Genetica 2

ELEMENTI TRASPONIBILI

1.1

Sono elementi che hanno la capacità di cambiare posto nel genoma.

Questo spostamento può avere conseguenze fenotipiche sull’ospite.

Possiamo incorrere in diverse mutazioni genetiche complesse come:

Mutazioni geniche il trasposone si inserisce all’interno di un gene, interrompendone la

 

struttura (loss of function).

Mutazioni cromosomiche possono causare riarrangiamenti e traslocazioni

 

Concorrono alla struttura di geni codificanti.



I trasposoni costituiscono molti genomi e sono in grado di modificare l’espressione genica.

L’enhancer dei geni globinici contiene sequenze derivate da trasposoni che ora sono seq. Regolative.

PAX6 deriva da trasposasi di trasposoni.

45% del DNA occupato da trasposoni Quindi tutto ciò che prima era definito come JUNK

DNA In realtà è costituito da seq. Importanti che si sono

Conservate nel corso dell’evoluzione e che sono stati

Riciclati in seq. Regolative o fattori trascrizionali.

I trasposoni sono presenti sia negli eucarioti che nei procarioti, possono quindi spostarsi non solo

da cromosoma a cromosoma, ma anche da cromosoma a plasmide. (permettono un trasferimento

orizzontale tra elementi diversi).

1.2 STORIA FENOTIPO PIANTA PISELLO RUGOSO DI MENDEL:

la causa del fenotipo rugoso è l’inserzione di un trasposone (ormai fossile), in un enzima che causa

l’immagazzinamento degli zuccheri semplici in amido. L’interruzione di questo gene (ad opera

dell’inserzione del trasposone) fa sì che il seme non sia più in grado di convertire gli zuccheri

semplici in amido. Quando il seme cresce si gonfia perché gli zuccheri assorbono acqua, poi

l’acqua evapora e raggrinzisce.

COLORE PELO AGUTI NEL TOPO:

topi identici, cambia l’inserzione di un trasposone vicino al gene auguti che conferisce

pigmentazione del pelo.

1.3 COME IDENTIFICO LE SEQUENZE TRASPONIBILI?

Osservazione di un fenotipo che non si spiega con le leggi della genetica classica.

Posso identificare trasposoni mediante evidenze: dirette (tassi di mutazione elevati, alte

frequenze di reversione e instabilità genetica), indirette (instabilità riconducibile ad elementi che

si spostano nel genoma), criteri molecolari (duplicazioni di seq. Caratteristiche…).

1.4 TRASPOSONI NEL MAIS

evidenza indiretta: ci sono dei casi in cui la colorazione delle cariossidi è un carattere instabile:

ottengo cariossidi con macchie colorate.

Se incrocio linee pure ottengo cariossidi con macchie viola (Mi aspetto invece omozigoti per il

colore viola). Se dovessi spiegarlo con la genetica classica, dovrei presupporre una frequenza di

mutazioni in avanti e tassi di reversione elevatissimi (Mutazioni, più tante reversioni , quante sono

le macchie viola).

Sarebbe impossibile!!! Con l’analisi del genoma, si è visto che l’instabilità è riconducibile a sequenze

di DNA che trovo in posizioni diverse in cariossidi diverse. Si è inoltre notato che esistono delle

FIRME che sono lasciate dai trasposoni nei loro spostamenti, queste firme consistono in sequenze

ripetute e invertite alle estremità, caratteristiche di ogni famiglia di trasposoni.

1.5 ELEMENTI TRASPONIBILI NEI PROCARIOTI

due esempi di elementi trasponibili nei batteri sono:

Sequenze di inserzione

 Trasposoni



Le sequenze di inserzione sono gli elementi trasponibili più semplici, che troviamo nel genoam dei

plasmidi… costituiscono la forma più elementare di trasposone: vi è il gene della trasposasi,

fiancheggiato da sequenze palindromiche ripetute e invertite alle estremità, che la trasposasi

riconosce per catalizzare lo spostamento del trasposone.

