Genetica ed Embriologia

Embriologia: dai gameti alla blastocisti

I gameti e la loro origine

I gameti derivano dalle cellule staminali primordiali, che si formano nell’epiblasto nella seconda settimana e che migrano verso la parete del sacco vitellino, mentre dalla quarta settimana migrano dal sacco vitellino alle future gonadi, giungendovi alla fine della quarta settimana.

Oogenesi

Giunte nelle gonadi di un individuo geneticamente femmina, esse si differenziano in oogoni, che dopo divisioni meiotiche alla fine del terzo mese si presentano in isolotti circondati da cellule follicolari piatte. La maggioranza continua a dividersi per mitosi (fino al quinto mese, circa 7 milioni), mentre alcuni si arrestano nella profase della prima divisione meiotica e formano gli oociti primari. Gli oociti primari, insieme allo strato di cellule epiteliali piatte che lo circonda, è detto follicolo primordiale. In seguito al raggiungimento dei 7 milioni, poi numerosi vanno in atresia. In pubertà, ogni mese, 15-20 follicoli vengono selezionati per iniziare a maturare attraverso 3 stadi:

• Primario o preantrale
• Secondario, antrale (o di Graaf); il più lungo
• Preovulatorio; 37 ore prima dell’ovulazione

Fasi del follicolo

1- Follicolo primitivo: l’oocita inizia ad aumentare di volume e le cellule follicolari intorno diventano da piatte a cubiche, dando origine a un epitelio stratificato di cellule della granulosa. Queste cellule della granulosa sono circondate da una teca, detta appunto teca del follicolo, che si divide in teca interna (secretoria) e in teca esterna (fibrosa). Le cellule della granulosa secernono anche uno strato di glicoproteine sulla superficie dell’oocita, la zona pellucida.

2- Follicolo secondario o di Graaf: con il progredire dello sviluppo, tra le cellule della granulosa compaiono spazi pieni di fluido che confluiscono inizialmente in un antro semilunare, che col tempo si ingrandisce portando il follicolo secondario a una grandezza complessiva di 25 mm. Le cellule della granulosa che circondano l’oocita permangono e formano il cumulo ooforo. Permangono anche teca interna (secernente steroidi) e teca esterna.

3- Preovulatorio: un’ondata di ormone luteinizzante (LH) stimola la crescita preovulatoria e permette il completamento della prima meiosi, ottenendo un oocita secondario e un globulo polare (localizzato tra la zona pellucida e la membrana cellulare dell’oocita secondario). La cellula entra nella seconda divisione meiotica ma si arresta in metafase: la completa solo se fecondato.

Ciclo ovarico

In pubertà, la donna inizia ad avere regolarmente cicli mestruali mensili, i quali sono controllati dall’ipotalamo che secerne l’ormone rilasciante la gonadotropina (GnRH), che stimola le cellule dell’ipofisi anteriore a secernere le gonadotropine: l’ormone follicolo stimolante (FSH) e luteinizzante (LH). Da un oocita bloccato in metafase II nel frattempo sulla superficie dell’ovaio compare uno stigma, rigonfiamento avascolarizzato. LH aumenta la produzione di:

• Collagenasi
• Prostaglandine, che causano la contrazione

Così l’oocita viene liberato sulla superficie ovarica: alcune cellule del cumulo ooforo si riarrangiano intorno alla zona pellucida e formano la corona radiata. Le cellule della granulosa rimaste nella parete del follicolo insieme alle cellule della teca interna vengono raggiunte da vasi e, diventando poliedriche, sotto l’effetto di LH si trasformano nel corpo luteo, che secerne il progesterone, che stimola la mucosa uterina ad entrare in fase secretoria, in preparazione all’impianto. Se non avviene la fecondazione, il corpo luteo diminuisce di volume e si trasforma in una masserella di tessuto cicatriziale, il corpo albicante; se invece la fecondazione avviene, il corpo luteo si trasforma in corpo luteo gravidico per effetto di gonadotropina corionica, continuando a secernere progesterone fino alla fine del quarto mese, dopo il quale regredisce.

