Genetica II

Genetica III

Processi di sequenziamento e mappatura del DNA

I processi di sequenziamento e mappatura del DNA hanno permesso di capire che il genoma non solo comprende, oltre al DNA con definizione classica di gene, un’ampissima parte di elementi conservati di cui non sempre è chiara la funzione. Il 50% del genoma umano è formato da elementi trasponibili ormai fossili (ovvero fissi). Se confrontato con altri organismi, il numero di geni nell’essere umano risulta abbastanza basso, ciò va ad indicare che la complessità dell’organismo non è direttamente proporzionale alla quantità di geni presenti ma sono le sequenze regolative e gli elementi regolatori di questi a fare la differenza.

Ad esempio, ⅔ dei geni codificanti hanno geni ortologhi (ovvero geni omologhi presenti in specie diverse che codificano per strutture e funzioni simili) come per il caso del gene Pax6 necessario e sufficiente per il corretto sviluppo dell’occhio: una sua mutazione causa cecità nel topo e aniridia nell’uomo.

Approccio genico

L’approccio genico inteso come sequenziamento e analisi di interi genomi permette di studiare:

• Il linkage analysis: ovvero la concatenazione dei geni e la loro locazione sul cromosoma
• L'incrocio di geni con relativa produzione di alberi genealogici
• Ottenere il sequenziamento del genoma

Importanza delle sequenze regolative

Se confrontando genomi diversi trovo delle sequenze non codificanti altamente conservate (ovvero presenti nei diversi genomi) vorrà dire che quelle sequenze avranno una certa importanza nella regolazione di un gene, cosa che ha permesso una pressione selettiva (ovvero una continua conservazione della sequenza nel corso del tempo). Mettendo a paragone i genomi delle diverse specie si trovano dei segmenti allineati tra loro detti zone ultra-conservate di enorme importanza a livello regolativo.

Per capire se una data regione è effettivamente un enhancer faccio un costrutto in cui inserisco:

• Un gene la cui attività può essere osservata (es. Lac Z)
• Un promotore minimo per avere una trascrizione del gene (TATA BOX)
• La sequenza che voglio testare inserita a monte del promotore

Se la sequenza è un enhancer andrà a stimolare l’attività trascrizionale del promotore minimo.

Un altro metodo per controllare se una sequenza è una sequenza regolativa è utilizzare la DNasi1 nel test di ipersensibilità: la DNasi1 è un enzima processivo (ovvero senza specificità) che digerisce il DNA, questo messo insieme alla cromatina intatta (ovvero non trattata) in concentrazioni molto basse e in periodi poco prolungati andrà a tagliare il DNA nelle sue regioni più accessibili ovvero quelle più aperte (che probabilmente sono regioni regolative). Se una regione è altamente conservata ed si trova in una zona aperta della cromatina sarà verosimilmente un enhancer. Gli enhancer (chiamati anche intensificatori) sono sequenze di DNA che svolgono il loro ruolo pro-trascrizione attraverso l'associazione con diverse proteine.

Mutazioni

Le mutazioni sono modificazioni che alterano la sequenza del DNA, rappresentano un evento molto raro e possono essere classificate in base a varie caratteristiche. Una mutazione è il processo mediante il quale la sequenza di coppie di basi in una molecola di DNA viene alterata. Le mutazioni sono dette genomiche quando alterano il numero di cromosomi (es. trisomie), cromosomiche quando alterano la struttura dei singoli cromosomi e geniche quando alterano la funzione dei singoli geni. Se una mutazione avviene all’interno di una cellula somatica viene detta mutazione somatica e si manifesta solo nell’individuo, quando la mutazione avviene a livello delle cellule germinali è detta mutazione germinale e può essere trasmessa alla progenie.

Definiamo tasso di mutazione la probabilità che si verifichi una specifica mutazione in un tempo dato (es. mutazioni per ogni gene per generazione) mentre la frequenza di mutazione rappresenta il numero di casi di una particolare mutazione (es. mutazione per tot individui). Se una mutazione avviene durante lo sviluppo è importante ricordare che tanto prima questa si verifica tanto più andrà ad interessare un numero maggiore di cellule, un esempio è dato dall’eterocromia dell’iride: se la mutazione si verifica in stadio precoce avrò l’iride con una chiazza di colore alterata più ampia.