COME SONO STATI SCOPERTI I TRASPOSONI NEI BATTERI?

con lo studio della resistenza multipla agli antibiotici. L’insorgenza della resistenza all’antibiotico è

un evento raro perciò la presenza di una resistenza multipla non si spiegava con la genetica

classica.

Questo tipo di resistenza è data dall’inserzione di plasmidi che portano trasposoni che possono

essere trasferiti da una specie batterica all’altra. trasmissione del carattere della resistenza.



Questi trasposoni tagliano il DNA come se fossero enzimi di restrizione, si inseriscono in modo

sfalsato e richiamano la polimerasi per riparare il danno. Quando il trasposone viene exciso si

formano le ripetizioni che permettono di ricostruire le trasposizioni avvenute.

I TRASPOSONI COMPOSTI conferiscono resistenza multipla agli antibiotici poiché vengono



trasferiti in blocco.

1.6 ELEMENTI TRASPONIBILI NEGLI EUCARIOTI:

sono stati scoperti incrociando linee pure di mais (vedi 1.4) (parto da una linea pura perché è

stabile e perciò mi aspetto caratteri stabili)

come funziona?!

La colorazione del mais dipende da 3 loci: C, DS, AC

C è il locus color, che codifica per l’enzima che mi da il pigmento colorato.

AC e DS sono elementi trasponibili, ma DS è un trasposone defettivo, che quindi non può

spostarsi da solo, ma necessita di AC per poterlo fare. (AC è il trasposone integro che codifica

per la trasposasi).

Se il locus C viene interrotto da DS perdo colore.

L’excisione di DS permette le diverse macchie, in quanto il gene recupera la propria integrità.

Senza AC, DS non può spostarsi, quindi se elimino AC con DS inserito nel gene, avrò il colore

giallo.

Se DS exciso= colore viola.

AC, DS e C devono essere sullo stesso cromosoma? NO, la trasposasi è diffusibile.

1.7 DISEGNESI DEGLI IBRIDI IN DROSOPHILA:

ho un fenotipo che non si spiega:

FEMMINA M + MASCHIO P = progenie sterile non c’è reciprocità dell’incrocio!!!

FEMMINA P + MASCHIO M = progenie normale

La disgenesi che osservo è data da un elemento trasponibile P che si muove nella germ line di

drosophila, inserendosi in tanti geni e disattivandoli, quindi il fenotipo finale sarà sterilità.

Perché non succede se incrocio maschio M e femmina P? l’elemento P può essere sia trasposasi

che repressore per la trasposasi. Fa danni solo nell’uovo della femmina M perché manca il

repressore per la trasposasi e quindi subisce trasposizione e disgenesi.

L’elemento P è composto da 4 esoni e può fare trasposasi o repressore della trasposasi, in base al

codone di stop che viene usato.

CITOTIPO: possibilità di muoversi dell’elemento trasponibile.

1.8 SPOSTAMENTO DI UN TRASPOSONE:

Effetto neutro: se va in una regione NON codificante

 Effetto dannoso: induce mutazioni

 Effetto positivo: da variabilità genetica



1.9 TIPOLOGIE DI TRASPOSONI:

Trasposoni a DNA: FOSSILI

 Trasposoni a RNA o RETROTRASPOSONI: per trasporsi necessitano la formazione di un

 intermedio a RNA, retrotrascritto in cDNA, che si integra poi nel genoma.

I retrotrasposoni si dividono in due classi:

1. LTR possiedono seq. Ripetute alle estremità



2. NON-LTR non hanno seq. Ripetute alle estremità. Sono suddivisi in due sottotipi, le



brevi sequenze intersperse e le lunghe.

a. LINEs o L1 sono lunghe seq. di DNA, codificano epr due geni, permettono la



trasposizione sia di loro stessi che di altre seq. non codificanti. Rappresentano circa

il 5% del genoma e contengono sequenze ORFs con omologia alla trascrittasi inversa.

