Genetica: regolazione genica negli eucarioti

LIVELLI DI CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE DEI GENI

Sistono due tipi di geni:

• Geni Housekeeping espressi in modo costitutivo, funzioni fondamentali (per esempio ribosomiali, cruciali per il metabolismo)
• Geni per tessuto/stadi specifici (espressi nel differenziamento cellulare)

Esistono vari livelli per controllare l'espressione genica del DNA: regolazione della sua trascrizione, post trascrizione, della sua traduzione, della degradazione evita del mRNA, della degradazione delle proteine stesse già formate.

Per arrivare a queste conoscenze, si partirà dalle prime evidenze sperimentali sull'esistenza di meccanismi di controllo dell'espressione genica (negli eucarioti):

• Espressione dei geni globinici. Ovvero la sintesi delle globine alfa e beta, cambia durante lo sviluppo (fetale e adulto, cambiano le caratteristiche). La presenza di queste proteine variava durante lo sviluppo. Suggerimento che l'espressione dei geni potesse essere regolata.
• Puffs

(regioni di decondensazione) dei cromosomi politenici (i cromosomi politenici sono contenuti all'interno di Drosophila, ovvero il moscerino della frutta, e di numerosi altri insetti). (attiva trascrizione regolata).

Durante le varie fasi dello sviluppo larvale (Drosophila) possono essere presenti. Indica che l'espressione genica può variare nel tempo e nello spazio. Ci deve essere un controllo che regolava la manifestazione.

ORGANIZZAZIONE DELLA CROMATINA PER L'ESPRESSIONE DEI GENI

Modificazioni epigenetiche

• Metilazione del DNA
• Modificazione istoniche
• Rimodellamento della cromatina (complessi macchinari multiproteici, spostano o eliminano nucleosomi)
• RNA che modificano la struttura cromatina (scoperti negli ultimi anni, RNA non codificanti)

Nucleosoma: unità base della cromatina, ottamero di proteine basiche, istoni, H2A, H2B, H3, H4 intorno al quale si avvolgono 146 coppe di basi. Su vari livelli.

1 livello "collana di perle", questa struttura va

incontro a ulteriori avvolgimenti, forma altri livelli di organizzazione superiori. Fino ad arrivare al cromatide, massimo livello di condensazione. DNA DELLA CROMATINA CONDENSATA NON è ACCESSIBILE. È funzionalmente inattiva. La trascrizione non può avvenire.

Le code istoniche N-terminali sono soggette a varie modificazioni. Vengono acetilate, e la cromatina si modifica in modo che il DNA si possa "aprire" e possa essere accessibile ai legami con fattori di trascrizione (favorisce la trascrizione). Importanti sono gli enzimi per acetilare o metilare. Acetil-transferasi (HAT) è necessario per l'acetilazione. Istone de-acetilasi (HDAC) è l'enzima che toglie l'acetilazione. Quindi esistono "enzimi che mettono e enzimi che tolgono".

ACETILAZIONE = attivazione trascrizionale
METILAZIONE = repressione trascrizionale

CONTROLLO A LIVELLO TRASCRIZIONALE
Meccanismi simili a quelli dei procarioti:
- proteine regolative si legano a sequenze cis-regolative dei geni

Negli anni 80

Indentificati fattori di trascrizione basali:

• Fattori di trascrizione generali (basali)
• Fattori di trascrizione gene-specifici

MAPPATURA ELEMENTI PROMOTORE: saggi di espressione di geni reporter

Ovvero "reporter" è un gene la cui attività è rilevabile molto facilmente (per esempio colorazione o metodi immunologici), per esempio luminescenza (beta-gal, luciferasi).

Utilizzati per misurare efficienza di espressione in colture contenenti elementi regolativi inseriti in cellule in coltura.

SAGGIO "GEL MOBILITY SHIFT"

Esperimento che permette di rilevare il legame tra una sequenza di DNA e una proteina.

Teoria e pratica del saggio:

• Effettuato in gel (elettroforesi). Il DNA a cui è legata una determinata proteina migra più lentamente su un gel di poliacrilamide non denaturante.
• Questo saggio suggerisce che una sequenza di DNA lega una o più proteine. Dimostrata interazione tra sequenze specifiche di DNA che legano proteine.

particolari.MAPPATURE DEGLI ELEMENTI DEL “CORE” DEL PROMOTORE (sequenze sopracitate in questoappunto)- Una delle più note è la TATA BOX importante per il legame con i fattori di trascrizione,macchinari multiproteici.

IMMUNOPRECIPITAZIONE DI CROMATINA (ChIP)

L’obbiettivo è scoprire quale sono le sequenze di cromatina specifiche.Il procedimento consiste:

1. Frammentare la cromatina e ottenere frammenti di essa.
2. Trattamento con UV, che forma legami covalenti, in modo che le proteine si possano legarestabilmente.
3. “si ottengono vari pezzetti di DNA legati alle varie proteine”
4. Si fanno interagire con anticorpi molto specifici per le proteine sopracitate.
5. In seguito, si separa il DNA dalle proteine.
6. Si identificano le sequenze.

FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI (BASALI)RNA POLIMERASI II non riconosce direttamente il promotore.Occorre per l’assemblaggio del complesso di inizio: