato dimostrato che c'è una relazione tra MHC e fitness. Se un pesce si accoppia con un

individuo singenico, e poi con un pesce geneticamente diverso, la copula sarà proficua solo

quando lo spermatozoo che feconda è dissimile per quanto riguarda gli MHC. Da un punto di vista

evolutivo viene avvantaggiato il mantenimento di polimorfismi di MHC nella popolazione. Il

vantaggio in una popolazione, è che aumenteranno le chance di questa popolazione di presentare

antigeni. In una popolazione con MHC non polimorfico, un antigene non riconosciuto potrebbe

portare all'estinzione.

Nell'uomo, sono state fatte indossare ad universitari per diversi giorni delle magliette. I soggetti

sono stati tipizzati per MHC. Le magliette sono state fatte togliere dai ragazzi e fatte annusare da

delle ragazze. L'odore delle magliette appartenenti ai ragazzi con MHC più dissimile è stato

selezionato come preferito.

Struttura MHC-II

Costituita da due catene polipeptidiche associate non covalentemenente, la catena α (34 kDa) e la

catena β (29 kDa). Sono distinguibili domini α1, α2, β1, β2. La tasca in cui si inserisce la catena è

costituita dai domini α1 e β1: il polimorfismo in una popolazione riguarda soprattutto questi due

domini. I domini più prossimi alla membrana plasmatica sono α2 e β2, domini immunoglobulinici

(con questo termine si intende una struttura che si trova anche nelle immunoglobuline. Più in

generale, un dominio immunoglobulinico intende una porzione di circa 100-110 aa ripiegati nello

spazio assumendo una conformazione simile ad altri domini immunoglobulinici appartenenti a

molecole diverse). Per punti:

La regione che lega il peptide è formata dall'interazione tra i segmenti α1 e β1.

• Ambedue le catene sono glicosilate e stabilizzate da legami disolfuro intra-catena.

• La regione β2 è quella cui si lega la molecola CD4 dei linfociti per stabilizzare il contatto tra

• cellula dendritica e linfociti stessi (sinapsi immunologica).

Entrambi i domini più vicini alla membrana delle due catene sono omologhi ai domini

• immunoglobulinici (conformazione simile, sequenza amminoacidica non necessariamente).

Due catene polipeptidiche di lunghezza simile, α e β, di lunghezza simile. Quattro regioni:

1. Una regione di legame al peptide: una tasca formata dai domini a α1 e β1. Questa regione è

sede del polimorfismo.

2. Una regione di tipo immunoglobulinico conservata, α2 e β2; β2 è il sito cui si lega la

molecola CD4 presente sulle cellule T.

3. Una regione transmembrana (dominio ricco in amminoacidi idrofobici che attraversa la

membrana).

4. Una regione citoplasmatica (dominio contenente siti di fosforilazione e di binding ad

elementi citoscheletrici).

La regione che lega il peptide è formata dall'interazione fra i segmenti α1 e β1. I due segmenti

costituiscono un'insenatura che ha un “pavimento” di 8 lamine β e due pareti di α-eliche. Il

polimorfismo maggiore riguarda

i residui aa che circondano

l'insenatura.

Peptidi isolati da molecole

MHC di classe II

La composizione amminoacidica di peptidi riconosciuti da una stessa molecola MHC sono molto

diverse, a parte di alcuni amminoacidi che sono residui ancora. Un amminoacido carico

negativamente ed uno idrofobico, nell'esempio, separate da 4 residui, costituiscono un motivo di

legame per quella specifica MHC-II. Ogni individuo possiede al massimo 6 diverse molecole MHC,

garantendo una certa flessibilità nel legame di antigeni.

1. In genere i peptidi che si legano sono di 9 aa, ma possono essere lunghi fino a 13 (i residui

extra-numerari sporgono perché non si inseriscono nella tasca).

2. Sono individuabili residui conservati nel centro della sequenza; talvolta anche al fondo (C-

ter).

Dal momento che:

1. Ci sono centinaia di differenti proteine MHC di classe II in una specie (6 in ogni individuo!)

e…

2. Ciascuna molecola MHC può legare un'ampia gamma di peptidi diversi…

All'interno di una specie l'insieme delle varianti alleliche delle molecole MHC permette di legare un

numero elevato di peptidi diversi.

Presentazione dell'antigene esogeno

La presentazione avviene nei confronti di un linfocita T helper, che riconosce il complesso peptide-

(T-Cell Receptor).

MHC II attraverso un recettore specifico, il TCR

L'incontro tra i due tipi cellulari avviene in un organo linfoide secondario, come un linonodo. È

infatti in questi organi che per lo più avviene l'incontro con i linfociti naïve maturi, ma non ancora

“armati”. NOTA: i linfociti T naïve sono già maturi! È sbagliato il concetto che

maturino quando diventano effettori.

Cellule T circolano attraverso gli organi linfoidi ed incontrano centinaia di cellule

• dendritiche al giorno.

NOTA: La migrazione dei linfociti dalla circolazione sanguigna agli organi linfoidi

secondari è permessa dalle HEV (High Endothelial Venules), specializzazionidi venule

post-capillari caratterizzate da essere rivestite da cellule rigonfie del tipo cubico

semplice in contrapposizione al normale endotelio delle venule.

Se non legano l'antigene, si allontanano attraverso il vaso linfatico efferente.

• Se legano l'antigene, i linfociti T si attivano.

Quando una cellula dendritica entra in contatto con un linfocita T che non lega il complesso MHC-

II+peptide non c'è nessun contatto particolare. Invece, quando il linfocita T ha un TCR specifico per

il complesso MHC-II+peptide si instaura un contatto molto stretto, detto sinapsi immunologica. La

sinapsi immunologica è stabilizzata da CD4.

Il TCR lega peptidi che derivano da proteine processate. Può legare peptidi che derivano

• dalla superficie di una proteina o dal suo interno.

In considerazione del fatto che una proteina viene presentata ai linfociti T solo dopo essere

• stata processata in peptidi, è ovvio che il TCR veda e leghi solo epitopi lineari o sequenziali

(cioè epitopi costituiti da aa che sono vicini nella sequenza primaria). Gli epitopi che

derivano dalla digestione sono piccoli, sequenze di pochi amminoacidi non assumono

conformazioni particolari nello spazio.

Gli anticorpi, come vedremo, sono capaci di riconoscere epitopi sequenziali, ma anche epitopi

conformazionali (gli amminoacidi sono vicini, ma in posizioni di sequenza primaria diverse).

Parliamo di epitopi T le porzioni di antigeni riconosciuti dai linfociti T attraverso il TCR, presentati

attraverso molecole MHC-II. Sono solo di natura proteica e sono sempre epitopi sequenziali.

Il TCR Eterodimero costituito da una catena α e da una β di lunghezza simile, glicosilate e unite da

• un ponte disolfuro.

La porzione che riconosce il complesso peptide-MHC-II è quella più distale dalla membrana,

• ed è indicata come regione V (variable).

Il repertorio di TCR di un individuo dev'essere vasto (6 MHC + tutti i possibili epitopi T

◦ combinati).

La specificità è a monte, prescinde dall'incontro del complesso peptide-MHC-II.

◦ Ogni linfocita T possiede molecole uguali di

◦ TCR, ma diverse da quelle di un altro.

È presente un regione C (costante).

• Entrambe le catene constano di una regione V e

• una C.

La regione V della catena α comprende un

• segmento joining (J).

La regione V della catena β comprende un

• segmento J e uno D (da diversity).

È possibile individuare i domini immunoglobulinici:

• sono 4 nel TCR.

La variabilità viene acquisita nel timo con la

ricombinazione somatica (un processo che riguarda il DNA

e ricorda lo splicing) che tratteremo in seguito.

La ricombinazione avviene preferenzialmente in siti

acetilati o metilati (l'epigenetica ha un ruolo in questo

processo di ricombinazione).

Esistono due classi di linfociti T distinguibili in base alle proteine di superficie CD4 e CD8 (molecole

di superficie usate per identificare cellule chiamate markers, marcatori).

CD4 lega una porzione conservata della molecola MHC-II (regione β2). CD4 (e

CD8, come vedremo parlando di MHC-I) sono considerati co-recettori.

+

Linfociti CD4 sono gli helper, sono le cellule che legano l'antigene

• presentato in MHC-II

+

Linfociti CD8 sono citotossici

Complesso del TCR

Il TCR è sempre associato con un complesso chiamato CD3 costituito da

3 peptidi non variabili, γ, δ e ε.

È un eterotetramero γε-δε:

δ e ε sono vicini alla catena α.

• γ e ε sono vicini alla catena β.

Inoltre è presente un'altra proteina non variabile, ζ (zeta):

È l'effettore iniziale della via di signalling.

• È presente come omodimero di due catene ζ.

• NOTA: sulle diapositive c'è scritto che sono 4 i

peptidi che formano il complesso CD3 (includendo

ζ), ma la professoressa rispondendo ad una

domanda ha confermato le informazioni scritte

sopra, che tra l'altro sono quelle reperibili in rete.

Queste molecole sono coinvolte nel signalling all'interno della cellula T quando questa lega

l'antigene + MHC.

TCR + CD3 prende il nome di complesso del TCR.

Il signalling coinvolge una cascata di fosforilazione. Sono importanti i domini ITAMs

(Immunoreceptor Tyrosine Activation Motif) citoplasmatici del complesso CD3: vengono fosforilati

quando il ligando si lega al TCR.

1. Il segnale che la cellula T riceve quando il suo TCR riconosce il complesso MHC-II+peptide è

necessario, ma non sufficiente (segnale 1). È un segnale antigene-specifico.

2. È necessario un altro segnale per attivare il linfocita T helper: il segnale 2 è dato dalla

proteina co-stimolatoria B7 (esiste in due forme alleliche, B7.1 per CD80 e B7.2 per CD86) la

cui espressione aumenta quando la dendritica matura, lega la proteina CD28 (recettore

della molecola co-stimolatoria) sulla cellula T.

Precisiamo che:

Il segnale 2 da solo non ha effetto sulle cellule T.

• Il segnale 1 da solo inattiva la cellula T, che va in anergia.

Proliferazione clonale dei linfociti T

TCR e CD28 sulla cellula T legano rispettivamente MHC+peptide e B7 sulla cellula dendritica.

• La ricezione da parte della cellula T dei segnali (1) e (2) si traduce nell'espressione da parte

• della cellula T di CD40L (ligando di CD40), nella secrezione di IL-2 e…

...nell'espressione del recettore per la IL-2 ad alta affinità.

• Normalmente, linfociti T resting (naïve o in generale non attivi) esprimono recettori per

◦ la IL-2 a bassa affinità (costituiti da due catene, β e γ). La stimolazione del TCR

comporta, oltre al rilascio di IL-2, anche l’espressione della catena α del recettore per

IL-2, la quale legandosi alle altre due catene dà un recettore ad alta affinità.

IL-2 stimola fortemente la proliferazione: il linfocita T stimola la sua stessa

◦ proliferazione in modo autocrino.

Il legame CD40L a CD40 induce la dendritica ad aumentare ulteriormente l'espressione di

• B7 (nella dendritica) allo scopo di interagire meglio e con un numero maggiore di linfociti T.

Quasi tutto quello che avviene dopo la sinapsi immunologica avviene nell'ambito della

cellula T: tranne questa induzione nelle dendritiche dell'aumento della produzione di

molecole co-stimolatorie.

Perché esprime ancora più B7? La stessa dendritica può esporre epitopi diversi in diverse

molecole MHC-II: è utile che continui a tentare di presentare.

Le cellule T attivate da questo circuito auto-propagante si dividono attivamente nell'arco di alcuni

giorni. 12

I linfociti T si dividono 2-3 volte al giorno per 4-5 giorni (2 =4096).

Effetto dei PAMPs:

La cellula dendritica è capace di guidare il differenziamento del T (determina il profilo

• funzionale del linfocita T effettore) che dipende dal tipo di citochine che la cellula dendritica

ha rilasciato.

Il tipo di citochine rilasciate dalle cellule dendritiche dipende a sua volta dai PAMPs con cui

• la dendritica è entrata in contatto nel sito di infezione.

Presentazione antigene endogeno

Antigene esogeno: materiale estraneo assunto dall'ambiente (es. proteine batteriche).

• Antigene endogeno: un antigene citoplasmatico (es. proteine virali sintetizzate da una

• cellula infetta o antigeni tumorali prodotti da una cellula cancerosa. È chiaro che i virus

siano esogeni, ma le proteine vengono prodotte all'interno della cellula).

Ci sono diversi tipi di antigeni tumorali che possono includere antigeni che tornano ad

◦ essere espressi dopo che, terminata la fase embrionale, cessano di esserlo.

Oppure, proteine mutate come la p53 (prodotto proteico di un gene tumor suppressor).

◦ Antigeni tumore-specifici (presentati solo in MHC-I dai tumori, non dalle normali cellule

◦ somatiche).

Antigeni associati al tumore (presentati in MHC-I sia dal tumore che da cellule normali).

◦ Antigeni presenti sulla membrana delle cellule tumorali.

Gli antigeni endogeni per attivare i linfociti T CD8 (citotossici) richiedono di essere loro presentati.

+

Differentemente dagli antigeni esogeni che coinvolgono le molecole MHC di classe II, le molecole

coinvolte sono le MHC di classe I.