Possiedono retrotrasposasi per spostarsi.

b. SINEs soni brevi sequenze di DNA, raramente sono trascritte. Non oid. Per la



trascrittasi inversa. Le più comuni appartengono alla famiglia delle seq. alu. Implicati

in mutazioni gain of function.

Gli elementi SINEs non sono autonomi negli spostamenti e si sposatno grazie alla machinery

trascrizionale di L1. Conseguenza? Formazione di pseudo geni processati, dei finti geni che derivano

da intermedi a RNA, riconoscibili eprchè hanno le caratteristiche di un cDNA

(seq. codificanti, no introni, no seq. regolative). (PAG 94 per approfondimento).

(esempio L1 nell’uomo

L1 è l’unico elemento LINE presente nell’uomo in grado di trasporre solitamente nella linea

germinale. Tuttavia si muovono ancora nel cervello e sono coinvolti in patologie che determinano la

distruzione di geni, la loro mobilitazione è riscontrabile anche nei tumori, si ipotizza che esistano

dei meccanismi di repressione della mobilità di L1 che vengono disattivati nella cellula tumorale.

L1 può essere visto come un parassita che sfrutta la macchina replicativa della cellula ospite

L’uomo presenta meccanismi di difesa che inibiscono l’espressione di questi elementi trasponibili

quali la repressione di tipo epigenetico data dalla metilazione del DNA o il silenzialmento nella linea

geminale maschile del trasposone.)

2.0 MECCANISMO V(D)J

meccanismo usato dalle cellule per produrre un vasto numero di anticorpi, si bassa su reazioni di

riarrangiamento del DNA. Reso possibile da 2 enzimi: RAG 1 e RAG2.

2.1 FENOTIPO DEL BASSOTTO:

per capire la diversità tra cani acondroplastici (zampa corta) e cani a zampa lunga eseguo un test

genome wide, interrogo il genoma, e vado a vedere tutti i cromosomi e se ci sono varianti presenti

nei cani bassi, che non sono presenti in quelli a zampa lunga.

Cromosoma 18 variante frequente nei bassotti.



Esiste uno pseudogene FGF4, identico al gene FGF4, che però manca di introni e poly A.

Gli pseudogeni di solito non sono trascritti, ma questo lo è, si ha quindi un overespressione di FGF4

che blocca la crescita precocemente, Favorendo la calcificazione.

Come lo pseudogene è espresso? Le seq. regolative sono fornite dal trasposone adiacente (LINE),

la specificità è garantita dal 3’UTR.

Gli eleemnti trasponibili sono spesso usati come marcatori genetici, permettono di tracciare la storia

evoliutiva della specie.

RETROVIRUS A RNA

1.1

Si replicano attraverso intermedi di DNA a doppia elica e infettano solo le cellule eucariotiche,

sono in gradi di trasferirsi orizzontalmente da una cellula all’altra.

1.2 ciclo biologico: attacco del retrovirus alla cellula ospite, virus penetra nella cellula ospite,

trasferisce il suo RNA, che viene retrotrascritto in DNA e integrato nel genoma dell’ospite.

Sfrutta poi la RNA polimerasi 2 dell’ospite per produrre mRNA, una parte deriverà per costituire

le proteine per la sintesi di nuove particelle virali, una parte si integrerà nel genoma e verrà usato

come materiale genetico.

1.3 STRUTTURA RETROVIRUS composto da 2 molecole

1. GENOMA COMPATTO

di RNA 2. NUCLEO VIRALE PROTEICO (CAPSIDE)

3. STRUTTURA ESTERNA (INVOLUCRO),

formato da glicoproteine per riconoscimento con ospite.

RNA virale formato da:

2 estremità dette LTR

 3 unità trascrizionali: geni GAG, POL, ENV.



GAG codifica per proteine capside, ENV per l’involucro e POL per la trascrittasi inversa.