Spermatogenesi

Alla nascita, le cellule germinali maschili sono circondate da cellule di sostegno che diventano poi cellule del Sertoli. Poco prima della pubertà, nei cordoni sessuali si sviluppa un lume e diventano tubuli seminiferi e contemporaneamente le cellule germinali primordiali danno origine agli spermatogoni staminali:

• Spermatogoni di tipo A, limitate divisioni mitotiche, l’ultima produce gli
• Spermatogoni di tipo B, che poi si dividono e formano gli
• Spermatociti primari, che stanno in profase 22 giorni, completano meiosi I e formano
• Spermatociti secondari, che in seguito alla meiosi II formano gli
• Spermatidi

Modificazioni della spermiogenesi

A partire dal momento in cui gli spermatogoni di tipo A lasciano la popolazione di cellule staminali, la citochinesi è incompleta, in quanto persistono ponti citoplasmatici. Anche per la spermatogenesi sono fondamentali FSH e LH. Per quanto riguarda invece la spermiogenesi, devono avvenire una serie di modificazioni per trasformare spermatidi in spermatozoi, come:

• Formazione dell’acrosoma
• Compattazione del nucleo grazie alle protamine
• Formazione della zona intermedia entro la quale troviamo i mitocondri
• Riduzione del citoplasma e formazione della coda

Fecondazione

È il processo nel quale i gameti maschile e femminile si fondono, ed avviene nella porzione ampollare della tuba. Quando gli spermatozoi raggiungono le vie genitali femminili, non sono in grado di fecondare l’oocita, ma prima devono andare incontro a due processi: la capacitazione e la reazione acrosomiale.

La capacitazione, che dura circa 7 ore, consiste nella rimozione di una proteina di superficie sulla membrana plasmatica degli spermatozoi: solo lo spermatozoo che ha subito questo processo può attraversare la corona radiata. La reazione acrosomiale, indotta da proteine zonali, si conclude con il rilascio di sostanze litiche come l’acrosina e tripsino simile; in particolare ZP3 (zona pellucida). Ci sono molecole sulla superficie della membrana plasmatica degli spermatozoi che riconoscono gli zuccheri di ZP3, e questa interazione ha come effetto (tramite tirosin chinasi e proteine G) il rilascio di calcio, che determina l’esocitosi degli enzimi acrosomiali.

Dunque la fecondazione avviene in tre stadi:

• Penetrazione della corona radiata
• Penetrazione della zona pellucida
• Fusione della membrana dell’oocita e dello spermatozoo, tramite reazioni ad alta affinità tra molecole delle due diverse membrane cellulari, come fertilina (famiglia ADAM) e integrina α6β1, oppure izumo (famiglia delle immunoglobuline) e CD9.

Fenomeni post-fusione

Appena lo spermatozoo entra nell’oocita avvengono quattro fenomeni:

• Reazioni corticali e zonali: una reazione di esocitosi detta dei granuli corticali che permette solo ad uno spermatozoo di entrare nella zona pellucida. Questa reazione rilascia enzimi litici che degradano gli zuccheri di ZP3, ad esempio, impedendo ad altri spermatozoi di poter entrare.
• Decondensazione del nucleo dello spermatozoo e completamento della seconda divisione meiotica dell’oocita
• Attivazione metabolica dell’oocita
• Inizio del processo di mitosi: ogni pronucleo duplica il proprio contenuto, si ripristina il numero diploide dei cromosomi.

Segmentazione e formazione della blastocisti

Quando lo zigote ha raggiunto lo stadio di due cellule, va incontro ad una serie di divisioni mitotiche, aumentando il numero di cellule, dette blastomeri, in un processo chiamato segmentazione; fino allo stadio di otto cellule sono scarsamente compatti, poi avviene la compattazione dopo la terza divisione. Circa tre giorni dopo, le cellule dell’embrione si dividono per formare la morula, 16 cellule, divisa in massa cellulare interna (tessuti embrionali) e massa cellulare esterna (trofoblasto, che concorrerà alla formazione della placenta). In seguito comincia a penetrare un liquido attraverso la zona pellucida, che poi costituirà il blastocele, e in questa fase l’embrione è chiamato blastocisti, diviso in embrioblasto (MCI), le cui cellule sono localizzate a un polo, e trofoblasto (MCE); la zona pellucida è scomparsa grazie alla secrezione di enzimi litici delle cellule trofoblastiche.

Determinazione genetica del trofoblasto

Nel momento in cui occorre differenziare embrioblasto da trofoblasto, entrano in gioco dei fattori di trascrizione come:

• Oct4, inizialmente espresso in tutte le cellule, poi downregolato nelle cellule che daranno origine al trofoblasto; ha un omeodominio che, se deleto, non dà origine all’embrioblasto
• Nanog, se manca le cellule si differenziano in endoderma; inoltre, nelle cellule in coltura sostituisce LIF, che permette alle cellule di rimanere indifferenziate
• Sox2, ha un HMGBox e assomiglia al gene SRY, ha una doppia funzione, una nello sviluppo dell’embrioblasto e una per le cellule staminali neurali
• Cdx2, espresso nel trofoblasto, downregola Oct4, resta espresso nelle cellule che diventeranno trofoectoderma.

Impianto

Nella specie umana le cellule trofoblastiche che ricoprono il polo embrioblastico iniziano a penetrare nelle cellule della mucosa uterina circa al sesto giorno. Le molecole di adesione coinvolte sono laminina e fibronectina (matrice) e le integrine (trofoblasto); intervengono anche delle citochine. Normalmente la blastocisti si impianta nell’endometrio nella parete anteriore o posteriore del corpo dell’utero. La parete dell’utero è composta da:

• Endometrio
• Miometrio
• Perimetrio

Dalla pubertà, l’endometrio va incontro a modificazioni cicliche ogni 28 giorni, e durante il ciclo passa attraverso tre fasi:

• Follicolare, in risposta agli estrogeni
• Secretoria, in risposta al progesterone
• Mestruale

All’epoca dell’impianto, l’utero si trova nella fase secretiva, nella quale il tessuto è edematoso e le ghiandole e le vene diventano tortuose (e ipetrofiche); nell’endometrio sono riconoscibili tre strati:

• Superficiale compatto
• Intermedio spugnoso
• Basale

Se non avviene la fecondazione gli strati 1 e 2 si sfaldano e rimane solo lo strato basale.

Disco germinale bilaminare

Undicesimo-Ottavo giorno Nono giorno Tredicesimo giorno dodicesimo giorno Differenziazione Circolazione utero-del trofoblasto e Vacuoli e lacune Villi primari placentare dell’embrioblasto Membrana di Mesoderma Nuova cavità grazie alle Heuser + ipoblasto extraembrionale cellule prodotte= sacco vitellino splancnopleurico e dal’ipoblasto, il sacco primario somatopleurico vitellino secondario Celoma si espande e il mesoderma (utero reazione extraembrionale (che deciduale) forma la placca corionica) attraversa la cavità corionica col peduncolo (sanguinamento scambiabile con ciclo mestruale).

Ottavo giorno di sviluppo

La blastocisti è parzialmente inclusa nell’endometrio e il trofoblasto si è differenziato in due popolazioni cellulari, del citotrofoblasto, interno, mononucleate e con attività mitotica, e del sinciziotrofoblasto, esterno, polinucleate prive di attività mitotica: le cellule del citotrofoblasto si moltiplicano e migrano per formare il sinciziotrofoblasto. Anche l’embrioblasto si è differenziato in ipoblasto, formato da cellule piccole e cubiche adiacenti alla cavità della blastocisti, ed epiblasto, cellule cilindriche adiacenti a una cavità, la cavità amniotica. Le cellule dell’epiblasto adiacenti al citotrofoblasto sono dette amnioblasti.

Nono giorno di sviluppo

La blastocisti è inclusa più profondamente. Iniziano a comparire dei vacuoli nel sinciziotrofoblasto, e quando confluiscono formano delle lacune, che danno il nome allo stadio dell’embrione, che è appunto definito stadio lacunare. Nel frattempo si forma una membrana, detta membrana di Heuser, che riveste il citotrofoblasto, membrana che insieme all’ipoblasto forma il rivestimento della cavità esocelomatica, o sacco vitellino primitivo.

Dall’undicesimo al dodicesimo giorno di sviluppo

La blastocisti è completamente inclusa nell’endometrio. Le cellule del sinciziotrofoblasto penetrano in profondità ed erodono il rivestimento endoteliale dei capillari materni, dilatati, definiti sinusoidi, che si interconnettono con le lacune, che si riempiono di sangue materno, che inizia a scorrere nel sistema trofoblastico, stabilendo la circolazione utero-placentare. Nasce tra la superficie interna del citotrofoblasto e la superficie esterna della cavità esocelomatica il mesoderma extraembrionale, nel quale nascono delle cavità, che confluiscono e sono dette celoma extraembrionale o cavità corionica. Il mesoderma che riveste il sacco vitellino è detto splancnopleurico, mentre quello che riveste il citotrofoblasto è detto somatopleurico. Nel frattempo nell’endometrio comincia la reazione deciduale, che causa la modificazione delle cellule che diventano poliedriche e trofiche, il tessuto diventa edematoso.

Tredicesimo giorno di sviluppo

Può causare sanguinamento, scambiato con ciclo mestruale. Compaiono dei villi nel trofoblasto; le cellule del citotrofoblasto proliferano e penetrano nel sinciziotrofoblasto formando i villi primari. L’ipoblasto produce altre cellule che migrano lungo la superficie interna della membrana esocelomatica e formano una nuova cavità, detta sacco vitellino secondario o definitivo. Possono formarsi delle cisti anche, dette cisti esocelomatiche. Il celoma extraembrionale si espande e il mesoderma extraembrionale forma la placca corionica e attraversa la cavità corionica a livello del peduncolo di connessione, che con lo sviluppo diventerà il cordone ombelicale.

Disco germinale trilaminare e gastrulazione

Il processo caratteristico della terza settimana di sviluppo sicuramente è la gastrulazione che porta alla comparsa dei tre foglietti embrionali, ectoderma, mesoderma ed endoderma. Inizia con la formazione della linea primitiva sulla superficie dell’epiblasto e continuando ad aumentare di entità forma una doccia (15-16 giorni): l’estremità cefalica è il nodo primitivo che si presenta come una sporgenza che circonda la fossetta primitiva. Le cellule dell epiblasto migrano in direzione della linea e scivolano al di sotto tramite invaginazione:

• Alcune cellule allontanano l’ipoblasto e formano l’endoderma.
• Tra epiblasto ed endoderma formano il mesoderma.
• Le cellule dell’epiblasto rimaste formano l’ectoderma.

Formazione della notocorda

Le cellule prenotocordali si invaginano nella fossetta primitiva e si dirigono in avanti e in direzione cefalica e si intercalano nell’ipoblasto formando la placca notocordale; quando l’ipoblasto viene separato dalle cellule endodermiche la placca notocordale si stacca e forma la notocorda definitiva, la base per lo scheletro assiale; la notocorda si allunga craniocaudalmente, quindi la notocorda si forma in primis cranialmente. Le cellule della notocorda si estendono dalla placca precordale alla fossetta primitiva e nel punto in cui quest’ultima si infossa si forma un canale (neuroenterico) che collega temporaneamente il sacco amniotico con quello vitellino.

Destino cellulare stabilito durante la gastrulazione

Le regioni dell’epiblasto che migrano attraverso il solco primitivo sono state mappate per determinare il loro destino:

• Notocorda, migrano entrando nel nodo di Hensen
• Mesoderma parassiale, migrano dai margini laterali del nodo
• Mesoderma intermedio, migrano dalla regione media del solco
• Mesoderma della placca laterale, migrano più caudalmente

Periodo embrionale dalla terza all’ottava settimana (organogenesi)

È il periodo nel quale i tre foglietti embrionali danno origine ai tessuti e agli organi specifici, la cui forma completa è riscontrabile all’inizio del secondo mese.

Derivati del foglietto ectodermico: la neurulazione

L’ectoderma sovrastante la notocorda forma la placca neurale e le cellule della placca formano il SNC neuroectoderma, e la loro induzione è l’inizio della neurulazione. Questo processo di induzione (promosso dal mesoderma sottostante) consiste in un processo di inibizione di BMP4, un membro di TGFβ, che se presente fa in modo che l’ectoderma diventi epidermide, se assente invece l’ectoderma viene neuralizzato. Noggin, chordin e follistatin inattivano questa proteina e permettono all’ectoderma di neuralizzare, anche se inducono questo processo solo per i tessuti destinati a diventare prosencefalo e mesencefalo, mentre per rombencefalo e midollo spinale intervengolo Wnt-3a e FGF. La placca neurale si espande verso la linea primitiva e dalla fine della terza settimana i margini della placca si sollevano e formano le pieghe neurale mentre la regione mediana si infossa e forma la doccia neurale, le pieghe neurali si fondono cranialmente e caudalmente e si forma il tubo neurale: fino al completamento della fusione le estremità caudale e craniale comunicano con la cavità amniotica tramite i neuropori, con la cui chiusura è completa la neurulazione. Al termine della neurulazione abbiamo una regione centrale (il midollo spinale) e una porzione cefalica più ampia con delle dilatazioni, le vescicole encefaliche. Alcune cellule delle creste neuroectodermiche (cellule dei margini laterali delle pieghe neurali) iniziano a separarsi dalle cellule vicine e migrano; sono note come cresta neurale.