Genetica 2

QTL – quantitative traits loci (loci associati a caratteri quantitativi)

sono caratteri fenotipici poligenici quindi controllati non da uno ma da tanti geni e multifattoriali

quindi oltre al fattore gene c'è anche il fattore ambiente che influisce sulla sua manifestazione.

Sono caratteri quantitativi l'altezza, il peso, colore pelle, pressione sanguigna, colore capelli ecc.

Se abbiamo un carattere multifattoriale (in cui interviene anche l'ambiente) per prima cosa bisogna

capire qual è la componente genetica, ovvero quant'è l'ereditabilità del carattere.

I caratteri definiti da QTL si manifestano generalmente come continui ma ci sono dei caratteri

associati a QTL che hanno una manifestazione dicotoma e non continua (quindi il fenotipo c'è o non

c'è). E' il caso di alcune patologie per es il diabete di tipo II, displasia dell'anca, asma. Nei casi di

dicotomia abbiamo un altro problema, capire come mai dei caratteri dovuti a più loci abbiano una

manifestazione di tipo discontinuo piuttosto che continua.

Osservando lo spettro dei diversi caratteri umani vedo come siano relativamente pochi i caratteri

che siano puramente mendeliani (es beta-globina, la fibrosi cistica), la maggior parte dei tratti

(caratteri) dipendono da un mix di determinanti poli-genici e da fattori ambientali. Altri caratteri

come l'altezza sono determinati da un n° di loci elevatissimo, ci sono geni che danno un contributo

maggiore e altri minore.

L'altezza o il peso si distribuiscono come una gaussiana → perchè più sono i geni che determinano

quei caratteri, più avremo alleli e più avremo classi (con classe s'intende ad es una altezza, es 1,66 e

1,67 sono 2 classi).

Per spiegare il concetto:

– supponiamo di avere dei loci, A, B e C che determinano il carattere X (altezza, colore pelle

ecc)

– ognuni locus ha delle varianti alleliche (A-a , B-b e C-c) che sono codominanti (cioè

riusciamo a riconoscere nella popolazione l'eterozigote come fenotipo dal dominante e dal

recessivo, ovvero vedo l'effetto di entrambi gli alleli nel fenotipo riuscirò quindi a

distinguere il fenotipo AA, Aa, aa)

– ogni allele ha un effetto additivo (normalmente un carattere quantitativo è determinato dalla

somma dell'azione di più geni → additività). Per es per il carattere altezza ogni allele

grande A, B, C aggiunge 10cm a un altezza di base: un individuo AA avrà 20cm in più, se

Aa 10cm in più se aa 0 cm in più

– La frequenza di questi alleli la considero 0,5 nella mia popolazione, questo per permettermi

di calcolare le frequenze dei diversi genotipi e quindi fenotipi che otterrò dall'incrocio Aa x

Aa (singoli eterozigoti), AaBb x AaBb (doppi eterozigoti) e tripli eterozigoti.

Se facessi un incrocio AaxAa ottengo AA (¼), Aa (½) e aa (¼) quindi con un unico locus e 2

varianti ho ottenuto 3 classi genotipiche e anche fenotipiche (perchè gli alleli sono codominanti).

Consideriamo 2 loci A e B posso avere 5 classi fenotipiche, 4 alleli grandi AABB (40cm in più), 3

alleli grandi (in diverse combinazioni), 2, 1 o 0 (aabb).

Considerando 3 loci otterrò 7 classi fenotipiche, posso avere 6 alleli grandi, 5,4,3,2,1,0.

Aumentando il numero di loci (geni) aumento il n° di classi fenotipiche che posso ottenere, tanto

maggiore avrò una curva che somiglia a una gaussiana resa ancora più continua dal contributo

ambientale.

La quantità e lo spettro della variabilità umana si può spiegare con un ampliamento della genetica

mendeliana (solo che ho a che fare con un numero di loci molto maggiore).

Medesima spiegazione si può avere per il colore della pelle (o occhi) in cui se per esempio

considero 3 geni/loci ognuno con 2 alleli ovviamente, A sono gli alleli dark che danno un contributo

per il colore, avrò 7 classi fenotipiche: aabbcc saranno bianchi, AABBCC saranno molto neri.

REGRESSIONE VERSO LA MEDIA (ora consideriamo la popolazione)

considerando una popolazione iniziale descritta da una gaussiana, agli estremi della gaussiana avrò

degli individui omozigoti per tanti alleli piccoli e all'altro estremo omozigoti per tanti alleli grandi.