Quasi ogni tipo di cellula possiede molecole MHC-I: tutte le cellule possono andare incontro ad

infezione virale o trasformazione. Le uniche cellule che non esprimono MHC-I (ed anche MHC-II)

sono i globuli rossi: per questo le trasfusioni non causano rigetto per questo motivo (è però

necessario che il sangue sia di un gruppo compatibile).

Struttura della molecola MHC-I α β β

Due catene polipeptidiche, una catena lunga ed una catena corta, chiamata

• 2

α

microglobulina (codificata su un cromosoma diverso dalla catena )

Quattro regioni:

• α α α

1. Una regione di legame al peptide: una tasca formata dai domini ed della catena .

1 2

Questi sono i domini più variabili. α

2. Regione tipo immunoglobulinico, il dominio (molto conservato) più prossimo alla

3

membrana citoplasmatica; a questo dominio si lega la molecola CD8 dei linfociti T

quando si forma la sinapsi immunologica.

3. Una regione transmembrana (dominio ricco in aminoacidi idrofobici che attraversa la

membrana).

4. Una regione citoplasmatica (dominio contenente siti di fosforilazione e di binding ad

elementi citoscheletrici).

In maniera simile a quanto visto per la molecola MHC-II, anche in questo caso la sede di

β

posizionamento del peptide è rappresentata da foglietti e le pareti della tasca dove il peptide si

α

viene a collocare sono delimitati da -eliche.

Antigeni endogeni associati alla molecola MHC-I

Vari peptidi isolati da due differenti proteine MHC di classe I; i peptidi isolati da molecole MHC

identiche hanno motivi simili. Sono conservati solo dei residui ancora.

Caratteristiche dei peptidi che si inseriscono nella tasca delle molecole MHC-I:

1. In genere sono 8-10 gli aa che si inseriscono nella tasca.

2. Sono individuabili residui conservati nel centro della sequenza e al fondo (C-terminale).

Sono proteine presenti nel citosol e degradate via proteasoma a dare peptidi che verranno poi

esposti nel contesto MHC-I.

Nel citosol, le proteine sono degradate in piccoli peptidi da parte del proteasoma. Il

• proteasoma è un complesso proteasico multicatalitico di 28 subunità. Le proteine che

devono essere eliminate sono poliubiquitinate.

In questo modo, vengono presentati anche frammenti proteici di proteine self, ma per

• tolleranza immunitaria, non danno normalmente risposta immunitaria adattativa.

Come i peptidi rilasciati nel citosol si associano ad una molecola di MHC-I?

Peptidi (derivati da proteine degradate dal proteasoma) sono pompati dal citosol nel reticolo

(transporters associated with antigen

endoplasmatico (ER) da trasportatori chiamati TAP

processing). β

In una fase iniziale la MHC-I non è completamente foldata e non associata alla catena . È invece

2 β

associata ad una prima chaperonina: la calnessina. Una volta che avviene il legame con la -

2

microglobulina, la calnessina si stacca per via di un cambio di conformazione della MHC-I. Il

complesso MHC-I+β -microglobulina si associa ad altre chaperonine (calreticulina, Erp57,

2 β

tapasina). La tapasina media il legame tra il complesso MHC-I+ 2-microglobulina e TAP.

Nel proteasoma vengono degradati peptidi a dare piccoli frammenti. I peptidi vengono pompati

nel reticolo endoplasmatico, trasportati da TAP, e si inseriscono in una tasca della molecola MHC-I

che può accoglierli. MHC-I foldata + peptide lascia il RE tramite una vescicola. La vescicola passa

per il Golgi e poi arriva nella membrana plasmatica.

(endoplasmic reticulum aminopeptidase associated

Esiste nel RE un enzima che si chiama ERAAP

with antigen processing) che ha la funzione di spuntare i terminali amminici di peptidi troppo

lunghi, in modo da far loro raggiungere una dimensione adatta per inserirsi nelle tasche.

Presentazione antigene endogeno e cross-priming

Il TCR dei linfociti T citotossici (o CTL) più la molecola CD8 interagiscono con MHC-I+peptide.

Ma come fanno le cellule, ad esempio epiteliali, ad entrare in contatto con i linfociti nel linfonodo?

Dovrebbero essere infettate anche cellule dendritiche Ma se ci sono virus che non infettano

cellule dendritiche o altre APC, come fa una cellula somatica che non va agli organi linfoidi

secondari ad attivare il linfocita T citotossico?

Serve la presentazione antigenica.

• Le cellule somatiche non si muovono.

• Una cellula somatica non è detto che esprima molecole co-stimolatorie (in alcune infezioni

• virali però questo avviene: valutiamo il caso più generico quando le molecole co-

stimolatorie non sono espresse).

Si è arrivati a rispondere a questi dubbi quando si è scoperto che i T citotossici si attivano da naïve

ad effettori tramite interazioni con le cellule dendritiche.

Una cellula dendritica può fagocitare cellule morte per infezione virale o cellule trasformate:

questo processo si chiama il cross-priming (o cross-presentation). È la capacità delle APC

(specialmente DC) di fagocitare cellule morte per infezione virale o trasformate, processare gli

antigeni e presentare in MHC-I ai CD8 .

+

Le cellule dendritiche hanno caratteristiche peculiari:

Possono fagocitare le cellule infettate da virus o tumorali;

• Possono maturare: hanno sensibilità nei confronti di PAMP virali (ricorda: TLR vescicolari

• come il 3, 7 e 9 vengono a contatto con le cellule fagocitate)

Presentano in MHC-I proteine che si trovano nel citosol.

• In questo tipo di cellule antigeni endogeni virali o tumorali possono uscire dalle vescicole

• fagosomiali (meccanismo non noto). Le vescicole permettono il rilascio di proteine nel

citosol e quindi la presentazione in MHC-I.

La presentazione di antigeni in molecole MHC-I e MHC-II non sono fenomeni completamente

distinti. Quando una cellula dendritica ingerisce una cellule infetta o trasformata, quello che

• succede è che alcune proteine (tagliate da proteasi presenti nel fagolisosoma) fuoriescano

dal fagolisosoma al citosol: così, il proteasoma digerisce le proteine rilasciandone piccoli

frammenti ed è possibile l'esposizione degli antigeni sulle MHC-I delle cellule dendritiche.

È fondamentale questa caratteristica delle cellule dendritiche di trasporto dal

◦ fagolisosoma al citosol.

Nei fagolisosomi erano presenti cellule intere: è anche possibile che non tutti gli antigeni

• endogeni presenti nelle cellule fagocitate fuoriescano nel citosol, e quindi che restino nel

fagolisosoma. Al fagolisosoma arrivano le vescicole MIIC che portano nella membrana la

molecola MHC-II: è possibile che siano presentate delle porzioni di antigene endogeno su

molecole MHC-II nelle modalità che abbiamo discusso per gli antigeni esogeni.

Sembra quindi possibile (e infatti lo è) che antigeni batterici possano essere presentati

◦ su MHC-I, anche se l'attivazione di CTL non è rilevante per batteri non intracellulari.

L'interconnessione tra i due pathway è interconnessa: antigeni endogeni possono essere presentati

in MHC-I e MHC-II, così come antigeni esogeni possano esserlo. Sia chiaro, i peptidi derivati dal

taglio degli antigeni che vengono associati alle molecole MHC-I sono diversi generalmente da quelli

che si associano ad MHC-II (gli amminoacidi ancora sono differenti).

Analogalmente, nel caso di cellule tumorali, il secondo segnale per l'attivazione dei linfociti

citotossici è dato da una cellula APC che ha fagocitato la cellula tumorale.

Riassumendo: priming a CTL

Una DC (cellule dendritica) internalizza cellule morte a seguito dell’infezione virale o cellule

• tumorali, e indirizza i peptidi al pathway di classe I.

La DC migra al linfonodo e presenta l’antigene a linfociti T CD8 naïve.

+

• I linfociti CD8 (o CTL) proliferano nel linfonodo (sistema autocrino: produzione di IL-2 e

+

• presenza del recettore ad alta affinità per IL-2).

I linfociti T CD8 effettori escono dal linfonodo e vanno nel sito di infezione o di

+

• trasformazione neoplastica.

Per attivare i CTL è necessario che il TCR veda il peptide nel contesto di MHC I più molecole

• co-stimolatorie. Le dendritiche le hanno ottimamente ma anche cellule non dendritiche in

condizioni particolari possono esprimere molecole co-stimolatorie e attivare quindi CTL.

Ma una volta che il CTL è attivato dalla dendritica o da una cellula non dendritica

• (esprimente molecole co-stimolatorie), il CTL diventa effettore e può riconoscere ed

uccidere una cellula bersaglio che esprime il peptide in contesto MHC-I ma senza la

necessità della presenza di molecole co-stimolatorie.

Una volta attivato dunque, il CTL va nel sito di infezione.

• Interazioni non specifiche mediate da molecole di adesione sono coinvolte nella iniziale

• interazione tra CTL e cellula target, tuttavia queste interazioni non sono sufficienti per far

partire l’uccisione del target. È infatti richiesto il legame del TCR con l’appropriato

complesso MHC-peptide. Per eliminare le cellule infette non c'è bisogno di co-stimolazione,

è sufficiente la molecola MHC-I+peptide riconosciuta dal TCR.

Considerazioni sulla genetica e polimorfismo delle molecole MHC

MHC-I Risultato: uccisione delle cellule bersaglio tramite attivazione di CTL

• Funzione: presentazione alle cellule T citotossiche

• Distribuzione: nella maggior parte delle cellule nucleate

MHC-II

Risultato: attivazione dei linfociti T helper

• Funzione: presentazione alle cellule T helper

• Distribuzione: a parte le cellule epiteliali del timo, si trova sulle cellule dendritiche,

• macrofagi e linfociti B.

I loci MHC classe I e classe II sono poligenici (più geni codificanti per proteine che condividono

essenzialmente la stessa funzione).

Sul cromosoma 6 troviamo il locus sia per MHC-I e MHC-II.

1. MHC-I: α α

La catena delle MHC-I viene codificata da tre geni (ognuno codificante una catena ): A, B

e C.

β -microglobulina codificata invece sul cromosoma 15 ed è invariante.

◦ 2

2. MHC-II: β

Tre segmenti genici: DP, DQ e DR che hanno affiancati ciascuno un gene per la catena ed

α β α

un gene per la catena (in realtà, DR ha due geni per la catena e uno per la catena ).

MHC classe I e classe II sono polimorfi (alta variabilità a livello di un dato locus genico); ci sono

molte forme alternative (alleli) di un gene.

Gli alleli dei geni MHC sono codominanti, cioè entrambi i prodotti genici sono espressi sulla

superficie cellulare.

Benché ci siano migliaia di combinazioni all’interno di una popolazione, ci sono solo 4 possibili

combinazioni nell’ambito di fratelli.

Poiché i loci MHC sono polimorfici e poligenici, gli individui sono raramente omozigoti per

• un locus MHC.

Ogni cromosoma 6 avrà varianti alleliche diverse (con alta probabilità) per ognuno dei tre

• geni (3 geni per MHC-I) o segmenti genici (3 segmenti per MHC-II).

Sei molecole MHC-I ed MHC-II possibili (2 per ogni gene dei segmenti genici: 2x3 = 6 per

• MHC-II, mentre 2x3 varianti alleliche di geni per MHC-I).

Qual è il significato del polimorfismo e della poligenia in MHC?

La maggioranza degli individui ha 6 proteine MHC di classe I (ed almeno 6 MHC di classe II:

• β

almeno perché il locus DR presenta due geni per la catena , ma non occorre ricordare

questi dettagli) così che se una proteina non può presentare antigeni di un patogeno,

un’altra proteina MHC probabilmente può.

Polimorfismo e poligenia in MHC rendono impossibile per un patogeno alterare i suoi

• epitopi antigenici in modo che questi non possano essere presentati da una maggioranza di

individui in una popolazione, ognuna col suo grado di promiscuità.

Ciascuna specie ha migliaia di modi per presentare antigeni di un patogeno; per questo

• motivo, anche se alcuni individui (o piccole popolazioni) non riescono a presentare in modo

efficiente alcuni antigeni, la specie non è a rischio di estinzione.

Non è possibile avere un numero infinito di molecole MHC, ma l'evoluzione ha selezionato più

varianti alleliche nella popolazione.

Il polimorfismo delle glicoproteine MHC ha una natura molto diversa dal polimorfismo del TCR (e

degli anticorpi):

1. Anche se una specie nel suo insieme può fabbricare centinaia di classi differenti di

glicoproteine della classe I e II, un individuo eredita un singolo allele per ogni locus da ogni

due forme ogni glicoproteina

genitore e perciò può fabbricare al massimo diverse di della

classe I e II (6 nella totalità per MHC-I e 6 per MHC-II). Viceversa un individuo può

fabbricare milioni di TCR (e di anticorpi) diversi. Singole cellule T e singole cellule B tuttavia,

esporranno (o produrranno) TCR o anticorpi capaci di riconoscere un singolo antigene.

Il polimorfismo di TCR (e analogamente del BCR dei linfociti B) riguarda il singolo

◦ individuo;

Il polimorfismo delle molecole MHC riguarda la specie (o, se vogliamo, la popolazione).

