Genetica ed Embriologia

FISH

O fluorescence in situ hybridization, individuo anomalie cromosomiche macroscopiche:

conoscendo la sequenza sfrutto un’ibridazione con un probe fluoroforo.

Mutazioni strutturali

Esistono quattro tipi di mutazioni cromosomiche che implicano cambiamenti nella struttura:

1. Delezioni, mutazione in cui un tratto di cromosoma è mancante, causata ad esempio da

elementi trasponibili, virus, temperatura, radiazioni… Negli eterozigoti per una delezione

spesso non si riscontra fenotipo, anche se una delezione di un allele dominante può

causare la manifestazione del recessivo, in pseudodominanza. Delezione interstiziali

non comprende il centromero. Dovute a LCR, low copy repeats.

2. Duplicazione, raddoppiamento di un tratto di cromosoma. Possono essere in tandem, in

tandem invertite, oppure in tandem terminale (coinvolgimento delle porzioni alle

estremità). Le duplicazioni hanno avuto un ruolo molto importante nello sviluppo di

tratti di geni con funzioni simili, come nell’emoglobina, tratti che poi hanno subito

evoluzione divergente.

3. Inversione, mutazione cromosomica in cui un segmento ha subito un’escissione con

rotazione di 180 gradi. Si distinguono in pericentriche e paracentriche a seconda che vi

sia coinvolgimento o meno del centromero. Possono essere identificate con un’analisi di

linkage, in quanto due geni saranno associati in modo differente in seguito ad

inversione (ABCDE che diventa ADCBE avrà un diverso grado di associazione tra A e B

in seguito all’inversione). Le inversioni causano gravi danni se soggette a crossing over

a causa delle cosiddette anse di inversione, che si creano a causa di un anomalo

appaiamento tra i cromosomi omologhi: se avvengono crossing-over all’interno di

questa ansa di formerà un ponte dicentrico che si romperà, causando la presenza di un

cromosoma acentrico e di uno dicentrico. In seguito nella seconda divisione meiotica si

produrranno 4 gameti, due dei quali (quelli che sono stati implicati nel crossing-over)

non vitali a causa di un forse squilibrio genico.

4. Traslocazione, causa diversa localizzazione del materiale genico. Sono suddivise in

traslocazione intracromosomica non reciproca, traslocazioni intercromosomica non

reciproche, traslocazioni intercromosomica reciproca e traslocazioni robertsoniane (o

fusioni centriche). Anche qui se un organismo è omozigote abbiamo mutazioni di

linkage. Traslocazioni possono dare origine a diverse patologie come la CML

(cromosoma Philadelphia, tra il braccio lungo del cromosoma 22 e il 9) e la sindrome di

Down (robertsoniana tra braccio lungo del 21 e il braccio lungo 14/15).

5. Un’altra classe prevede mutazioni che causano i cosiddetti siti fragili, come nella X, con

espansione di triplette CGG, causando l’X fragile. Corea di Huntington (CAG).

Mutazioni di numero

La causa delle mutazioni di numero sono spesso le non-disgiunzioni in meiosi (I causa quattro

gameti anormali, II 0,5 è normale), originando le cosiddette aneuploidie, che sono quasi

sempre letali negli autosomi:

1. Nulliploidia

2. Monosomia

3. Trisomie

4. Tetrasomie

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Mutazioni puntiformi

Le mutazioni puntiformi sono quelle mutazioni che causano il cambiamento di una sola base

azotata, e sono classificate in quattro classi:

1. Mutazioni missesno, causa il cambiamento di un amminoacido ad un altro

completamente diverso, con diverse caratteristiche chimiche

2. Mutazione non senso, causa la presenza di un codone di stop UAA, UAG, UGA dove un

tempo c’era un codone per un amminoacido. Produce proteine tronche

3. Mutazione neutra, causa un cambiamento da un amminoacido ad un altro con nessun

effetto visibile, a causa della sua funzione strutturale, o di uguali caratteristiche

biochimiche

4. Mutazione silente, mutazione che avviene tendenzialmente alla terza base di una

tripletta, che non provoca uno “switch” tra due amminoacidi, ma l’amminoacido

tradotto è lo stesso, a causa della degenerazione del codice genetico.

Classificazione funzionale

Le mutazioni possono essere:

Loss-of-function, comporta una diminuzione di attività: una mutazione non senso in

• eterozigosi causa l’assenza di metà proteina funzionante. Tendenzialmente sono

recessive.

Gain-of-function, causano l’aumento di funzione o l’accumulo di una proteina aberrante.

• Tendenzialmente sono dominanti.

La corrispondenza con la modalità di trasmissione non è sempre LF-recessiva, GF-dominante.

Inoltre vanno aggiunte tre complicazioni al modello: aploinsuffizienza, dominanza negativa;

Aploinsufficienza, gene deve essere presente in doppia copia

Dominanza negativa, dimero, se tu hai sia la proteina mutata che quella wt quando si forma il

dimero mut/wt comunque non sarà funzionale, quindi il mutato "domina" negativamente sul

wt.