Se questi individui si incrociassero in maniera random all'interno della popolazione (random

mating), gli individui più piccoli (che hanno il maggior numero di geni omozigoti recessivi)

mediamente genereranno degli individui che saranno un pochino più alti perchè è più probabile che

si incrocino con individui con meno alleli recessivi di quanti ne abbiano loro (es aabbcc X AAbbcc

→ Aabbcc quindi il figlio è un po' più alto).

Questo vale per tutte le classi fenotipiche della prima popolazione o popolazione parentale.

Se sommo tutte le progenie che ottengo dagli individui della popolazione 1 otterrò che la somma

della popolazione figlia ricostruirà una gaussiana che è uguale alla popolazione parentale. Cioè la

popolazione che ricostruisco sulla base di incroci casuali a partire da individui della popolazione

originaria rispecchia esattamente le classi fenotipiche della popolazione originale.

DICHOTOMOUS QUANTITATIVE TRAITS – es diabete di tipo II, displasia, asma

Per i caratteri quantitativi dicotomi come mi spiego la manifestazione del carattere?? ipotizzo che

esista un effetto soglia, ovvero se ho bisogno di avere nello stesso individuo 10 alleli predisponenti

(che derivano da più geni) per avere quel carattere/patologia, questa si manifesterà solo al superare

la soglia.

Se avessi un background genetico nella mia famiglia in cui sono presenti un n° di alleli

predisponenti maggiori che nella popolazione la probabilità che ho di superare la soglia è molto più

elevata. Se vado a vedere la distribuzione del numero di individui affetti/non affetti nella

popolazione generale vedo che la curva della mia famiglia sarà spostata verso dx, la soglia rimane

quella ma gli individui che superano la soglia sono maggiori che non nella popolazione generale.

Lezione 2 - Ereditabilità

La varianza per una gaussiana è la dispersione dei dati intorno alla media (più è stretta minore è la

varianza, più la curva è larga maggiore è la varianza e quindi la dispersione). Data la distribuzione

normale, quanto della varianza è attribuibile a fattore genetici e quanto all' ambiente?

All'interno della mia varianza totale/fenotipica (cioè quello che vedo nei soggetti, lo spettro dei

fenotipi) ho sia la componente genetica che ambientale. L'ereditabilità è la quota della varianza s^2

dovuta a soli effetti genetici.

L'ereditabilità h^2 si può esprimere quindi come varianza genetica Vg/Vp varianza fenotipica:

h^2=(Vgenetics)/ (Vgenetics+Venvironment)

Per capire il contributo della componente ambientale nell'uomo bisognerebbe avere 2 individui con

lo stesso background genetico esposti ad ambienti diversi, come 2 gemelli omozigoti.

Questo esperimento si può fare meglio con le piante perchè se incrocio 2 linee pure nella F1 otterrò

un background genetico medesimo, saranno tutte eterozigoti per quel gene quindi non dovrei avere

uno spettro ma solo una linea. Lo spettro che vedrò nella F1, la varianza/dispersione sarà dovuta

quindi solo all'ambiente. Incrociando individui della F1 invece, nella F2 avrò uno spettro di

genotipi, non saranno più tutte uguali genotipicamente, in questo caso la varianza fenotipica (che

ovviamente sarà maggiore) sarà dovuta sia a fattori genetici che ambientali.

esercizio: abbiamo 2 linee pure di fagioli che vengono incrociati, alla F1 la varianza dei fagioli nel

peso è 1,5 facendo incroci F1xF1 nella F2 la varianza è di 6,1. Qual è l'ereditabilità del peso nella

popolazione F2??

nella F1 avrò tutte piante uguali geneticamente quindi 1,5 è la varianza data dall'ambiente.

Nella F2 ho più genotipi, uno spettro di genotipi, la gaussiana si allarga e quindi aumenta la

varianza data sia da varianza ambientale + quella genetica = 6,1.

A questo punto mi ricavo la varianza genetica 6,1-1,5= 4,6.

h^2 l'ereditabilità sarà il rapporto fra la varianza genetica e la varianza fenotipica = 4,6/6,1= 0,75=

75%.

COME SI MAPPANO I QTL?

Il passo successivo è individuare quali sono i geni che influenzano quel determinato carattere

– incroci (non fattibile nell'uomo)

– posso fare degli studi di associazione genome-wide GWAS

INCROCI → incrocio 2 linee pure, che siano 2 varianti per un medesimo carattere come il n° di

tricomi sulle foglie. La F1 sarà eterozigote, faccio incroci F1xF1 e ottengo diversi genomi in F2,

incrocio ogni individuo della F2 con sé stesso per diverse generazioni facendo in modo che

diventino esse stesse delle nuove linee pure l'una diversa dall'altra geneticamente in cui avrò

rimescolato i pezzi dei cromosomi originali. Ognuna sarà omozigote per una piccola sezione del

cromosoma parentale.