Una mutazione può essere costitutiva, se si verifica sempre in qualsiasi situazione, o condizionale se si verifica in particolari condizioni. Esempio di mutazione condizionale: mutazione termosensibile della tirosinasi nel gatto siamese. Si ha una mutazione che impedisce il corretto ripiegamento della tirosinasi coinvolta nella produzione di melanina, tuttavia questa proteina risulta funzionale nei punti del corpo più freddi perché in condizioni di temperature più basse la proteina riesce a ripiegarsi correttamente: questo rappresenta una condizione di parziale albinismo nel gatto che alle estremità del corpo presenta colorazione scura grazie alla presenza di melanina.

Per capire se la mutazione fosse un processo adattativo o causale venne fatto un saggio di resistenza al fago T1 in laboratorio: mettendo in coltura su diverse piastre dei batteri di una stessa colonia e sottoponendole ad uguale esposizione ad antibiotico vado a vedere se il numero di batteri antibiotico-resistenti risulta uguale o con proporzioni differenti. Se fosse un processo adattativo mi aspetterei di riscontrare uguali proporzioni di cellule resistenti nelle varie piastre, tuttavia il numero di cellule resistenti non risulta uguale: ciò dipende dal fatto che avrò un numero superiore di batteri ancora vivi nelle piastre dove la mutazione si è verificati in un momento precoce (passando così alle cellule clonate) mentre nelle piastre con scarsa presenza di mutanti si sarà verificata una mutazione tardiva circoscritta a pochi batteri.

Mutazioni puntiformi

Le mutazioni puntiformi sono quelle mutazioni che interessano una sola coppia di basi e a seconda di dove si verificano (se nella regione codificante o meno) possono influenzare il fenotipo, risultano la maggior fonte di variabilità genica in una specie. Le mutazioni puntiformi possono avvenire per:

• Transizione: sostituzione di una coppia di basi con una coppia con ordine simile ovvero purina-pirimidina A-T sostituita con purina-pirimidina G-C
• Transversione: sostituzione di una coppia di basi con una coppia ad ordine opposto ovvero purina-pirimidina con pirimidina-purina

A seconda dell’effetto che causa la sostituzione della coppia di basi otterrò delle:

• Mutazioni missenso: ottengo un cambiamento del codone nell’mRNA con inserimento di un diverso amminoacido (varie conseguenze)
• Mutazione nonsenso: ottengo un cambiamento del codone nell’mRNA in codone STOP con terminazione prematura del trascritto e formazione di proteina tronca
• Mutazione neutra: ottengo una sostituzione del codone nell’mRNA ma non ho alterazione nella proteina prodotta (equivalenza chimica del prodotto)
• Mutazione silente: ottengo un codone differente che codifica per lo stesso amminoacido (alterazione della terza posizione) con produzione della proteina Wild Type. Questa alterazione porta alla degenerazione progressiva del codice genetico

Le mutazioni puntiformi possono anche aggiungere o eliminare basi generando una mutazione detta frameshift ovvero alterando l’ordine di lettura del mRNA, spesso questa mutazione porta alla produzione di prodotti non funzionali o tronchi. Le mutazioni in base all’effetto sul fenotipo vengono dette “mutazioni in avanti” se cambiano il fenotipo da wild type a mutante oppure “mutazione per reversione” se avvengono nello stesso sito di una prima mutazione ripristinando il fenotipo da mutante a wild type. La reversione è detta parziale se non ho il prodotto wild type originale ma il prodotto risulta in grado di ripristinare parzialmente la funzione originale.

La mutazione di tipo soppressore è simile alla reversione a livello fenotipico ma non avviene nello stesso sito della prima mutazione, si ha quindi una seconda mutazione che scherma o compensa la prima riducendone/eliminando l’effetto mutato. Geni che causano la soppressione di una mutazione in altri geni vengono detti geni soppressori, nel caso di mutazioni nonsenso ho dei geni soppressori codificanti per il tRNA che, mutato, non riconosce un codone di stop ma inserisce un amminoacido continuando la trascrizione permettendo, a volte, di ripristinare parzialmente il fenotipo originale.

A livello pratico, se in una catena metabolica ho una mutazione loss of function in un gene che codifica per un enzima, la problematica potrà essere evitata con una mutazione gain of function di un gene successivo che aumenta l’efficacia di un secondo enzima a valle ripristinando l’equilibrio.

Mutazioni spontanee

Le mutazioni spontanee sono date da errori nella replicazione (dalla mancata correzione di errori dopo la replicazione o da errori di allineamento), da alterazioni chimiche spontanee (deamminazione della citosina che diventa uracile, tautomerizzazione delle basi), dallo spostamento scorretto di elementi trasponibili o dalla scorretta lettura di sequenze ripetute. Un esempio di mutazioni date da sequenze ripetute: malattie neurologiche a insorgenza tardiva.