La trascrittasi inversa non ha attività di proof reading, quindi mutazioni molto frequenti!

Difficoltà nel trovare vaccino!

1.4 HIV: infetta un particolare tipo cellulare: linfociti T. in particolari individui resistenti all’HIV è

presente una mutazione che impedisce la produzione del recettore di membrana CCR5, che non

viene quindi riconosciuto dal virus e evita l’infezione.

1.5 come può un retrovirus con solo 3 unità trascrizionali sintetizzare così tante proteine diverse:

Splicing alternativo

 Proteine di fusione

 Riarrangiamneti



1.6 CONSEGUENZE INFEZIONE:

L’LTR virale è un prmotore/ enancher molto forte, può quindi attivare la trascrizione di molti geni

diversi adiacenti. Può inoltre spostarsi rompendo il gene in cui si è integrato alterando il prodotto

genico dei geni vicini e creando così proteine di fusione. In questo caso parliamo di virus

trasformanti.

Questa mutagenesi da inserzione è uno dei problemi principali della terapia genica. L strategia

base della terapia genica è quella di correggere il gene mutato, facendo infettare la cellula da un

retrovirus che porta il gene corretto.

1.7 GENE THERAPHY: RETROVIRUS MOLONEY: può infettare cellule in divisione, ma non

cellule quiescienti, può provocare mutagenesi inserzionale portando a tumori

1.8 GENE THERAPHY: LENTIVIRUS: non provocano mutagenesi inserzionale, possono infettare

anche cellule che non si stanno dividendo, ma il loro genoma presenta molte proteine accesorei,

difficili da maneggiare.

1.9 VETTORE TERAPEUTICO:

si usano cellule dette di impacchettamentoche vengono trasfettate insieme al DNA del gene

terapeutico: più spezzetto il genoma, più minimizzo la probabilità di infezione.

Gag, pol ed env vengono dislocati e la cellula virale viene riassemblata in una cella fi packaging, in

cui verranno inseriti 3 costrutti: uno con il gene corretto, uno che porti GAG-POL, uno che porti

ENV.

CRISPR-CAS9

1.1 La storia di CRISPR inizia nel 1987 quando un biologo giapponese che stava studiando il

genoma di escherichia coli, nota sequenziando una porzione di cromosoma, che sono

presenti delle sequenze ripetute di DNA, lunghe circa 30 paia di basi, separate da sequenze

da brevi sequenze spaziatrici (spacer). Il significato biologico di queste sequenze ripetute,

oggi note come RISPR era sconosciuto.

1.2 Si scoprì poi che queste sequenze ripetute erano presenti anche in altri batteri e

archeobatteri e che sembravano essere sempre uguali, mentre le sequenze spaziatrici

sembravano essere sempre diverse.

1.3 Nel 2005 si scoprì che le sequenze spaziatrici erano identiche a sequenze di DNA di virus

batteriofagi, che avevano precedentemente infettato il batterio. Sembrava servire per una

sorta di immunità. Quindi CRISPR doveva rappresentare una specie di difesa batterica

contro le infezioni virali. La prova arriva grazie a dei microbiologi che stavano studiando i

batteri dello yogurt, li incubarono con dei batteriofagi specifici e in quelli sopravvissuti,

sequenziarono il genoma confermando ciò che era stato ipotizzato: le cellule avevano

incorporato nella regione CRISPR del loro cromosoma un pezzo di DNA del batteriofago.

CRISPR rappresentava una forma di immunità adattiva (personalizzabile).

1.4 Si scoprirono poi dei geni associati a CRISPR. I geni CAS. In particolare CAS9, studiata

dallo streptococco. CAS9 è una nucleasi con la capacità di tagliare il DNA, come gli enzimi

di restrizione ma programmabile, che può tagliare il DNA in una qualsiasi sequenza di

nucleotidi se gli si dice dove farlo. Le istruzioni per il taglio provengono da una molecola di

RNA che si lega a CAS9.