2. Non ci sono meccanismi di ricombinazione somatica alla base del polimorfismo delle

glicoproteine MHC; viceversa ci sono alla base del polimorfismo del TCR e degli anticorpi.

MHC e rigetto dei trapianti

maggioranza

Alla base della dei casi di rigetto dei trapianti vi è il riconoscimento delle

• molecole MHC non self.

Gli organi trapiantati da donatori aventi MHC dissimili (anche per un solo aa!) da quelle del

• ricevente sono rapidamente rigettati per la presenza, in ogni individuo, di un gran numero

di linfociti T (1-10% del totale dei linfociti T) che reagiscono verso le molecole MHC (I e II)

non self o allogeniche, dando luogo ad una reazione allogenica o alloreattività.

I linfociti coinvolti possono essere CD4 e/o CD8 (T helper o T citotossici).

+ +

Alloriconoscimento diretto ed indiretto

Le cellule T alloreattive si ritiene rispondano a una molecola MHC estranea

solo quando quest'ultima è legata ad un peptide.

Non è inusuale che il tessuto del donatore abbia cellule dendritiche:

• questo è un problema. Saranno presenti nell'organo trapiantato,

dunque, delle APC con MHC non self.

Le cellule T naïve reattive vs il trapianto devono essere attivate a

• diventare effettrici: necessitano di essere attivate da cellule APC che

presentino MHC allogeniche e molecole co-stimolatorie. Il trapianto,

come abbiamo detto, contiene cellule APC.

La cellula dendritica può uscire dall'organo trapiantato, raggiungere i

• linfonodi e trovare uno o più linfociti capaci di dare un

riconoscimento verso l'MHC allogenico.

Questo tipo di riconoscimento in cui è coinvolta la MHC del donatore prende il nome di

• alloriconoscimento diretto. [APC-(donatore)+antigene attivano linfociti T del ricevente].

Altra modalità: alloriconoscimento indiretto:

Le cellule che presentano gli antigeni in questo caso sono self.

• Gli antigeni vengono liberati dall'organo del donatore.

• La molecola MHC è self, mentre l'antigene è relativo ai tessuti del donatore.

• Questa modalità è meno frequente: molte proteine dell'organo trapiantato sono simili a

• quelle del ricevente.

In uno xenotrapianto (da animale a uomo, o viceversa) è invece probabile che il corredo

proteico sia dissimile e possa dare questo tipo di alloriconoscimento.

In generale, in un trapianto si utilizzano organi il più possibile MHC-compatibili.

Per evitare il problema dell'alloriconoscimento diretto si prova ad eliminare le cellule dendritiche

del tessuto donatore. L'altra cosa che si fa è che il paziente che riceve l'organo viene trattato con

immunosoppressori. Organi linfoidi centrali e periferici

Il sistema linfoide è composto da linfociti, cellule dendritiche, macrofagi, cellule epiteliali e stromali

ed è organizzato in organi provvisti di capsula o in accumuli di tessuto linfoide sparso.

Gli organi linfoidi contengono linfociti e cellule non linfoidi come macrofagi, cellule

• dendritiche, cellule epiteliali e stromali.

Gli organi linfoidi sono importanti per la generazione e maturazione di linfociti,

• l’avviamento delle risposte immunitarie e la perpetuazione di queste.

Organi linfoidi primari: costituiscono i maggiori centri di linfopoiesi in cui i linfociti si

differenziano dalle cellule linfoidi staminali (sc), proliferano e maturano. Nei mammiferi, incluso

l'uomo:

I linfociti T sono prodotti nel midollo osseo ma maturano nel timo;

• I linfociti B sono prodotti nel fegato fetale e nel midollo osseo e maturano nel midollo

• osseo, bone marrow (negli uccelli, la maturazione dei linfociti B avviene in un organo

chiamato Borsa di Fabrizio).

Negli organi linfoidi primari i linfociti acquisiscono il loro repertorio di recettori specifici per

l'antigene ed “imparano” a distinguere tra gli antigeni self e quelli non self. I linfociti che

ϊ ϊ

fuoriescono da questi organi sono maturi (hanno il loro TCR o BCR specifico), ma na ve. Da na ve

diventano effettori, ma sono già maturi.

Dal timo usciranno quasi esclusivamente linfociti T capaci di riconoscere MHC-self ed

• antigeni non self.

Per quanto riguarda i linfociti B, usciranno dal midollo osseo solo quelli non capaci di

• riconoscere antigeni self: non parliamo di molecole MHC perché i linfociti B per attivarsi

non richiedono presentazione in MHC.

Gli organi linfoidi centrali o primari sono la sede per la generazione e iniziale maturazione dei

linfociti.

Le cellule B maturano nel midollo osseo nell’uomo (delle ossa piatte come il bacino, lo sterno, il

cranio, le costole, vertebre, scapole, e nell'osso spugnoso della parte finale delle ossa lunghe,

femore e òmero). Negli uccelli le cellule B maturano nella Borsa di Fabrizio. β

Un'evidenza che le ossa del cranio svolgono un'azione emopoietica si ha nella -talassemia ,

• nella quale si assiste ad un'iperattività del midollo osseo all'interno delle ossa craniche, così

spinta che le ossa craniche sono soggette a deformazione, si evidenziano delle spine (in una

sorta di “cranio a spazzola”).

Organi linfoidi secondari:

Intrappolano gli antigeni.

• Sono il sito di inizio della maggioranza delle risposte immunitarie.

Comprendono i linfonodi, la milza ed il tessuto linfoide associato alle mucose (MALT), incluse le

tonsille e le placche del Peyer dell'intestino.

Il MALT non è organizzato in strutture capsulari ben definite, ma è caratterizzato dalla presenza di

linfociti T e B agglomerati tra loro e non involucrati in una struttura connettivale.

In questi organi avvengono le interazioni cellulari produttive fra cellule APC, linfociti T e B

• che portano ad una risposta immunitaria specifica; avvengono principalmente nei linfonodi

e nella milza.

Avviene anche l'incontro di antigeni liberi e linfociti B.

Da queste interazioni, si avranno linfociti T e B effettori.

ORGANI LINFOIDI PRIMARI

Timo Il timo è localizzato nel torace.

• Rivestito da una capsula connettivale.

• Organo bilobato: ciascun lobo è suddiviso in lobuli o follicoli separati da trabecole

• connettivali.

Atrofizza con l'avanzare dell'età.

• Si evidenziano strutture di tipo corneo chiamati corpuscoli di Hassal: sono costituiti da

cellule epiteliali disposte concentricamente che presentano segni di trasformazione cornea.

Sono un segno dell'atrofizzazione progressiva del timo.

Per ciascun lobulo si distinguono:

La zona sottocapsulare, a livello della quale arrivano i linfociti T prodotti dal midollo

• osseo: non hanno il TCR e sono CD4 e CD8 . Nel timo avviene la ricombinazione somatica

- -

che si tradurrà alla fine nell'espressione del TCR sulla superficie.

La zona corticale: contiene cellule T immature in fase di proliferazione e cellule epiteliali.

• Queste ultime hanno un ruolo importante nella maturazione dei linfociti T.

In questa regione i linfociti T subiscono un processo che prende il nome di selezione

positiva, il quale si conclude con l'eliminazione di tutte le cellule T incapaci di riconoscere i

MHC self.

La zona midollare: contiene cellule T mature, cellule dendritiche e macrofagi. Entrambi

• questi due ultimi tipi cellulari sono importanti nell'eliminazione dei linfociti T responsivi nei

confronti di antigeni self presentati in MHC (selezione negativa).

È stato dimostrato che una quota significativa di antigeni extratimici sono espressi nel timo.

ϊ

Dal timo, alla fine, fuoriescono linfociti na ve ma maturi, che hanno due caratteristiche:

1. Riconoscono le molecole MHC self.

2. Non reagiscono ad antigeni self presentati in MHC.

Tutto ciò che esula da queste due prerogative viene eliminato per apoptosi all'interno del timo. Nel

timo si acquisisce la tolleranza centrale (perché avviene in un organo linfoide centrale). Solo l'1%

dei linfociti iniziali viene immessa in circolo.

Esistono oltre a questi meccanismi di tolleranza centrale, anche altri meccanismi che controllano

che eventuali linfociti T fuoriusciti dal timo (e pericolosi perché capaci di riconoscere il self)

vengano eliminati. Questi meccanismi avvengono in periferia, e sono chiamati meccanismi di

tolleranza periferica.

Borsa di Fabrizio

Presente solo negli uccelli.

• Associata alla parete dorsale della cloaca.

• Assomiglia ad una porzione di intestino modificata con pliche che si dirigono verso il lume

• centrale e sulla loro superficie sono organizzati i follicoli all'interno dei quali avviene la

maturazione dei linfociti B.

Col passare degli anni l'organo va incontro ad atrofia.

Il nome deriva da Girolamo Fabrizi d'Acquapendente, anatomista italiano che fece costruire il

teatro anatomico di Padova.

ORGANI LINFOIDI PERIFERICI

Linfonodi (stazioni di controllo del sistema circolatorio linfatico)

• Milza (stazione di controllo del sistema circolatorio sanguigno)

• Tessuto linfoide associato alle mucose (MALT). Rispetto ai linfonodi specialmente (che sono

• strutturati in una capsula che li delimita), i MALT sono costituiti da agglomerati di cellule

interdispersi all'interno delle mucose.

Comprende in particolare il tessuto linfoide associato all'intestino (GALT: tonsille, adenoidi,

placche del Peyer, appendice, linfonodi mesenterici), ed il tessuto linfoide associato ai

bronchi (BALT).

La rete linfonodale

L'interessamento dei linfonodi avviene in modo localizzato intorno alla sede

di infezione.

I linfonodi sono connessi tra loro da una rete linfatica. Il sistema circolatorio

linfatico si immette nel sistema circolatorio sanguigno attraverso il dotto

toracico, che si immette nella vena succlavia di sinistra (punto di ingresso

della linfa nel sistema circolatorio sanguigno): sono due sistemi

interconessi. I linfonodi hanno un

diametro di 1-25 mm.

Sono rotondi e posseggono

un'attaccatura, l'ilo, da cui

esce il vaso linfatico

efferente.

Sono presenti due vasi

linfatici afferenti ed uno

efferente. La linfa vi entra

mediante i linfatici

afferenti, scorre lungo i

seni midollari ed esce

dall’ilo-interruzione della

capsula connettivale-per

mezzo dei linfatici efferenti che si riversano nel dotto toracico (fuoriescono anche le cellule

effettrici). I linfonodi sono anche irrorati da una circolazione sanguigna.

I linfonodi sono organi caratteristici dei mammiferi.

Nel linfonodo sono presenti linfociti T, linfociti B, cellule dendritiche, etc. Le zone dove si trovano le

cellule T e le cellule dendritiche che presentano sono distinte da quelle dove sono le cellule B: si

distinguono l'area a cellule T e l'area a cellule B.

Dall'esterno verso l'interno:

Zona corticale. Ci sono delle zone, visibili al microscopio, in cui si formano agglomerati di

• cellule B: sono cellule in attiva proliferazione (in seguito all'incontro con l'antigene) e

prendono nome di centri germinativi. Le cellule B proliferano in seguito all'incontro con

l'antigene per cui possiedono il recettore specifico.

Zona paracorticale. Andando più verso il centro del linfonodo si trova l'area paracorticale

• dove si trovano le cellule T (prevalentemente) e le cellule dendritiche.

Zona midollare. Ancora verso il centro, verso la via di uscita, si trovano sia cellule T

• effettrici che cellule B effettrici (note anche come plasmacellule).

La milza

La milza è una stazione di filtraggio che riguarda la

circolazione sanguigna e non quella linfatica. È deputata

alla cattura di materiale antigenico che viene ingerito dai

fagociti di cui è ricca la milza.

Costituita da due tipi principali di tessuto:

Polpa rossa: deputata all'eliminazione di eritrociti

• senescenti (eliminazione effettuata dai macrofagi

locali).

La vita media di un globulo rosso è di circa 120

giorni.

Polpa bianca: contiene il tessuto linfoide

• organizzato a formare una guaina intorno ad

un’arteriola centrale: contiene sia cellule B che T

che cellule presentanti l’antigene.

L’area T-cellulare è quella più prossima

◦ all’arteriola.

Le cellule B si trovano al di là di questa zona e sono organizzate in follicoli primari non

◦ stimolati e secondari stimolati dotati di centro germinativo.

MALT

Tessuto linfoide associato alle mucose, non organizzato in strutture delimitate da capsule

connettivali (come invece è ben visibile in un linfonodo). È costituito da gruppi cellulari.

A seconda di dov'è organizzato (se nell'intestino o nell'epitelio bronchiale) possiede acronimi

diversi: Gut Associated Lymphoid Tissue:

Tessuto linfoide associato all'intestino (GALT, tonsille,

• adenoidi, placche del Peyer, appendice, linfonodi mesenterici).

Tessuto linfoide associato ai bronchi (BALT).

Il MALT si trova al di sotto degli epiteli. Se non c'è l'occasione di una lacerazione, gli antigeni che

sono presenti nel lume non passano al di sotto.