L’accumulo di sequenze ripetute (espansione delle triplette) aumenta con il progressivo passare delle generazioni portando ad una sempre maggiore possibilità di errore da parte della polimerasi. Questo porta allo sviluppo della malattia in età tardiva quando il numero di ripetizioni si alza. Dato che non c’è una selezione, l’accumulo viene trasmesso alla generazione successiva e oltre un certo numero di ripetizioni si ha un’insorgenza della malattia in età precoce: fenomeno dell’anticipazione.

Esempio: sindrome della X-fragile. L’espansione della tripletta CGG in posizione 5’-UTR del gene FMR1 porta alla costrizione del cromosoma X con conseguente rottura nel frammento dove avviene la costrizione (espansione CGG>200) con metilazione del promotore e silenziamento del gene con conseguenze neurologiche. In condizione di espansione intermedia (55<CGG<200) ho una produzione maggiore mRNA ma una produzione minore di proteina (l’mRNA non risulta tradotto bene e quindi viene prodotto di più). Le femmine risultano portatrici e non malate perché sono mosaiche per l’inattivazione di X: le cellule che mantengono attivo l’X mutato di origine materna vengono selezionate negativamente perciò il fenotipo risulta meno grave.

Mutazioni indotte

Le mutazioni possono avvenire anche in modo indotto quando un organismo è esposto ad un agente chimico o fisico (mutageno) che ne altera il DNA.

• Radiazioni: di fonti naturali (es. raggi cosmici, radon) o artificiali (raggi X)
  • Esempio di danni per raggi UV: i raggi UV portano alla formazione anomala di legami chimici tra una pirimidina con le molecole ad essa adiacenti nello stesso filamento di DNA con conseguente formazione di dimeri di timina che portano ad un rigonfiamento del DNA che disturba il normale accoppiamento delle basi: la replicazione non può procedere oltre la lesione.
  • Esempio 2: radiazioni ionizzanti: penetrano nei tessuti provocando la rottura covalente dei legami nello scheletro zucchero-fosfato del DNA (causa delle mutazioni cromosomiche umane).
• Mutageni chimici:
  • Possono essere analoghi di base: sono simili alle basi e vengono inseriti al loro posto creando misaccoppiamenti e blocco della replicazione.
  • Agenti intercalanti: si inseriscono momentaneamente tra le basi adiacenti causando l’errato inserimento di una base nel nuovo filamento. Una volta eliminati lasciano un vuoto/una base in più su uno dei due filamenti creando disallineamento (mutazione per inserzione errata di base).

Ricorda sempre che gli esiti delle diverse mutazioni sono indistinguibili quindi, a posteriori, io non posso sapere che tipo di mutazione si è verificata con certezza. Queste sostanze che portano all’insorgere di una mutazione vengono dette sostanze mutagene e possono essere trovate in modo poco costoso con il test di Ames (analisi indiretta dei mutageni).

Test di Ames

Il test di Ames studia la capacità delle sostanze chimiche di revertire ceppi mutanti del batterio Salmonella t. al wild type. Dato un ceppo auxotrofo per l’istidina (ovvero incapace di procurarsi l’istidina da solo) vado a verificare se, tramite reversione, ho ottenuto un ripristino della capacità selvatica di sintetizzare l’istidina in modo autonomo. Devo inserire in coltura anche degli enzimi epatici perché tante sostanze risultano mutageni solo se metabolizzate. Dato che, comunque, anche in assenza di sostanze presunte mutagene ho una percentuale di reversione spontanea, per analizzare i dati devo costruire una curva dose-risposta che mi dica a che soglia la sostanza risulta tossica. Quando, una volta introdotta la sostanza, trovo ugualmente pochi revertenti avrò una risposta negativa perché questi corrispondono al tasso di reversione spontanea.

Fortunatamente i sistemi di riparazione del DNA abbassano le probabilità di mutazione andando a riparare il danno, tuttavia sono metodi dalle tempistiche lunghe perché devono prima riconoscere il sito mutato. Come è stato scoperto? Andando ad analizzare i fibroblasti di pazienti affetti da Xeroderma pigmentoso (malattia in cui sono incapaci di riparare i danni da raggi UV). Fondendo tra loro fibroblasti malati potevo ottenere la riparazione del danno: la mutazione era quindi avvenuta in geni differenti e si verificava la complementazione.