Posso prendere le linee che hanno lo stesso fenotipo (es pochi peletti) e vado a vedere qual è la

porzione comune a tutte le linee pure ottenute dalla F2 che mostrano pochi peletti (omozigosi di

mapping). Ne deduco che questa regione sia quella che contiene il gene che m'interessa.

Studio di associazione genome wide GWAS → si basa sull'idea di riuscire ad associare il fenotipo

con delle varianti alleliche presenti nei casi rispetto ai controlli. Quindi io non so dove si trovi lungo

il genoma la variante che contribuisce a quel dato fenotipo quindi devo interrogare tutto il genoma

(genome-wide). Questo implica che io debba avere dei marcatori che mi coprono tutta la lunghezza

del genoma perchè per tutti i marcatori che avrò a disposizione sul cromosoma 1 uno ad uno mi

chiederò “questa variante è presente in maniera significativamente diversa nei casi rispetto ai

controlli?” e questo lo farò per tutti i cromosomi.

Ma i controlli quali sono??

facciamo un esempio, per il diabete di tipo 1 ho un gruppo di diabetici con le relative varianti, il

gruppo di controllo sono individui sani che non hanno diabete, mi chiedo se la variante X è

maggiormente presente in maniera statisticamente significativa nei casi rispetto ai controlli?? se la

risposta è si allora chi ha questa variante è predisponente (la variante può anche essere protettiva

quindi portare a una minor probabilità di sviluppare la malattia).

Qual è la tipologia di marcatori genetici che usiamo?? sono gli SNP single nucleotide polimorfism

di cui se ne stimano 1 milione quindi copriamo bene il genoma. 1 SNP ogni 100-300 basi.

Risultato della GWAS evidenziano come per certe patologie come la macular degeneration siano

solo pochi geni, in questo caso 3, che contribuiscono al 50% dell'ereditabilità mentre per altri tratti

come l'altezza siano stati identificati circa 180 loci che da soli spiegavano il 12% di ereditabilità (in

uno studio di Nov 2020 i loci per l'altezza individuati erano 10.000 che spiegavano l'80% di h^2).

Per un carattere complesso come il morbo di Crohn in cui 70 loci contribuiscono al 20%

dell'ereditabilità dal punto di vista della terapia ci posso fare ben poco.

Per la macular degeneration invece posso in qualche modo intervenire.

A cosa mi servirebbe avere l'intera sequenza del genoma umano??

per capirne la struttura, la storia evolutiva di un gene, la sua conservazione, le varianti (ogni 300bp

nella popolazione umana abbiamo un polimorfismo), scoprire varianti associate a malattie, posso

costruire un catalogo della variazione umana.

L'istituto SANGER che si occupa di genomica ha una banca dati di 65-70 petabyte (2^50 byte).

Lezione 3 - COME S'IDENTIFICA E STUDIA UN GENE ALL'INTERNO DEL GENOMA?

Devo innanzitutto capire dove si trovano i geni e la loro struttura (con il promotore, introni, esoni

ecc). Per isolare un gene e ricostruire un genoma si usano le librerie di Dna , cioè una collezione di

frammenti di Dna rappresentativi del Dna di un dato organismo, clonato in vettori in modo da averli

isolati e identificati. La lunghezza di questi frammenti dipende fondamentalmente dal vettore di

clonaggio che viene utilizzato. I plasmidi, fago lamda, cosmidi fino ai yeast artificial chromosomes

YACs. Questi sono alcuni vettori di clonaggio. I plasmidi contengono dei frammenti relativamente

piccoli (5-10kb max), il fago lamda fino a 15kb, i YACs più di tutti (3Mb).

I vettori di clonaggio quindi sono delle molecole a sequenza nota:

– in grado di replicarsi indipendentemente nella cellula ospite in modo che possa mantenere

dei cloni del frammento che m'interessa

– siccome poi questo vettore lo dovrò inserire dentro un vettore di espressione (es. trasfettare

coli) deve possedere dei marcatori che permettano il riconoscimento nelle cellule che hanno

acquisito il vettore (es un marcatore è la resistenza agli antibiotici)

Mediamente un gene è lungo sulle 50kb, se usassi un plasmide il mio gene verrebbe spezzettato in

4-5 cloni diversi che poi devo ricostruire. Devo quindi calcolare la dimensione dell'inserto ottimale

che vorrei all'interno del vettore.