Come si realizzano le risposte immunitarie nei confronti di antigeni non self che si trovano nel

lume, quando l'epitelio mucosale resta integro? Due meccanismi:

1. Uno prevede l'intervento di cellule dendritiche. È stato dimostrato che riescono ad

allungare i dendriti per infilarsi tra un cellula e l'altra e raggiungere il lume intestinale.

2. L'altro coinvolge le cellule M. Queste, sono interdisperse tra le cellule epiteliali a livello di

tutti gli epiteli mucosali.

Svolgono la funzione di veicolare gli antigeni dalla parte luminale verso la parte baso-

laterale dove si trovano gli organi linfoidi associati alle mucose.

Gli antigeni vengono trasportati per transcitosi (viene portato da un lato all'altro senza

subire nessuna modificazione, a differenza di quanto accade nell'endocitosi in cui il

materiale internalizzato viene degradato nei lisosomi) dalla parte apicale (rivolta verso il

lume) alla parte basale (a ridosso con il tessuto linfoide e quindi a contatto con le cellule

dendritiche).

Riassunto

Cellule B e T immature maturano negli organi linfoidi centrali (midollo osseo per i B, timo per i T).

Una volta maturi, i linfociti circolano nel sangue ed attraverso la linfa e attraversano gli organi

linfoidi periferici. Fino al momento in cui essi non incontrano un antigene per il quale hanno il

ϊ

recettore specifico (BCR o TCR), i linfociti circolanti sono linfociti maturi na ve.

Quando questi linfociti incontrano l’antigene (in genere in un organo linfoide periferico) e lo legano

in modo specifico:

1. Si bloccano (cessano di circolare) e formano una sinapsi immunologica

2. Si dividono (proliferano)

3. Si differenziano in cellule effettrici:

Cellule T effettrici (in seguito all'incontro con MHC+peptide) sono CTL (T citotossici) e T

◦ H

Cellule B effettrici (in seguito al riconoscimento dell'antigene) sono plasmacellule

Arrivo dell'antigene all'organo linfoide periferico

Gli antigeni in periferia possono essere raccolti da cellule dendritiche che li trasportano agli

• organi linfoidi periferici attraverso il sistema linfatico.

Gli antigeni possono anche entrare nel sistema linfatico (o sanguigno) autonomamente

• come antigeni liberi e raggiungere gli organi linfoidi dove vengono raccolti da macrofagi o

cellule dendritiche.

Antigeni liberi possono essere riconosciuti da linfociti B che non richiedono presentazione

• da parte di una APC.

Immunità cellulo mediata (CMI)

Ci concentriamo ora sull'immunità cellulo mediata (CMI) che comprende l'attività dei linfociti T 1 e

H

i CTLs (l'attività dei T 2 verrà trattata quando parleremo di immunità umorale).

H

DIFFERENZIAMENTO ED ATTIVITÀ DEI LINFOCITI T HELPER

Cosa succede nel linfocita T helper dopo che una cellula APC gli ha presentato un antigene:

Le cellule T attivate da questo circuito

auto-propagante si dividono attivamente

nell'arco di alcuni giorni.

Fattori che influenzano il differenziarsi delle cellule T H

Il destino di una cellula T attivata dipende da segnali forniti dall’ambiente locale, perlopiù

citochine, liberati soprattutto dalle cellule presentanti l’antigene. Parliamo di segnale 3.

I linfociti T helper possono differenziarsi in cellule dal profilo funzionale diverso:

T 1

• H

T 2

• H

Cellule T = cellule T follicolari heper, specializzate nel fornire aiuto alle cellule B

• FH

T 17

• H

Altri su cui non ci soffermeremo

RICORDA: il segnale 1 è l'MHC-II-peptide riconosciuto dal TCR, mentre il segnale 2 è dato dal

riconoscimento delle molecole co-stimolatorie presenti sulla dendritica CD80 e CD86 (forme

alleliche di B7) e il partner CD28 dei linfociti T.

Il fenotipo funzionale di una cellula T attivata dipende da segnali forniti dall'ambiente locale,

perlopiù citochine, liberati soprattutto dalle cellule presentanti l'antigene (segnale 3). Il tipo di

citochina (o citochine) che la cellula dendritica rilascia è a sua volta funzione del tipo di

microrganismo (più in dettaglio, del PAMP di quest'ultimo che ingaggia uno specifico Toll-like

receptor della cellula dendritica).

Il profilo definitivo delle cellule T helper può essere acquisito nel linfonodo ma anche nel tessuto

milieu

dove arrivano, in virtù di mediatori locali che concorrono nel determinare un particolare

citochinico (contesto citochinico).

Le attività effettrici dei linfociti T, dopo che essi sono entrati nelle sedi di infezione, non sono

definite semplicemente dai segnali che hanno ricevuto nei tessuti linfoidi; anche a livello locale vi è

una regolazione continua dell'espansione e delle attività effettrici delle cellule CD4 differenziate.

Le cellule figlie hanno bisogno del mantenimento del segnale adeguato durante la proliferazione

per mantenere il fenotipo funzionale adatto per l'eliminazione dell'agente causale a livello locale.

Fonte dei segnali 3

IL-12: prodotta dalle cellule dendritiche a seguito dell'ingaggio di un TLR da parte di un

• PAMP. Prodotta anche dai macrofagi: i linfociti T effettori trovano un contesto citochinico

anche localmente per mantenere il profilo.

Funge da segnale 3 per determinare il profilo T 1.

H

RICORDA: i T helper che differenziano grazie alle citochine che costituiscono il segnale 3

stanno proliferando con il sistema autocrino IL-2/recettore per IL-2 ad alta affinità.

IFN-γ: prodotta dalle cellule NK (natural killer, componenti dell’immunità innata, attivate da

• IL-12) e dai linfociti T 1 che, una volta attivati attraverso il rilascio di questa citochina

H

contribuiscono a rinforzare il segnale di differenziamento di altri T 1.

H

IL-4: prodotta da eosinofili, basofili e mastociti.

• Funge da segnale 3 per determinare il profilo T 2.

H

TGF-β (linfotossina A) e IL-6: prodotti da macrofagi.

• IL-23: prodotta da cellule dendritiche e macrofagi.

Le cellule T 1 producono interferone γ (IFN-γ), una citochina che ha diversi effetti completamente

H

disgiunti da quelli esercitati dalle citochine prodotte dai T 2. IFN-γ è un pro-T 1, nonostante il

H H

segnale 3 prevalentemente necessario per avere il profilo T 1 è IL-12.

H

IFN-γ impedisce che si sviluppi il profilo T 2. Parimenti, IL-4 e IL-5 prodotte ha T 2 impedisconoche

H H

si sviluppi il profilo T 1.

H

Le T 1 favoriscono:

H La produzione di IgG2a opsonizzanti da parte dei linfociti B. La parte costante degli

• anticorpi è riconosciuta dall'Fc receptor delle cellule ad attività fagocitaria.

La produzione di anticorpi rientrerebbe nel filone dell'immunità umorale, ma di fatto sono

essenziali per promuovere un evento cellulare: la fagocitosi. È comunque intendibile come

immunità cellulo mediata.

NOTA: vengono stimolati i linfociti B che presentano un complesso MHC-II+peptide identico

a quello che la cellula dendritica aveva presentato al linfocita T helper naïve.

La produzione di anticorpi che attivano il complemento.

• Avevamo detto che si può attivare per la via alternativa (quella che parte da C3 di cui

abbiamo già discusso) che non richiede il coinvolgimento dell'immunità adattativa. La via

classica di attivazione del complemento, invece, si avvia solo se la risposta immunitaria

adattativa è stata attivata. Richiede che siano presenti gli anticorpi (esistono solo due classi

di anticorpi che avviano la via classica del complemento: IgG e IgM). C3b è un'opsonina

(viene prodotta anche nella via classica).

La cascata del complemento può essere intesa come immunità cellulo mediata, nonostante

siano coinvolti anticorpi.

L’attivazione dei macrofagi (tramite IFN-γ e perché favoriscono IgG e proteine del

• complemento che sono opsonine), che comporta l'aumento del loro potere microbicida. I

macrofagi sono APC, bersaglio dei T effettori.

M. tubercolosis è un esempio di batterio molto resistente all'attività dei macrofagi (è un

batterio intracellulare). L'attivazione consiste in una risposta efficace contro microbi

intracellulari.

Sia linfociti B che macrofagi sono bersaglio dei T effettori, e vengono riconosciuti tramite TCR per

MHC-II+peptide riconoscibile dai T effettori.

1. Un po' dei linfociti T attivati restano negli organi linfoidi secondari: se intercettano un

linfocita B con MHC-II+peptide identici a quelli della cellula dendritica che aveva attivato il

T, ciò causa l'attivazione delle cellule B.

Le cellule B vengono a contatto con l'antigene perché viene trasportato nell'organo linfoide

secondario dal sistema linfatico.

2. Una parte più grande di cellule T si allontana dal linfonodo. Il T 1 effettore andrà a formare

H

la sinapsi immunologica solo con i macrofagi che presentano MHC-II+peptide identici a

quelli della cellula dendritica che nel linfonodo aveva attivato il T.

I macrofagi e i linfociti sono bersaglio dei T, ma è anche vero che i T 1 nel momento in cui entrano

H

in contatto con macrofagi e linfociti B instaurando la sinapsi immunologica provocano la

proliferazione dei linfociti T effettori (T 1): in questa fase di proliferazione locale è necessaria la

H

presenza del corretto segnale 3.

Le cellule T 2:

H

Forniscono un valido aiuto nelle risposte immunitarie umorali (anticorpi) e sono

• responsabili della produzione della classe anticorpale IgE (prevalente nelle reazioni

allergiche e in caso di presenza di vermi parassiti) in quanto producono IL-4 che determina

lo switch IgE.

Stimolano la crescita e la differenziazione degli eosinofili (grazie alla produzione di IL-5),

• abbondanti nelle reazioni allergiche e contro i vermi.

Stimolano la sintesi di IgA (che hanno un ruolo essenziale nella protezione delle mucose e

• nel garantire l'immunità neonatale. Sono la classe anticorpale più abbondante del latte

materno e del colostro. Il latte contiene anche IgG e IgM. È il motivo per cui i bambini che

vengono allattati sono meno soggetti a gastroenteriti).

Le cellule T 1 sono associate alle reazioni infiammatorie cellulo-mediate, mentre le cellule T 2 sono

H H

associate a potenti risposte anticorpali ed allergiche.

Il sistema immunitario divide il mondo dei patogeni in patogeni extracellulari ed intracellulari

I virus sono extracellulari solo quando si muovono da una cellula all’altra (i virus non replicano

fuori dalle cellule)

L’attivazione dei macrofagi da parte delle cellule T 1 è importante nella eliminazione di alcuni

H

Pneumocystis carinii;

patogeni extracellulari, quale per es. tuttavia in molti casi questi ultimi sono

eliminati agevolmente anche senza attivazione dei macrofagi. Ma soprattutto il ruolo dei macrofagi

(Mycobacterium tuberculosis

attivati dai T 1 è chiave nella eliminazione di patogeni intracellulari e

H

lepreae) che crescono nei fagosomi dei macrofagi impedendone la fusione con i lisosomi. Sono tra

l'altro particolarmente resistenti ai meccanismi microbicidi dei macrofagi. Le cellule T 1 aiutano i

H

lisosomi a fondere con le vescicole contenti i batteri e potenziano il burst respiratorio; aumentano

anche la produzione di proteasi.

L’attivazione da parte delle cellule T 1 dei macrofagi richiede che questi presentino in MHC-II

H

l’epitopo per cui il T ha TCR specifico; fa da co-stimolo il legame CD40 del macrofago e CD40L del

linfocita.

A questo punto i linfociti T 1 rilasciano IFN-γ che attiva i macrofagi, cioè stimola la fusione

H

lisosomi-fagosomi (a dispetto del fatto che in caso di infezione da micobatterio è un evento che si

verifica difficilmente) e potenzia l'attività microbicida, amplificando i meccanismi sia ossigeno-

dipendenti che indipendenti.

Mycobacterium tubercolosis

Tramite aerosol un infetta un individuo: si trova a livello

• polmonare. I macrofagi locali lo fagocitano ed iniziano a produrre citochine avviando così il

processo infiammatorio. Localmente giungono altre cellule (neutrofili prima e monociti

poi).

L'aumento di permeabilità dei vasi permette la fuoriuscita di liquido dal circolo, e quindi dei

componenti del complemento in esso disciolti.

C3a e C5a fanno aumentare la permeabilità vasale direttamente e indirettamente

attraverso il coinvolgimento delle mast-cells; stimolano l'adesione (contribuiscono al

reclutamento dei linfociti, sono chemotattiche).

Viene prodotta in cascata anche l'opsonina C3b. Si forma il complesso di attacco alla

membrana, cui sono particolarmente sensibili i Gram-negativi.

Le cellule dendritiche che hanno fagocitato il microrganismo maturano (in virtù dei PAMPs

del microrganismo) ed arrivano tramite il sistema circolatorio linfatico ad un organo

linfoide secondario. Hanno le molecole MHC-II+peptide e le molecole co-stimolatorie:

possono attivare più linfociti T dotati di TCR specifico. Le cellule dendritiche possiedono fino

a 6 molecole MHC-II, ognuno dotato di una cerca promiscuità per quanto riguarda la

presentazione di epitopi diversi.

In virtù del segnale 3 che dipende dall'infezione a monte, il profilo funzionale dei linfociti T

sarà specifico (in questo caso proliferano e differenziano in T 1). Una piccola quota parte

H

rimarrà nel linfonodo ed aiuterà i linfociti B ad produrre anticorpi opsonizzanti e di

anticorpi che attivano il complemento. La maggior parte delle T 1 torna in circolo ed arriva

H

in sede di infezione (il polmone): l'endotelio prossimo alla zona di infezione è più adesivo.

Tramite chemochine il linfocita arriva nella sede.

Questo avviene a livello dei vasi con calibro minore (si è più lontani dal cuore, il flusso

sanguigno è più lento, le cellule possono trovarsi vicine all'endotelio).

Sul macrofago da attivare, le cellule T effettrici riconosceranno MHC-II+peptide.

M. tubercolosis

L'infezione del è di difficile risoluzione. A livello polmonare si identificano

dei tubercoli.

Quando un macrofago (anche se attivato) non riesce ad uccidere un batterio

◦ intracellulare si può formare un granuloma.

Il termine tubercolo fa riferimento alla tubercolosi nello specifico, ma questo tipo di

◦ risposta si ha in tutti i casi in cui il microrganismo scatenante è ineliminabile. Il

tubercolo è costituito da un agglomerato di macrofagi attivati (che restano molto a

contatto tra loro con prolungamenti citoplsmatici conferenti loro un aspetto simile a

cellule epiteliali, per questo sono dette cellule epitelioidi. Le cellule epitelioidi posson

fondersi costituendo le cellule giganti multinucleate) ed una corona esterna di linfociti

T 1. In questo modo l'infezione rimane localizzata: in molti casi però la parte centrale di

H

queste strutture tubercolari può andare incontro a necrosi colliquativa. Le cellule

muoiono, rilasciano enzimi proteolitici: si forma un liquame ricco di batteri che spesso

trova poi sfiato da questo tipo di strutture e tende a dare una tubercolosi miliare,

ovvero una tubercolosi estesa ad aree non necessariamente polmonari che può avere

un'evoluzione infausta.

Sommario delle funzioni effettrici delle cellule T

Una volta attivate le cellule T vanno dove possono svolgere la loro funzione effettrice.

• I CTLs vanno nel sito di infezione.

• Le cellule T 1 possono andare nel sito di infezione o stare negli organi linfoidi periferici ed

• H

aiutare certe risposte delle cellule B. Potenziano enormemente l'attività dei macrofagi per

far fronte ad infezioni da parte di batteri intracellulari.

Le cellule T 2 rimangono negli organi linfoidi periferici dove aiutano le risposte delle cellule

• H

B.

I linfociti T 17 differenziano in questa direzione grazie ad una serie di citochine: TGF-β, IL-1, IL-6,

H

IL-21, IL-23.

Promuovono l'infiammazione.

• Hanno un'attività di stimolazione dei macrofagi, ma meno potente dei T 1: hanno una

• H

funzione nei confronti di infezioni da parte di batteri extracellulari.

Ruolo nell'eliminazione anche dei funghi.

• Importanti nelle malattie autoimmunitarie in cui la componente infiammatoria è molto

• sviluppata (tra queste il morbo di Crohn e l'artrite reumatoide).

T 1, T 2, e T 17 cells sono importanti per l’eradicazione di patogeni intracellulari, di elminti (vermi),

H H H

di batteri extracellulari e funghi, rispettivamente. I T 1 e specialmente i T 17 sono anche coinvolti

H H

in molti tipi di malattie autoimmuni, mentre i T 2 contribuiscono a sostenere le risposte allergiche.

H

I T sono critici nel mantenere la self-tolerance e nel modulare la risposta immunitaria alle

REG

infezioni.

L'attivazione è più complessa e non completamente nota.

• Hanno lo scopo di controllare la tolleranza: a livello del timo vengono eliminati i linfociti T

• autoresponsivi, ma alcuni sfuggono a questo controllo. Il ruolo dei linfociti T helper

regolatori è determinante nel prevenire reazioni di tipo autoimmune (qualora non vengano

eliminati in sede timica i linfociti autoresponsivi).

Regolano la risposta immunitaria. Evitano che le risposte siano eccessive: i macrofagi

• vengono attivati dai T 1 e producono moltissimi ROS, pericolosi anche per i tessuti

H

dell'ospite, per esempio. Il ruolo dei regolatori è proprio relativo ad evitare che le risposte

immunitarie adattative diventino eccessive.

CD8 E CITOTOSSICITÀ CELLULO MEDIATA

Ora affrontiamo la citotossicità, cioè la modalità con cui alcune cellule leucocitarie (i CTLs e le

cellule NK) riconoscono e distruggono cellule infettate da virus e cellule tumorali.

+

PER RICORDARE: quando un linfocita CD8 diventa effettore (in seguito alla presentazione

dell'epitopo in MHC-I), questo si sposterà per andare nella sede di infezione. Si crea la sinapsi

immunologica tra il CTL e il suo bersaglio (una qualsiasi cellula riconosciuta).

Interazioni non specifiche mediate da molecole di adesione (LFA, ICAM) sono coinvolte

• nella iniziale interazione tra CTL e cellula target, tuttavia queste interazioni non sono

sufficienti per far partire l’uccisione del target.

È infatti richiesto il legame del TCR con l’appropriato complesso MHC-I+peptide.

Tre componenti importanti per l'eliminazione delle cellule target da parte dei CTL:

1. Perforine: dopo l’attacco alla cellula bersaglio, la cellula T citotossica indirizza i granuli

(contenenti perforina e granzimi) verso la membrana adiacente al bersaglio stesso; quindi,

in una fase calcio-dipendente, il contenuto dei granuli viene liberato nell’area di contatto fra

le due cellule (esocitosi). Le perforine formano dei complessi insieme ai granzimi e al

proteoglicano serglicina e si ritiene che operino come traslocatori permettendo il rilascio

dei granzimi nella cellula bersaglio.

La perforina contribuisce probabilmente all'entrata all'interno della cellula target dei

◦ granzimi. Non si formano pori, anche se si inizialmente si riteneva che fosse così. La

formazione di un poro comprometterebbe l'equilibrio osmotico della cellula, cosa che

avrebbe senso se la cellula morisse per necrosi, ma in realtà muore per apoptosi. Si

ritiene dunque che le perforine permettano la traslocazione dei granzimi.

La serglicina è un proteoglicano, probabilmente implicata nell’accumulo dei granzimi

◦ nei granuli.

2. Granzimi: si tratta di un gruppo di serin-treonin preoteasi contenute nei medesimi granuli

che contengono la perforina. Richiedono di entrare nel citoplasma della cellula target dove

attivano un pathway intracellulare che conduce ad apoptosi. In assenza di perforina essi

non entrano nella cellula bersaglio.

1. Digeriscono BID: si forma una versione troncata, tBID, che si localizza nella membrana

mitocondriale.

La membrana mitocondriale diventa più permeabile e permette la fuoriuscita del

citocromo C, che andrà a far parte del complesso dell'apoptosoma che farà partire

l'apoptosi.

L'apoptosoma è un complesso eptamerico composto da Apaf1-citocromo C-caspasi9

2. Altro target è la pro-caspasi-3: la sua digestione ha come risultato la liberazione della

caspasi 3, che ha come bersaglio un inibitore di una DNasi. Questo inibitore si chiama

ICAD (inibitor of Caspase-Activated Dnase), che inibisce CAD. Siti di taglio d specifici

saranno i target: viene effettuato un taglio tra a livello del linker internucleosomico,

esposto alla sua azione. Si ottengono frammenti di lunghezza pari ad un multiplo di

circa 180 bp; separando il DNA su gel si ottiene il tipico aspetto a “scale a pioli” (DNA

laddering).

3. Granulosina: è una proteina con attività microbicida e ad alte concentrazioni è in grado di

indurre apoptosi nelle cellule bersaglio.

I CTLs sono dei serial killers, ma non uccidono cellule vicine non infette. Sono muniti di Fas-ligand

sulla superficie.

Ricapitolazione della vita di una cellula T

I precursori dei linfociti si producono, come tutte le cellule del sangue, nel midollo osseo. I linfociti

T maturano però nel timo. Quando arrivano nel timo, nella regione sotto-capsulare, sono privi sia

di CD4 che CD8. Poi maturano. Discuteremo in seguito di come la maturazione avvenga nel

dettaglio. In seguito alla selezione positiva e negativa, solo il 3% dei linfociti T iniziali vanno in

circolo. I linfociti T naϊve si stanziano negli organi linfoidi secondari, in attesa che venga loro

presentato l'antigene. +

La presentazione in MHC-I attiva le cellule CD8 .

• +

La presentazione MHC-II attive le cellule CD4 .

• +

Avviene il processo IL-2 mediato, la proliferazione clonale. Per quanto riguarda i linfociti CD8 , essi

+

sono effettori e pronti per svolgere la loro funzione, mentre per quanto riguarda i linfociti CD4

essi richiedono un segnale 3 che ne guidi il differenziamento verso un certo fenotipi funzionale.

Una parte dei T 1 resterà negli organi linfoidi secondari per aiutare le cellule B a produrre

• H

IgG, mentre una parte maggiore andrà in sede di infezione per potenziare potere

microbicida dei macrofagi (che ricordiamo essere APC).

La maggioranza dei T 2 rimane negli organi linfoidi secondari.

• H

+

I CD8 si mobilitano in circolo per andare dove serve.

NOTA: a differenza dei T 1 che per formarsi richiedono una risposta infiammatoria (IL-12, IL-18,

H

IFN-γ), i T 2 si formano in seguito a stimolazioni ripetute e persistenti.

H

Natural killer (NK) Cells

Costituiscono un link fra l’immunità innata ed adattativa

Si sviluppano nel midollo osseo da progenitori linfoidi (come i linfociti T e B) e circolano nel

• sangue.

Non richiedono di passare per il timo per maturare ma condividono alcune similitudini

• +

soprattutto funzionali con le cellule T CD8 .

Assomigliano a grandi linfociti e contengono granuli, con lo stesso corredo dei CTLs.

• Sono già pronti per uccidere cellule target senza bisogno di “presentazioni“antigeniche (non

• hanno TCR). Riconoscono il target grazie ad un riconoscimento multirecettoriale ma non

specifico, e per questo le cellule NK non vengono ascritte nell'immunità adattativa.

Utilizzano perforina e granzimi per uccidere il bersaglio.

• Sembrano essere particolarmente importanti nella resistenza ad infezioni virali.

• Sono infatti importanti nelle fasi iniziali di un'infezione virale. L'immunità adattativa

+

richiede giorni per partire, quindi non sono ancora presenti linfociti CD8 effettori. Prima

che l'immunità adattativa si monti, il titolo virale viene mantenuto sotto controllo dalle

cellule NK.

Le NK hanno un ruolo importante nell'eliminazione di cellule infettate da virus che

interferiscono con la presentazione antigenica in MHC-I. La capacità di una cellula può

essere bloccata in più livelli: vedremo qualche esempio di virus che interferiscono con una

o più tappe. La mancata presentazione in MHC-I renderebbe le cellule infettate da questi

+

virus invisibile ai CD8 . Herpes simplex.

Ruolo particolarmente importante nelle infezioni da

Le cellule NK rappresentano circa il 15% dei linfociti circolanti.

Quando una cellula dell'ospite è infettata da un virus, essa inizia a produrre citochine (interferone

α e β). IFN-α e β percepiti dalle cellule vicine (azione paracrina), svolgono un'azione di contrasto

alla replicazione virale.

Queste azioni servono a preparare le cellule non infette a resistere all'infezione.

• La resistenza indotta da IFN-α e β è legata alla attivazione di geni che codificano per

• proteine ad azione inibitoria sulla replicazione virale.

Queste stesse citochine, in modo paracrino, attivano la trascrizione dei geni per le molecole

• MHC-I: preparano le cellule vicine per la presentazione di epitopi virali.

Infine, queste citochine attivano la cellule NK.

• L'attivazione delle

cellule NK si ottiene

anche grazie alla

IL-12 che abbiamo

già visto. Questa

interleuchina viene

prodotta dalle

cellule dendritiche

e macrofagi. I

macrofagi possono

fagocitare cellule

danneggiate in

seguito ad

un'infezione virale,

quindi non è

inusuale che un'infezione virale si accompagni da produzione di IL-12 da parte di cellule

infettate direttamente e da parte di macrofagi.

Le cellule NK rappresentano un componente precoce

della risposta dell’ospite ad infezioni virali.

A seguito di un'infezione, si assiste all'innalzamento del

titolo virale che si accompagna alla produzione di IFN-α, β

e IL-12 (attivazione delle cellule NK).

L'azione delle cellule NK porta ad un plateu la curva del

titolo virale. Tiene sotto controllo l'infezione, ma non la

elimina. C'è bisogno infatti dell'intervento della risposta

adattativa.

le cellule NK si attivano in risposta ad interferoni e

• a citochine rilasciate da macrofagi.

Le cellule NK contengono l’infezione iniziale fino a

• quando il sistema immunitario adattativo

interviene per eliminare il virus e le cellule infette.