Ripasso sulla riparazione del DNA

Quando solo uno dei due filamenti di un cromosoma presenta un difetto, l'altro filamento può essere usato come stampo per guidare la correzione del filamento danneggiato. Questi meccanismi sono:

1. Reversione diretta del danno mediante vari meccanismi specializzati. Esempi sono la metilguanina metil transferasi (MGMT) che rimuove specificamente gruppi metilici dalla guanina. Nessun filamento-stampo è richiesto per questo tipo di riparo.
2. Meccanismi di riparazione per escissione, che rimuovono il nucleotide danneggiato sostituendolo con un nucleotide non danneggiato. Questi comprendono:
   • Riparazione per escissione di base (Base Excision Repair, o BER) che ripara il danno che coinvolge un singolo nucleotide; il meccanismo enzimatico parte dall'attivazione di una DNA-glicosilasi che riconosce la base alterata e rompe il legame N-glicosidico.
   • Riparazione per escissione di nucleotidi (Nucleotide Excision Repair, o NER), che ripara un danno che coinvolge filamenti lunghi da 2 a 30 nucleotidi. Questi includono danni da voluminosa distorsione dell'elica, quali i dimeri di timina causati da luce UV, che provocano mutazioni di un singolo filamento. La sequenza enzimatica è: l’elicasi srotola l'elica, endonucleasi tagliano ed eliminano l'oligonucleotide contenente il danno, DNA-polimerasi sintetizza nuovamente il DNA nel sito del danno, DNA-ligasi che "ricuce" il filamento riparato.
3. Mismatch Repair (MMR), che corregge errori di replicazione e di ricombinazione genetica che determinano la formazione di nucleotidi male appaiati in seguito alla replicazione del DNA. Gli enzimi coinvolti e studiati in E. Coli sono: MutS, che riconosce il mismatch e vi si lega; MutL, attivato dal complesso DNA-MutS, che attiva a sua volta MutH, che insieme ad una endonucleasi taglia il frammento contenente il mismatch, dopo che la elicasi ha aperto la doppia elica, così che la DNA-polimerasi possa aggiungere il frammento opportuno e la ligasi unire gli estremi dei due filamenti. I corrispettivi umani di tali enzimi sono: MSH6 e MSH2 (per MutS); MLH1 e PMS2 (per MutL).

Elementi trasponibili

Gli elementi trasponibili sono quegli elementi che sono in grado di cambiare posizione all’interno del genoma inducendo lo sviluppo di mutazioni geniche complesse e dando un contributo all’evoluzione del genoma stesso. La maggior parte delle mutazioni che avvengono sono a carico delle sequenze regolative e fattori trascrizionali. I trasposoni sono presenti sia in eucarioti che procarioti e potendo spostarsi da cromosoma a cromosoma e da cromosoma a plastide permettono il trasferimento orizzontale tra elementi. I trasposoni che non sono più attivi sono detti trasposoni fossili, non possono spostarsi e sono responsabili di fenotipi come quello rugoso del seme di pisello o della variegazione del colore nei fiori.

Esempio di pisello rugoso: il trasposone si è fissato nel gene responsabile dell’immagazzinamento dell’amido. Questo gene non più funzionale non permette al seme di modificare gli zuccheri semplici in amido, perciò in presenza di acqua il seme si gonfia tantissimo per poi seccare e dare l’effetto rugoso una volta evaporata.

La loro scoperta avvenne grazie a fenotipi non spiegabili dalla genetica classica come nel caso della colorazione a macchie delle cariossidi del mais (scoperta per evidenza indiretta della presenza di trasposoni) o alla resistenza multipla agli antibiotici nei batteri.

Come venne scoperto il trasposone batterico? Con lo studio della resistenza multipla agli antibiotici. L’insorgenza della resistenza all’antibiotico è un evento con frequenza molto bassa perciò la presenza di una resistenza multipla non poteva essere spiegata con la genetica classica. Questo tipo di resistenza è data dall’inserzione di plasmidi trasferitisi da batteri resistenti per un dato antibiotico in un batterio resistente per un altro.

Come: i trasposoni tagliano il DNA come fossero enzimi di restrizione, si inseriscono in modo sfalsato e richiamano la polimerasi per riparare il danno formando le tipi ripetizioni ai lati del trasposone. Nel momento in cui il trasposone viene poi exciso rimangono le caratteristiche ripetizioni che permettono di ricostruire le trasposizioni avvenute.

Esperimento: incrociando tra loro due linee pure pigmentate, tutte le cariossidi del mais presentavano macchie viola di diverse dimensioni. Con l’analisi del DNA si è scoperto che...