COSA CONTIENE UN VETTORE PLASMIDICO:

– marcatore di selezione → di solito è una sequenza per la resistenza all'antibiotico

– origine di replicazione → per la replicazione autonoma all'interno del batterio

– MCS sito multiplo di clonaggio → in cui si trovano vari siti per diversi enzimi di

restrizione. Di solito l'MCS si trova all'interno del gene lacZ (il lattosio lega il repressore

che blocca la trascrizione dell'operone lac e quidi promuove la formazione degli enzimi) che

codifica per la beta-galattosidasi che in presenza di substrato X-gal (sostituto del lattosio) lo

metabolizza e se c'è anche l'induttore IPTG (che sequestra il repressore al posto del lattosio)

dà un composto blu. Se il mio inserto Dna si è inserito bene nel plasmide il gene lacZ viene

interrotto e quindi avrò colonie bianche perchè non avrò gli enzimi per avere il prodotto blu.

Se voglio costruire la mia libreria usando vettori plasmidici, digerisco con lo stesso enzima di

restrizione sia il vettore nel MCS che il Dna genomico d'interesse (le estremità desiderate le ho

ottenute tramite PCR, usando degli oligonucleotidi artificiali), in presenza di Dna ligasi ligo i

frammenti all'interno dei vettori → ho ottenuto il mio vettore di clonaggio pronto per essere

trasfettato.

Trasformo E.coli con questi vettori e poi farò la selezione con antibiotico (uccido quelli che non

hanno la resistenza all'antibiotico quindi che non hanno il vettore), poi seleziono quelle bianche

(che avranno anche l'inserto).

Avrò un catalogo in cui ogni clone contiene un frammento diverso di Dna genomico.

Il problema è che voglio fare una libreria di un genoma come quello umano 3 mld di bp con una

lunghezza media dei geni di 50kb è più opportuno andare su vettori che contengono sequenze un po'

più grandi, come il fago lamda che contiene 15kb di Dna esogeno.

VETTORE FAGO LAMDA, ha 2 cicli:

– ciclo litico → è immediato e provoca subito la lisi del batterio. L'infezione porta alla

produzione di nuove particelle virali che vengono rilasciate

– ciclo lisogenico → il fago integra il proprio Dna all'interno del genoma del batterio e rimane

in attesa di segnali di induzione (cibo, fatt ambientali), quindi riprende il ciclo litico. I geni

per il ciclo lisogenico non sono essenziali per la sopravvivenza di fago lamda quindi posso

levarli e sostituirli con i miei geni di interesse (occupavano 15kb circa quindi tanto tolgo e

tanto metto in totale fago lamda ha un genoma di 45kb)

Digerisco con lo stesso enzima di restrizione sia il genoma di fago lamda che il Dna da essere

clonato es uso EcoR1. Vengono eliminati i geni per il ciclo lisogenico e all'interno di lamda

vengono clonati i frammenti che derivano dal genoma che voglio clonare in modo da ricostruire un

frammento di Dna che ha più o meno le dimensioni del fago lamda e verrà inserito nel capside

virale. In piastra poi vedrò le cosiddette placche di lisi ovvero quando il fago infetta il batterio ne

provoca la lisi e il rilascio delle particelle virali con il mio inserto di interesse clonato.

Possiamo decidere di volere degli inserti più grandi, abbiamo a disposizione dei cosmidi (ibrido

artificiale fra i lamda e i plasmidi), i BAC, Yeast Artificial Chromosome ecc.

LIBRERIE A cDNA

Il cDna è il Dna complementare, ottenuto dalla trascrittasi inversa di un mRna.

Se dovessi confrontare librerie di Dna per diversi tipi cellulari non avrei alcuna differenza, la

sequenza nel genoma rimane la medesima (per uno stesso individuo).

Se invece guardo le librerie a cDna allora vedrò delle differenze, un libreria a cDna sarà

l'immagine del trascrittoma di quel tipo di cellula in quel dato momento di sviluppo, ci sarà

differenza fra una library di una cellula di un tessuto piuttosto che di un altro, questo perchè il cDna

deriva dall'mRna e ogni cellula esprime un proprio repertorio di mRna (ad eccezione dei geni

housekeeping, omniespressi).

Nel caso volessi fare una libreria a cDna devo innazitutto estrarre l'mRna della cellula, poi grazie a

trascrittasi inversa sintetizzo il cDna corrispondente. Queste sequenze nucleotidiche non sono

lunghe come un intero gene soprattutto a causa della rimozione degli introni nello splicing, quindi il

vettore per il clonaggio in cui inserisco il cDna ottunuto può benissimo essere un plasmide da

inserire in un batterio.

Un vettore di espressione necessita anche di sequenze regolative per questo nel vettore di clonaggio

inserisco anche un promotore e un segnale di terminazione. Il promotore può essere forte, debole o

una via intermedia, ma anche inducibile. Abbiamo creato vettori con diversi tipi di promotori (di

solito si usa il promotore del citomegalo