Molti virus interferiscono con uno degli step che portano all'esposizione di MHC-I+peptide in

superficie. Le cellule NK (che possiedono molti recettori su cui non ci soffermeremo) usano un

sistema a due recettori per decidere se uccidere o meno una cellula bersaglio:

Quando una cellula si trova in condizioni di stress (es. sta trasformando in senso tumorale o

• è infettata. Il ruolo principale è però nei confronti di cellule infettate da virus) inizia ad

esprimere ed esporre sulla superficie cellulare glicoproteine che normalmente non esprime

(glicoproteine da stress). (killer-activating receptor)

Il primo recettore delle cellule NK chiamato KAR riconosce

• queste molecole da stress e tale riconoscimento fornisce un segnale positivo alla cellula NK

(killer-

che la rende capace di uccidere il bersaglio a meno che un altro recettore, KIR

inhibitory receptor) non fornisca un segnale negativo.

Questo secondo recettore riconosce molecole MHC-I, normalmente presenti sulle

◦ cellule nucleate.

Se tali molecole sono espresse sulla cellula, il killer-inhibitory receptor manda un

◦ segnale negativo che sovrasta il segnale positivo ricevuto attraverso il primo recettore: il

risultato è che la cellula NK non uccide il bersaglio.

Virus (e trasformazioni tumorali) frequentemente interferiscono con l’abilità delle cellule

• infettate (o tumorali) di esprimere molecole MHC-I.

In mancanza del segnale mediato dal KIR, agisce solo il segnale positivo mediato dal

◦ killer-activating receptor e la cellula NK rilascia perforine e granzimi verso la cellula

bersaglio.

Spesso i microorganismi provano ad interferire con la presentazione antigenica

Diversi virus interferiscono con singoli step. Ad esempio:

Herpes virus

• Una proteina virale interferisce con la funzione del TAP (trasportatore dei peptidi endogeni

che si generano nel citoplasma, che permette quindi l'ingresso di questi nel reticolo e

quindi il caricamento in MHC-I).

Adenovirus

• Una proteina inibisce la trascrizione dei geni MHC-I.

Un'altra blocca le molecole MHC-I a livello del reticolo.

HIV

• Proteine inibiscono l'espressione di MHC-I.

E molti altri sono i casi come questi.

Dunque, qualora le cellule tumorali (o infettate da virus) sfuggano all’eliminazione da parte dei

CTLs, esiste un ulteriore livello di controllo costituito dalle cellule NK le quali uccidono solo cellule

in cui le molecole MHC sono down-regolate: evento questo che si verifica in molte cellule tumorali

o infettate da virus.

Un modo attraverso cui le cellule NK riconoscono il loro bersaglio tramite un sistema chiamato

(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity).

ADCC Cellule infettate da virus o tumorali possono esprimere sulla superficie neo-antigeni (virali o

• propri del tumore) che vengono riconosciuti dagli anticorpi.

Le cellule NK posseggono recettori a bassa affinità per le porzioni Fc (porzioni costanti)

• degli anticorpi IgG.

Quando tramite questi recettori si legano ad anticorpi legati a superfici di cellule, le NK

• uccidono queste ultime rapidamente.

Anticorpi monoclonali sono usati nella terapia contro i tumori. Le cellule tumorali sono fagocitate

(gli anticorpi sono opsonine), ma anche eliminate da cellule NK tramite il sistema appena discusso.

Riassunto immunità cellulo mediata

L'immunità cellulo mediata coinvolge i linfociti T 1 e i linfociti T citotossici. Entrambi richiedono di

H

essere attivati a livello degli organi linfoidi secondari, in virtù della presentazione in MHC di

antigeni esogeni (per i T helper) o endogeni (per i citotossici).

Le cellule dendritiche svolgono la presentazione ottimamente. I T helper diventeranno T 1 se il

H M.

microrganismo infettante richiede una potente attivazione dei macrofagi (com'è nel caso del

tubercolosis). +

Anche i CD8 richiedono la presentazione e il co-stimolo. Diventati effettori, riconoscono il

bersaglio tramite riconocimento del solo MHC-I+peptide, senza richiedere ulteriore co-stimolo.

Una parte dei T 1 si ferma nei linfonodi dove c'è un ruolo di promozione di produzione di anticorpi

H

IgG, attivazione dell'ADCC e attivazione del complemento (via classica). La maggior parte però va

nella sede di infezione per attivare i macrofagi.

+

I linfociti CD8 si recano in periferia, dove servono. +

Il ruolo della citotossicità che abbiamo visto per i CD8 è condiviso da un altro tipo cellulare che

non appartiene all'immunità adattativa, rappresentato dalle cellule NK. Sono capaci di promuovere

+

l'apoptosi in modo identico a quanto viene fatto dai linfociti CD8 . Sono cellule dell'immunità

innata che possiedono molti recettori e possono uccidere le cellule che non espongono le molecole

MHC-I (cosa che viene compromessa dall'infezione virale da parte di alcuni virus).

Le cellule NK possiedono recettori per le IgG e tramite questi riconoscono il bersaglio.

TCR e selezione timica

La generazione dei recettori dei linfociti

Milioni di recettori (anticorpi e TCR) sono richiesti per legare milioni di antigeni.

Variazioni nelle regioni variabili di BCRs (e anticorpi) e TCRs spiegano come differenti recettori

possano legare differenti antigeni. Ma da dove nasce tanta diversità?

Struttura del T Cell Receptor (TCR)

α β

Due catene polipeptidiche, e , di lunghezza

• simile e glicosilate.

Entrambe le catene constano di una regione

• variabile (V) e di una costante (C).

α

La regione V della catena comprende un

◦ segmento joining (J). β

La regione V della catena comprende sia un

◦ segmento J che un segmento D (da diversity).

α

Per la catena ci sono 70-80 geni di tipo V differenti, in 5' rispetto a 61 geni di tipo J.

• β

Nel caso della catena concorrono a formare il DNA che codificherà per il dominio variabile

• un segmento V (su 52), uno D (2) ed un segmento J (13).

Questo è com'è il DNA dei linfociti T che arrivano al timo. Infatti, nella regione sotto-capsulare del

timo non hanno il TCR: la ricombinazione somatica si realizza proprio nel timo, non prima.

I riarrangiamenti genici avvengono a livello di sequenze del segnale di ricombinazione:

recombination signal sequences (RSS). Le ricombinazioni avvengono attraverso la formazione di

strutture a loop molto simili a quelle dello splicing dell'RNA.

Sia per gli anticorpi (caso riportato in figura) che per i TCRs, le RSS sono costituite da un

• eptamero, una sequenza spaziatrice di 12 o 23 bp e da un nonamero.

Gli eptameri e i nonameri che seguono un segmento V V o D sono complementari a

◦ L H

quelli che precedono i segmenti J , J o D con i quali si ricombinano.

L H

Sequenze complementari a valle di V con quelle a monte di D permettono l'appaiamento e

l'escissione del loop in modo da unire i frammenti. Lo stesso avviene a valle di D e a monte

di J.

Errori giunzionali aumentano maggiormente il numero di combinazioni diverse.

SOLO nel caso degli anticorpi (BCR) avvengono anche fenomeni di ipermutazione somatica (vedi

maturazione dell’affinità).

Maturazione dei linfociti T nel timo

Quando le cellule T immature che originano da precursori presenti nel midollo osseo,

• penetrano nel timo non esprimono né le molecole CD4 né quelle CD8. Si localizzano nella

regione sub-capsulare.

In questa fase i geni del TCR iniziano il processo di ricombinazione e le cellule esprimono

• sia CD4 che CD8.

Il 95% del repertorio di timociti con un particolare TCR che si genera non verrà a costituire

• il repertorio di cellule T presenti nei tessuti linfoidi periferici e ciò perché i timociti vengono

rigorosamente “istruiti prima di uscire dal timo”, in 2 fasi:

1. FASE 1: a livello di epitelio corticale, i timociti (linfociti T) che vi arrivano dalla regione

sub-capsulare e che a questo punto sono TCR , CD4 e CD8 , incontrano per la prima

+ + +

volta le molecole MHC-I e –II presenti sulle cellule dell’epitelio. Cosa accade:

I timociti che riconoscono i complessi peptide+MHC-I autologhi ricevono un segnale

• positivo di sopravvivenza e perdono le molecole CD4.

I timociti che riconoscono i complessi peptide+MHC-II autologhi ricevono un

• segnale positivo di sopravvivenza e perdono le molecole CD8.

I timociti che non riconoscono per nulla le molecole MHC vanno incontro ad

• apoptosi.

La fase 1 è la fase di selezione positiva che garantisce il riconoscimento da parte del

TCR dell’MHC (riconoscimento MHC-ristretto). In periferia le cellule T devono poter

riconoscere peptidi estranei presentati in MHC self!

2. FASE 2: i linfociti T sopravvissuti alla prima fase raggiungono l’epitelio medullare dove

avviene un fenomeno di selezione negativa: i linfociti (CD4 o CD8 ) incontrano

+ +

antigeni self esposti su cellule dendritiche, macrofagi e cellule epiteliali, qui presenti.

Tutti i linfociti che legano in modo forte peptidi self presentati in contesto MHC,

vengono eliminati per apoptosi. Questo processo prende anche il nome di induzione di

ϊ

tolleranza centrale. A questo punto i linfociti, na ve ma maturi, sopravvissuti alla

selezione possono lasciare il timo.

Dunque questo tipo di selezione garantirà la tolleranza verso il self. Esiste il rischio che

dei linfociti autoresponsivi sfuggano a questo tipo di controllo. Altri meccanismi di

tolleranza periferica permettono di far fronte a questo problema.

Il 95% dei linfociti non riconosce né MHC-I, né MHC-II: questi linfociti muoiono per apoptosi. Dal

timo esce solo il 3-5% dei linfociti iniziali.

Il 2.5% riconosce MHC-I, riceve segnali di sopravvivenza e smette di esprimere CD4: diventa

• ϊ

un linfocita CD8 na ve.

+

Il 2.5% riconosce MHC-II, riceve segnali di sopravvivenza e smette di esprimere CD8:

• ϊ

diventa un linfocita CD4 na ve.

+

In un giovane adulto vengono prodotti circa 5x10 timociti al giorno, ma solo 1.5x10 cellule

7 6

maturano e lasciano il timo.

Due questioni importanti:

1. Com’è possibile che l’ingaggio del recettore TCR da parte di complessi MHC-self peptide

porti sia a maturazione dei linfociti (selezione positiva nella corteccia del timo) che a morte

cellulare (selezione negativa nella medulla)?

Questa è solo un'ipotesi, ma sostenuta da evidenze sperimentali: la differenza sta

affinity model of thymocyte

nell'affinità nel legame TCR e MHC+peptide. Si parla di

selection .

Il legame moderato tra TCR e MHC+peptide costituisce un segnale di sopravvivenza.

◦ Il legame forte con i complessi MHC+peptide costituisce un segnale di morte.

Esiste una finestra di affinità che se vi rientrano i linfociti T, questi ricevono un segnale di

sopravvivenza: se c'è bassa affinità muoiono per apoptosi, ma se l'affinità è troppo alta

muoiono comunque per apoptosi (quest'ultima è la selezione negativa).

La selezione negativa e positiva avvengono anatomicamente in posizioni diverse del timo,

continuum.

ma possiamo immaginarli come un

2. Ci sono molte proteine tessuto-specifiche che non sono attese essere espresse nel timo

eppure i linfociti potenzialmente reattivi nei confronti di proteine extra-timiche vengono

comunque eliminati. Una possibile spiegazione sembra essere che molte proteine tessuto-

specifiche vengono comunque espresse nel timo.

È stato identificato un particolare fattore di trascrizione, chiamato AIRE, che permette

l'espressione di antigeni organo-specifici non propri del timo, nel timo.

Facciamo il punto

Nella regione sub-capsulare arrivano senza molecole CD4 e CD8.

• Avviene la ricombinazione somatica. Esprimono il TCR e sia CD4 che CD8.

• Selezione positiva e negativa: i linfociti che fuoriescono riconoscano MHC self ma non

• capaci di riconoscere antigeni self associati alla molecola MHC.

Un numero molto ridotto di linfociti T, 3-5% rispetto alla quota entrante, fuoriesce dal timo

• ϊ

come linfociti T na ve maturi.

Negli organi linfoidi secondari avviene quanto abbiamo ampiamente discusso

• I linfociti T citotossici ed i T 1 migrano al sito di infiammazione; la maggior parte dei linfociti

• H

T 2 rimane negli organi linfoidi periferici.

H

Nelle persone anziane in cui la funzione del timo è molto ridotta, la maggioranza delle cellule T

deriva dalla divisione di cellule T in periferia. Nuove cellule B sono invece continuamente generate

nel midollo.

Tolleranza periferica (o post-timica) per antigeni self

Molte cellule T potenzialmente autoreattive riescono inevitabilmente a sfuggire alla

• tolleranza centrale.

Possibile causa: nel timo molti antigeni o non sono presenti o se presenti lo sono a livelli

• insufficienti a indurre la tolleranza nel timo.

Dal momento tuttavia che le malattie autoimmuni sono molto rare è evidente che esistono

• degli altri meccanismi capaci di mantenere la tolleranza negli organi linfoidi periferici.

Possibilità di cui esistono evidenze sostanziali:

1. Mancanza di co-stimolazione: benché le cellule T possano incontrare antigeni self, non

risponderanno a meno che non ricevano un secondo segnale; la maggioranza delle volte,

cellule presentanti antigeni propri non forniscono il segnale 2 e questo si traduce in

tolleranza verso il self (vedi oltre).

Una cellula dendritica esprime le molecole co-stimolatorie quando matura, e questo

avviene in virtù della presenza di recettori che sono in grado di riconoscere molecole

microbiche/virali PAMPs, ma anche molecole self quali i DAMPs. Tra i DAMPs abbiamo

nominato tutte molecole che normalmente non dovrebbero trovarsi fuori dalla normale

sede in cui sono contenute (mtDNA, frammenti della matrice, proteine intracellulari come

HMGB1). Il co-stimolo è un processo che si realizza quando un TLR viene ingaggiato da un

PAMP (infezione microbica) o da un DAMP (indice di necrosi, danneggiamento tissutuale).

Vengono quindi espresse molecole MHC-II e molecole co-stimolatorie.

In tutte le altre circostanze dove non c'è un'infezione microbica o un danno, è pur vero che

antigeni self possono essere presentati ma se non c'è un segnale che induce la cellula

dendritica ad aumentare la produzione di MHC-II ma soprattutto di molecole co-

stimolatorie, anche linfociti T autoresponsivi che siano sfuggiti alla selezione negativa nel

timo non si attiveranno per mancanza del co-stimolo.

In apoptosi non si attiva il fattore di trascrizione NFkB, quindi non verrano espresse

massicciamente le molecole co-stimolatorie.

Cellule T “pericolose” non si attiveranno per mancanza di co-stimoli.

2. Sequestro di antigeni dal sistema immunitario: le barriere anatomiche di alcuni tessuti

impediscono alle cellule T di entrare in contatto con gli antigeni self del tessuto salvo

situazioni particolari. Esempi di tali “siti privilegiati” sono: l’interno dell’occhio, i testicoli, il

cervello.

Se si verificano dei traumi in una di queste strutture, i siti privilegiati possono venire a

contatto con il sistema immunitario portando risposte autoimmuni. La sterilità

autoimmune da danno meccanico, ad esempio, è proprio legata a questo. Ciò si verifica se:

C'è il danno meccanico.

◦ Sono in circolo linfociti T autoresponsivi che rispondono specificatamente.

3. Esistenza di linfociti T regolatori: garantisce la non attivazione dei linfociti T

autoresponsivi. Animali resi privi di questa particolare classe di cellule, sviluppano

frequentemente malattie autoimmuni.

4. Persistenza dell'antigene: antigeni persistenti (come possono essere quelli self) si

associano ad una persistente presentazione a linfociti T autoresponsivi sfuggiti al controllo

centrale. Ripetute attivazioni delle cellule T portano alla loro disattivazione o inducono

apoptosi: le cellule T autoresponsive muoiono in questo modo.

Quest'ultimo meccanismo di tolleranza periferica ha meno evidenze rispetto alle altre.

Se per qualche motivo uno o più di questi sistemi di controllo viene by-passato, esiste il rischio di

sviluppo di una malattia autoimmunitaria.

Immunità umorale e principi sulla vaccinazione

IMMUNITÀ UMORALE, GLI ANTICORPI

L'immunità umorale è mediata dalle attività degli anticorpi.

Ab=Ig=BCR; BCR (B Cell Receptor) è la forma di membrana delle immunoglobuline (mIg).

• Gli anticorpi secreti (sIg) sono fatti dalle plasmacellule (cellule B effettrici)

Due sono le funzioni degli anticorpi:

1. Legare l’antigene

2. Reclutare funzioni effettrici (molecole o cellule) per distruggere l’antigene.

Le funzioni sono svolte da regioni diverse:

I siti di legame per l’antigene variano con la specificità (regione variabile V).

• La funzione di reclutare effettori è determinata dalla regione costante C.

• Sono 5 le principali forme delle regioni C, quindi le funzioni effettrici sono limitate.

◦ Milioni di anticorpi dal punto di vista della specificità, ma solo 5 classi anticorpali.

◦ IgA

▪ IgM

▪ IgD

▪ IgE

▪ IgG

Es: gli anticorpi IgG sono opsonine, le cellule fagocitiche infatti hanno recettori per la

porzione Fc delle IgG.

Gli anticorpi sono molecole proteiche prodotte dai linfociti B. Essi proteggono gli spazi

extracellulari (l'aumento della permeabilità dovuta all'infiammazione lo permette), il sangue ed

alcune superfici da microrganismi.

Nella maggioranza dei casi le cellule B richiedono aiuto per montare una risposta

• anticorpale.

L’aiuto viene dalle cellule T. Sono soprattutto le cellule T 2, ma anche le T 1 ad aiutare.

◦ H H

L’aiuto delle cellule T si traduce nel controllare la proliferazione delle cellule B, il

◦ cambiamento di classe anticorpale e le ipermutazioni somatiche.

Ci sono anche alcune risposte anticorpali che non richiedono aiuto da parte delle cellule T:

• è il caso degli antigeni T indipendenti.

Natura chimica degli immunogeni

Proteine: la maggioranza degli immunogeni sono proteine. Possono essere proteine pure

• oppure glicoproteine o lipoproteine. In generale le proteine sono degli ottimi immunogeni.

Polisaccaridi: polisaccaridi puri e lipopolisaccaridi sono buoni immunogeni.

• Acidi nucleici: sono in genere poco immunogeni. Tuttavia possono diventare immunogeni

• quando sono a singolo strand o complessati con proteine.

Es. Lupus

Lipidi: in genere non immunogeni, benché possano comportarsi da apteni.

Tipi di antigeni

Antigeni T-indipendenti: sono antigeni che possono stimolare direttamente le cellule B a

• produrre anticorpi senza richiedere l’aiuto delle cellule T helper. Sono tutti grosse molecole

polimeriche con determinanti antigenici ripetuti (es. polisaccaridi, flagellina polimerizzata).

Antigeni T-dipendenti: sono antigeni incapaci di stimolare direttamente la produzione di

• anticorpi da parte delle cellule B in assenza delle cellule T helper (specialmente T 2). Le

H

proteine sono antigeni T-dipendenti. Strutturalmente questi antigeni sono caratterizzati dal

possedere poche copie di molti differenti determinanti antigenici.

L'aiuto si verificherà solo e unicamente quando un T vedrà su un B lo stesso complesso

◦ MHC-II+epitopo che è stato presentato in origine alla cellula T naϊve dalla dendritica.

La presentazione in MHC riguarda solo determinanti peptidici.

◦ Il linfocita B può legare tramite il BCR anche componenti non peptidiche.

◦ L'importante, per essere attivato dai T, è che internalizzino l'antigene intero (es.

◦ glicoproteina), lo processino (vengono generati dei peptidi) ed espongano in MHC-II i

vari peptidi.

Il linfocita T effettore è capace di riconoscere il complesso MHC-II+peptide, produce

◦ citochine attivando i linfociti B.

Gli anticorpi secreti avranno la specificità del BCR, non per forza ciò che finisce in MHC-

◦ II.

La presentazione in MHC-II crea l'occasione per coinvolgere il T, ma non è

necessariamente ciò che il B aveva riconosciuto sulla sua membrana con il BCR.

Natura dei determinanti antigenici

Determinanti riconosciuti dalle cellule B: possono essere sequenziali (creati dalla sequenza

primaria dei residui nel polimero: le unità sono vicine in sequenza) e/o conformazionali (creati

dalla struttura secondaria, terziaria o quaternaria della molecola: le unità sono vicine

spazialmente); riflette il fatto che le cellule B con le loro BCR non riconoscono prodotti di

digestione, ma molecole native. Si parla anche di epitopi B, che possono essere di qualunque

natura molecolare (non solo proteine).

Determinanti riconosciuti dalle cellule T: sono sequenziali, cioè creati dalla sequenza primaria

degli aminoacidi in una proteina (sono prodotti di digestione). Le cellule T non riconoscono

polisaccaridi o acidi nucleici. Questo è il motivo per cui i polisaccaridi sono in genere antigeni T-

indipendenti e le proteine antigeni T-dipendenti. Si parla anche di epitopi T, il TCR riconosce solo

molecole di natura proteica.

Le immunoglobuline (gammaglobuline)

Sono glicoproteine prodotte dalle plasmacellule (cellule B effettrici) in risposta ad un

• immunogeno.

Il termine immunoglobulina deriva dal fatto che quando siero contenente anticorpi viene

• fatto correre in un campo elettrico, gli anticorpi migrano con le proteine globulari (α1, α2 e

β globuline). Gli anticorpi sono gammaglobuline.

NOTA: sangue, siero e plasma

Il sangue presenta la componente liquida e quella cellulare.

• Il plasma è la componente liquida di un sangue reso non coagulabile (es. per aggiunta di

• EDTA, chelante del calcio necessario per alcune tappe della cascata della coagulazione).

Sono in esso contenute le proteine coinvolte nella cascata della coagulazione (es.

fibrinogeno, fattore IX, fattore XI...).

Il siero è la componente fluida di un sangue che coagula (non contiene le proteine della

• coagulazione, perché sono coinvolte nella formazione del coagulo).

1. Se si vuole vedere il contenuto di anticorpi, ad esempio per vedere se c'è una plasmacellula

tumorale che iperproduce anticorpi (es. mieloma multiplo): la corsa elettroforetica tra

plasma e siero è identica, si trovano proteine anticorpali in ambedue le situazioni.

2. Se invece si vuole vedere, per esempio, la funzionalità epatica in termini di sintesi di

proteine, si può valutare la velocità di coagulazione del sangue del soggetto (il parenchima

epatico produce le proteine della coagulazione). Si utilizzerà in questo caso il plasma e non

il siero.

Struttura di base delle immunoglobuline

Tutte le Ig hanno una struttura a 4 catene: due catene leggere identiche (25 kDa) e due

• catene pesanti identiche (50 kDa).

Le catene pesanti e leggere e le due catene pesanti sono tenute insieme da ponti

◦ disolfuro inter-catena. Il numero di legami disolfuro inter-catena varia tra le differenti

Ig. Facendo correre su gel in condizioni riducenti, i ponti disolfuro si rompono e si

▪ vedono due bande (una corrispondente ai 25 kDa e una ai 50).

All’interno di ciascuna catena polipeptidica sono presenti legami disolfuro intra-catena:

◦ due nella catena leggera e quattro nella catena pesante. Garantiscono il ripiegamento

corretto dei domini immunoglobulinici.

Ciascun legame disolfuro racchiude un ripiegamento ad ansa peptidico di 60-70 residui

◦ aminoacidici le cui sequenze sono molto omologhe. I ripiegamenti ad ansa sono la

porzione centrale di un domain di circa 110 aa. I ripiegamenti sono tipici del dominio

immunoglobulinico. Sono caratterizzati dall'avere questo preciso ripiegamento per via

di ponti disolfuro.

Le catene pesanti sono glicosilate a livello del dominio C .

• H2

4 ponti disolfuro nelle catene pesanti, 2 nelle catene leggere.

• 2 ponti disolfuro inter-catena tra le catene pesanti, un ponte disolfuro tra una catena

• pesante e una leggera, ed un altro tra l'altra catena pesante e l'altra catena leggera.

Due siti di legame per l'epitopo antigenico. Una molecola anticorpale lega due epitopi

• antigenici identici, perché le catene sono tutte identiche.

Il sito di legame per l'epitopo sulla molecola anticorpale si chiama idiotipo. A costruirlo

• concorrono sia la catena pesante che la catena leggera, e ce ne saranno due per ogni

molecola anticorpale.

È possibile identificare domini immunoglobulinici variabili (V) o costanti (C); V e C si

• H H

heavy chain, light chain.

riferiscono alla mentre V e C si riferiscono alla Il dominio variabile

L L

della catena leggera concorre con il dominio variabile della catena pesante per determinare

la conformazione dell'idiotipo.

Il massimo della flessibilità è nella regione cerniera. La distanza tra gli epitopi può non

• essere costante, quindi la molecola anticorpale può legare epitopi a distanza variabile

grazie al dominio cerniera.

I domini di 110 aa sono fra loro strutturalmente simili ma non identici (simile sequenza e simile

ripiegamento) e prendono il nome di domini immunoglobulinici. Molte altre proteine condividono

simili ripiegamenti così che si dice che appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline

(es. TCR ed MHC).

I domini variabili delle Ig

Nell'idiotipo si concentra il massimo della variabilità. Si è però visto che non tutto il dominio

variabile sia della catena pesante che della leggera è totalmente variabile. All'interno del dominio

variabile sono identificabili tre stretch amminoacidici in cui si concentra il massimo della variabiità

fra anticorpo e anticorpo.

Sull'ascissa si ha il numero di aa che compongono il dominio V, mentre in ordinata si ha un indice

di variabilità.

In tre regioni si concentra il massimo della variabilità, e sono dette regioni ipervariabili (HVR:

hypervariable). Sono anche identificate come CDR (complementary determining regions).

Presentano adiacenti regioni relativamente conservate regioni framework meno variabili, e ce ne

sono 4. Queste servono per disporre le regioni ipervariabili, che costituiranno il vero sito di legame

per l'epitopo (cioè l'idiotipo), opportunamente nello spazio. 9

Considerando tutto il repertorio anticorpale, ci sono più di 10 diversi siti di legame per l'antigene.