Linkage  e  marcatori  molecolari  

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Genetica  dei  batteri  

Di dimensioni inferiori alle cellule eucariotiche, i procarioti sono organismi unicellulari in cui il

nucleo è assente. Sono suddivisi in due grandi gruppi:

Eubatteri

• Archeabatteri, producenti metano

•

Il genoma procariotico è di dimensioni assai ridotte, completamente codificante, in quanto

sono assenti introni e junk DNA, costituito da cromosoni circolari (spesso singoli), organizzati

in un nucleoide (senza interposizione di membrana), e da altre sequenze circolari non

essenziali per la vita del batterio stesso, con replicazione autonoma e capacità di spostarsi da

cellula a cellula (variabilità genetica): i plasmidi. Spesso questi ultimi danno capacità

metaboliche peculiari e sono utilizzati per modificare geneticamente i batteri, o per far copiare

DNA d’interesse, qualora abbia una dimensione elevata (qualche decina di kb) e prima

dell’avvento della PCR. Notazioni sui batteri (che presentano carratteristiche metaboliche ben

precise) sono ad esempio: -

Incapacità di utilizzare una fonte di carbonio (lac )

• -

Incapacità di sintetizzare un determinato amminoacido (Trp )

• R

Mutanti resistenti ad antibiotici (str , resistenti a streptomicina)

•

Plasmidi e loro utilizzo

Come già detto i plasmidi sono elementi extracromosomici con replicazione autonoma,

circolari, a doppia elica. Sono utilizzati come vettori di clonaggio ottenuti per

ingegnerizzazione, in modo da avere caratteristiche utili:

1. Presenza di un’origine di replicazione

2. Marcatore selettivo, che permetta di riconoscere le cellule con il plasmide, come il gene

R R

amp o tet

3. Uno o più siti di taglio per un enzima di restrizione per inserire il DNA da clonare,

spesso riuniti in siti di clonaggio multiplo, o polylinker.

Quindi il procedimento è il seguente:

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1. Taglio con enzima di restrizione

2. Annealing del DNA che ha estremità complementari alle sequenze del plasmide

3. Aggiunta di legame covalente grazie a DNA ligasi

4. Unisco batteri e plasmidi e aggiungo sale di calcio che disassembla lipidi delle

membrane batteriche, che con bassissima efficienza inglobano un plasmide

In seguito, per selezionare batteri che contengano il plasmide con la sequenza di DNA che ci

interessa, agisco con:

L’aggiunta dell’antibiotico amp o tet, ed elimino i batteri senza plasmide

• Tramite sib selection seleziono i batteri con il plasmide che mi interessa; la sib selection

• permette di creare una copia delle colonie piastrate su nitrocellulosa, che verrà poi

trattata con NaOH per lisare i batteri: rimarrà solo DNA, che potrà ibridarsi ad un

probe, il quale darà una colorazione che segnalerà la presenza del DNA di interesse. La

colonia corretta verrà quindi identificata sulla piastra di petri di partenza.

Differenze trascrizionali tra procarioti-eucarioti

1. Assenza di introni, cap, poliA.

2. RNA codificanti per più di una proteina, detti RNA policistronici, con piu AUG e codoni di

stop; l’utilità consiste nell’ottenere rapporti stechiometrici ben precisi tra gli enzimi

tradotti.

3. Il riconoscimento delle sequenze da cui deve partire il ribosoma non avviene dalle

estremità (mancando il cap in 5’ ho solo un trifosfato). Il ribosoma riconosce una

particolare sequenza, detta di Shine-Dalgarno.

4. Il promotore è contraddistinto in E. coli da -10 e -35, con in mezzo una sequenza

qualsiasi; proiettate su un’elica cilindrica esse sono leggibili da un’unica proteina.

Ovviamente il numero di promotori è minore del numero di geni.

5. Sigma si lega al promotore e recluta la RNA polimerasi (2α, β, β’) per formare un

oloenzima. Numerosi sigma controllano la trascrizione in stress metabolici o termici ad

esempio.

6. La trascrizione si ferma in due modi, che possono essere associati.

Rho indipendente: per la presenza di sequenze ripetute invertite, ricche in C e G si

• forma uno stem and loop, che, se è di almeno 7 basi e se è seguito da tre o più U è

detto terminatore; è riconosciuto dalla polimerasi, che si stacca. Facilmente

individuabile tramite scanner con sistemi computerizzati

Rho dipendente, sequenze ricche di C e povere di G alle quali si lega Rho, un’elicasi.

• Rho si muove lungo il trascritto fino a raggiungere l’RNA polimerasi, nel pumto in cui

troviamo l’ibrido RNA-DNA, che viene srotolato in modo ATP-dipendente. Meno

deterministico del primo, si basa sulla velocità della trascrizione, sul controllo

trascrizionale e non semplicemente su una sequenza: è stocastico, e quindi

potrebbe essere associato ad una terminazione Rho-indipendente.

Il modello dell’operone lattosio

Queso operone è composto da lacZ, lacY e lacA, tre geni consecutivi tradotti in un unico mRNA

che codificano per la β-galattosidasi, per la lattosio permeasi e per la β-galattosina

transacetilasi (che produce allolattosio). Il batterio come fonte primaria preferisce il glucosio. Il

sistema è dotato di un promotore, di una sequenza CAP a monte del promotore e di

un’operatore (dopo il promotore, viene trascritto) riconoscuto da una proteina, il repressore,

codificata da lacI, gene che si trova vicino all’operone