1.5 QUINDI: quando un virus infetta i batteri, per prima osa inietta il suo DNA nella cellula. Il

DNA virale istruisce i batteri a creare copie del virus. Se un batterio riesce a sopravvivere

all’infezione prende un frammento di DNA virale e lo unisce al proprio cromosoma. Poi

aggiunge sequenze di ripetizione CRISPR su entrambi i lati del DNA virale. Il batterio crea

così una sorta di database che poi trasmetterà alle generazioni successive.

1.6 Una volta che il batterio ha acquisito la seq. di DNA spaziatore nel locus CRISPR, in caso

di una seconda infezione il DNA spaziatore/ l’intera regione CRISPR viene trascritta in

RNA, scisso poi in frammenti separati detti criprRNA, questo viene caricato nell’enzima

CAS9 e si unisce al tracrRNA, CHE FUNZIONA DA SITO DI COLLEGAMENTO

UNIVERSALE EPR IL crisprRNA.

1.7 Se il DNA virale entra nuovamente nella cellula, il complesso CRISPR-CAS9 lo riconosce

mediante appaiamento di basi complementari e lo taglia rendendolo innoquo.

1.8 È possibile personalizzare questo complesso? SI, fondendo il criprRNA con il tracrRNA

ottengo un RNA guida, con una sequenza target specifica di mia scelta.

1.9 Prima prova per programmare cas9: tagliare gene GFP (fluorescenza) in E. COLI.

1.10 CRISPR-CAS9 è presente anche negli eucarioti come le cellule umane? NO!!! Però posso

costruirlo e introdurlo artificialmente.

1.11 Due ricercatori hanno usato CRISPR-CAS9 per introdurre (knock-in) di un nuovo gene e

hanno scoperto che quando il DNA viene tagliato in una cellula eucariotica, questa cerca

di riparare il danno in 2 possibili modi: 1. Usa nucleotidi casuali come colla (metodo che porta

allo sviluppo di mutazioni) 2. Riparazione diretta dall’omologia: la maggiuor parte delle cellule

eucariotiche sono diploidi, ovvero ogni cromosoma fa parte di una coppia di omologhi, si si

danneggia uno, posso usare l’altro come stampo, come copia, per la riparazione.

1.12 Ipotesi: se si può fornire un pezzo di DNA “donatore” con estremità corrispondenti alle

estremità tagliate nel DNA originale, allora la cellula potrebbe considerare funzionale il

DNA del donatore e riparare il taglio. funziona!!!



1.13 Prospettive: usare crispr-cas9 per trattare malattie genetiche.

1.14 CRISPR-CAS9 E FIBROSI CISTICA:

gene difettoso: CFTR, porta all’accumulo di muco denso.

In teoria quindi potremmo andare a sostituire il gene malato con quello sano, in pratica ogni

cellula di un individuo adulto affetto da fibrosi cistica presenta il gene mutato quindi non

si può fare!

1.15 GENE DRIVE

È un segmento sintetico di DNA che include il gene cas9, un gene guideRNA e il gene di

interesse. I gene drive, sono in grado di inserire o disattivare i geni di un organismo. Gli

scienziati lo stanno usando per debellare la malaria. Modificando il gene dublesex hanno

ottenuto una zanzara femmina con caratteristiche morfologiche intermedie tra i due sessi,

quindi sterile!!!

N.B per garantire l’attività esonucleasica, cripsr-cas9 richiede una PAM: una sequenza di 3 coppie

di basi che si trova adiacente all’estremità 3’ del sito target del DNA e facilita il riconoscimento, è

specifica per omologia ad ogni cas9!

GENETICA

0.1

GENETICA DEI CARATTERI QUANTITATIVI: si occupa dei così detti caratteri quantitativi,

ovvero caratteri fenotipici variabili in modo continuo, come l’altezza di una pianta. Questi caratteri

sono polige