Dalla comparazione delle sequenze di molte differenti catene pesanti e di catene leggere, è emerso

che i domini di entrambe le catene possono essere distinti sulla base della variabilità della

sequenza amminoacidica.

Catena leggera: V (110 aa) e C (110 aa).

• L L

Catena pesante: V (110 aa) e C (330-440 aa).

• H H

In realtà nell’ambito delle regioni variabili il grosso delle differenze in termini di sequenza si

localizza in tre regioni cosiddette “ipervariabili”. Queste sono separate da regioni strutturali

conservate dette “framework”. Le regioni framework giocano un ruolo cruciale nella organizzazione

spaziale delle regioni ipervariabili a costituire il sito di legame per l’antigene.

Anticorpi con differenti specificità differiscono nella sequenza aminoacidica delle regioni variabili

delle catene pesanti e leggere. Le due catene pesanti sono identiche e le due catene leggere anche,

quindi i due siti di legame per l’antigene sono identici.

Interazioni tra un idiotipo ed un epitopo

I complessi antigene-anticorpo sono tenuti insieme da forze non covalenti, quindi il legame

dell'antigene da parte dell'anticorpo è reversibile.

Le forze che concorrono sono:

Forze elettrostatiche.

• Legami H.

• Forze di Van der Waals, fluttuazioni elettroniche casuali in una molecola generano un dipolo

• temporaneo, che influisce sull'altra molecola vicina e crea una polarizzazione indotta che

stabilizza la prima.

Forze idrofobiche.

Digestione degli anticorpi

Digestione con papaina:

• Taglia la molecola di Ig all'interno della regione cerniera, prima dei legami disolfuro

◦ inter-catena fra le due catene pesanti. (Fragment antigen binding)

Si formano due identici frammenti chiamati Fab

◦ comprendenti la catena leggera e i domini V e C della catena pesante. Ciascun

H H1

frammento Fab è monovalente (cioè può legare un singolo antigene). La specificità di

legame ad un particolare determinante antigenico è data dalla combinazione di V e V .

H L

(Fragment crystallizable)

Si forma un frammento Fc che contiene la restante parte delle

◦ catene pesanti (domini C e C ). È chiamato Fc perché cristallizza facilmente. Ha

H2 H3

funzione di effettore.

Digestione con pepsina:

• Taglia la catena pesante dopo i ponti disolfuro inter-catena producendo un frammento

◦ che contiene entrambi i siti di legame per l'antigene. Questo frammento, chiamato

F(ab') è divalente.

2

La regione Fc della molecola è digerita in piccoli peptidi, il taglio delle regioni costanti

◦ delle catene pesanti infatti avviene in più punti.

Questi prodotti sono meno interessanti rispetto a quelli ottenuti con la digestione da

◦ papaina per quanto

riguarda la funzione.

La specificità di legame per l'antigene

del frammento Fab e F(ab') è

2

esattamente la stessa dell'intera

molecola. L'apostrofo (') sta ad

indicare che F(ab') è più grande di 2

2

Fab.

La funzione effettrice di Fc consiste

nell'essere riconosciuta dai recettori

specifici dei macrofagi, essere

riconosciuta dalle cellule NK (ricorda il

sistema di eliminazione ADCC).

Le classi immunoglobuliniche

Le Ig possono essere divise in 5 classi differenti sulla base di differenze nella sequenza

amminoacidica a livello della regione costante delle catene pesanti. Tutte le Ig all'interno di una

data classe avranno, fra loro, regioni costanti della catena pesante molto simili.

Classi: Catena pesante di tipo γ: IgG

• Catena pesante di tipo µ: IgM

• Catena pesante di tipo α: IgA

• Catena pesante di tipo δ: IgD

• Catena pesante di tipo ε: IgE

Le catene leggere possono essere di tipo kappa (k) e lambda (λ). Non si conosce la differenza di

funzione tra le due catene.

Sottoclassi immunoglobuliniche

Piccole differenze nella sequenza aminoacidica della regione costante delle catene pesanti fanno sì

che le classi IgG e IgA siano divise ulteriormente in sottoclassi:

Sottoclassi delle IgG:

IgG1 - catena pesante di tipo γ1

• IgG2 - catena pesante di tipo γ2

• IgG3 - catena pesante di tipo γ3

• IgG4 - catena pesante di tipo γ4

Sottoclassi delle IgA:

IgA1 – catena pesante di tipo α1

• IgA2 – catena pesante di tipo α2

IgG Peso molecolare 146 kDa.

• Sono anticorpi monomerici (coefficiente

• di sedimentazione: 7s).

Sono le Ig più abbondanti nel siero (75% del pool totale Ig).

• Sono le più abbondanti negli spazi extravascolari.

• Sono gli anticorpi principali nelle risposte immunitarie secondarie.

• Le risposte immunitarie secondarie sono le risposte immunitarie adattative (possono

coinvolgere sia i linfociti B che T) che si sviluppano ad ogni incontro con l'antigene

successivo al primo.

Sono gli unici anticorpi capaci di attraversare la placenta.

• Fissano (attivano) il complemento: tramite la via classica.

• Si legano a cellule: macrofagi, monociti, polimorfonucleati (PMN) e cellule NK hanno

• recettori per la porzione Fc delle IgG.

La conseguenza è che PMN, monociti e macrofagi, possono internalizzare l’antigene meglio.

Il termine opsonina indica una molecola che facilita (aumenta) la fagocitosi. Le IgG sono

ottime opsonine.

La via classica del complemento

L’iniziatore della via classica del complemento è il complesso C1 costituito dalle proteine C1q, C1r

e C1s. C1q è formato da 6 proteine tutte uguali con teste globulari.

C1 è attivato dagli anticorpi delle classi IgG ed IgM.

• Il legame di C1q agli anticorpi avviene sul dominio C .

• H2

Il legame di due delle teste C1q a due porzioni costanti di anticorpi IgG o IgM, attiva C1r a

• tagliare ed attivare C1s. C1s può svolgere attività proteolitica.

Due molecole di IgG possono avviare la via classica del complemento, ma devono trovarsi

• vicine (quindi, magari legate ad antigeni sulla membrana di un batterio).

C1s ha fondamentalmente due bersagli di proteolisi:

1. C4, tagliato in C4a e C4b

2. C2, tagliato in C2a e C2b

C4b e C2b si combinano a formare un complesso C4b2b. Questo complesso viene a costituire

quella che è la C3 convertasi della via classica.

C3b2b e C3bBb sono le C3 convertasi che si formano rispettivamente con la via classica e la via

alternativa. Le C3 convertasi possono unirsi al prodotto della loro attività, C3b, diventando

entrambe C5 convertasi. C4b2b3b e (C3b) Bb sono C5 convertasi.

2

C5 viene scisso dalla C5 convertasi in C5a e C5b.

Ricordiamo quali sono le funzioni di C5a:

Anafilotossina: aumenta la permeabilità vascolare

• agendo direttamente sull'endotelio, del quale

aumenta l'adesività (induzione di molecole di

selectina).

Induzione della degranulazione delle mast-cells.

• L'istamina rilasciata è un potente vasodilatante e

vasopermeante.

Azione chemiotattica nei confronti dei leucociti.

• Attivazione dei neutrofili (stimolazione del burst

• respiratorio).

C5b si combina con C6, C7, C8 e una serie di molecole C9 a

livello della membrana dei batteri formando il complesso

di attacco alla membrana, il MAC.

Considerazioni:

I recettori per la porzione Fc e per il complemento (C3b) agiscono in modo sinergico per

• rendere molto efficace la fagocitosi di batteri ed altri organismi.

Il componente C3b e le IgG sono dunque delle opsonine.

• Gli anticorpi possono attivare il complemento ma il complemento può essere attivato senza

• anticorpi (via alternativa). Questo è essenziale perché l'attivazione attraverso la via

alternativa permette che il complemento si attivi in tempi rapidi.

IgM Sono pentameriche (19S).

• Presentano un polipeptide aggiuntivo, la catena J, che

• serve per la polimerizzazione dei monomeri in

pentamero.

Rispetto alla struttura base di un anticorpo, c'è un

• dominio costante extra per le catene pesanti. Questo si

chiama C . La catena µ è dunque dotata di un dominio

H4

extra.

Il peso molecolare è intorno ai 970 kDa.

• La forma pentamerica è quella solubile: infatti, le IgM

• secrete sono in forma pentamerica.

Sulla membrana plasmatica delle cellule B naϊve sono invece in forma monomerica.

• IgM della forma monomerica, insieme alle IgD (in minor misura), costituiscono il tipo di

• classe anticorpale dei BCR delle cellule B naϊve. La maggior parte delle cellule B mature ma

naϊve co-esprime sia IgM che IgD.

Proprietà delle IgM

È la terza Ig più comune nel siero (forma pentamerica).

• È il primo tipo di Ig prodotto dal neonato e la prima Ig prodotta dalle cellule B quando

• vengono stimolate da un antigene (risposta immunitaria primaria).

Hanno un extra domain (C ) immunoglobulinico.

• H4

In conseguenza alla struttura pentamerica, fissano molto bene il complemento (lo attivano

• molto meglio delle IgG, che invece devono legare in coppia determinanti antigenici

spazialmente vicini; le IgM sono pentameriche e già soddisfano questa esigenza: il legame

di C1q è possibile).

Nella forma monomerica, sono presenti insieme alle IgD sulla superficie dei linfociti B naϊve

• in qualità di recettori.

Affinità ed avidità degli anticorpi

La forza di interazione fra un singolo sito di legame per l’antigene sull’anticorpo ed il suo specifico

antigene è chiamata affinità di legame dell’anticorpo.

Negli anticorpi polivalenti (es. IgM) anche se l’affinità a livello di ciascun sito rimane

• invariata, la forza totale di legame all’antigene (definita come avidità) è molto più alta.

Una molecola di IgM a bassa affinità può legare con molta forza un antigene multivalente

• poiché più interazioni a bassa affinità possono contribuire a dare una singola interazione ad

alta avidità.

Le IgM potenzialmente presentano 10 siti di legame. È però difficile pensare che tutti i 10 gli

• idiotipi siano coinvolti nel legame all'antigene, anche se per come è strutturata e per la

planare sgabello

flessibilità che la molecola possiede, la IgM può disporsi in modo o a in

modo tale da legare quanti più epitopi è possibile.

IgA Seconda classe più abbondante nel siero

• (15.20% del pool immunoglobulinico

totale), dove sono presenti in forma

monomerica (più dell'80%).

Esistono anche in forma dimerica (PM del dimero di circa 385 kDa) nelle secrezioni come il

• latte materno.

Sono le Ig predominanti nelle secrezioni quali saliva, secrezioni tracheo-branchiali, colostro,

• latte e secrezioni genito-urinarie. Si trovano anche a livello dell'intestino. Vengono prodotte

dai linfociti B dei MALT.

Il bambino che beve latte materno ha una protezione a livello del tratto gastro-enterico:

bambini allattati al seno sono molto meno soggetti, nei primi anni, a gastro-enteriti.

La conformazione del dimero (11S) è possibile grazie a due polipeptidi aggiuntivi:

• Catena J (necessaria per l'unione delle 2 subunità).

◦ Componente secretoria (per la stabilità del dimero, per la protezione delle IgA dalla

◦ proteolisi).

Le IgA vengono prodotte anche a livello intestinale: sarebbe inutile produrre

▪ anticorpi digeriti nella sede stessa di produzione.

Numerosi batteri hanno sviluppato di produrre IgA-proteasi: enzimi che a dispetto

▪ di questo sistema protettivo riescono a digerire le IgA.

Prodotte a livello dei MALT (parliamo ad esempio del GALT), si trovano a dover attraversare

l'epitelio che fa da barriera per giungere al lume intestinale, ad esempio.

Il processo di trasporto dal tessuto linfoide sottostante l'epitelio al lume avviene per transcitosi.

Avevamo già detto che la transcitosi è un trasporto intracellulare molto ben sviluppato nelle cellule

polarizzate, che ha di peculiare rispetto ad endocitosi e fagocitosi il fatto che il cargo di trasporto

delle vescicole non viene degradato.

Le molecole IgA si legano ad un recettore per le IgA sul dominio basolaterale delle cellule

• epiteliali.

Si forma una vescicola di internalizazzione di transcitosi.

• L'esocitosi avviene in corrispondenza del dominio apicale.

• Le IgA rimangono attaccate ad un pezzo del recettore: nelle vescicole era presente un

• enzima proteolitico che taglia il recettore in due parti.


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6 mesi fa


DESCRIZIONE APPUNTO

Questi appunti trattano di immunità innata e acquisita, selezione clonale, malattie autoimmuni, organi linfoidi con immagini e mi hanno permesso di passare l'esame con il punteggio di 29/30 e sono basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. De Bernard dell’università degli Studi di Padova - Unipd. Scarica il file in formato PDF!
Immunologia, malattie autoimmuni, timo, linfonodi, anticorpi, ricombinazione vdj.


DETTAGLI
Esame: Immunologia
Corso di laurea: Corso di laurea in biologia
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Dottoreincallito di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof De Bernard Marina.

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