Fondamenti di genetica, genetica dei microrganismi, genetica delle popolazioni

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

GENETICA

La genetica studia la trasmissione delle caratteristiche ereditarie da una generazione

materiale genetico.

all’altra, attraverso il

Scoperte ed esperimenti sul materiale genetico

Mendel, 1860: studiò i principi dell’ereditarietà ma non sapeva quale fosse la sostanza

responsabile della trasmissione ereditaria. Sapeva però che questa sostanza doveva

contenere un numero assai elevato di informazioni, potersi replicare innumerevoli volte

e variare nei diversi individui della stessa specie.

Fine XIX secolo: il materiale genetico è contenuto nel nucleo della cellula, in particolare

di cosa è fatto?

nei cromosomi ma,

Furono lunghe le ricerche e molti gli esperimenti svolti per rispondere a tale domanda:

Griffith, 1928: batterio Streptococcus pneumoniae (responsabile della polmonite)

Gli pneumococchi si dividono in due ceppi:

forma virulenta,

Ceppo S: forma colonie rivestite da una capsula polisaccaridica,

◌ perciò lisce (smooth)

forma non virulenta,

Ceppo R: da origine a colonie non rivestite dalla capsula e

◌ perciò ruvide (rought)

La capsula polisaccaridica protegge la colonia dall’intervento del sistema immunitario

dell’ospite, la forma virulenta perciò porta alla manifestazione dei sintomi della

polmonite e infine alla morte dell’ospite.

Riproducendosi i batteri del ceppo S generano soltanto individui anch’essi appartenenti

al ceppo S e allo stesso modo i batteri del ceppo R originano solo colonie presentanti

batteri del ceppo R.

Ciò significa che la presenza o meno della capsula polisaccaridica è una caratteristica

ereditaria. L’esperimento di Griffith

venne condotto su dei

topi:

Iniettando nel topo batteri

del ceppo S vivi, l’individuo

presentava i sintomi della

polmonite e infine moriva.

Iniettando invece batteri

del ceppo R il topo non

moriva. I batteri del ceppo

S iniettati invece già morti,

precedentemente uccisi al

calore, non avevano alcun

effetto avendo perso la

loro capacità di replicarsi.

Iniettando una miscela dei

due differenti ceppi,

composta da ceppo S

Figura 1: Esperimento di Griffith morti e ceppo R vivi, il topo

moriva e la colonia presentava batteri del ceppo S vivi. Ciò significava che alcune

sostanze presenti nella capsula dei batteri S morti provocavano la trasformazione dei

principio trasformante.

batteri R. A questa sostanza si diede il nome di

Sia e Dawson, 1931: l’esperimento era simile a quello di Griffith ma svolto in vitro e non sui

topi, le colture di batteri crescevano su piastre di terreno solido. Allo stesso modo il

1

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

procedimento di tale esperimento dava origine a cellule batteriche R a partire da batteri

del ceppo R, non dava origine a nessun genere di colonia a partire da batteri del ceppo

S morti e dava infine origine a colonie S a partire da una miscela di R vivi e S morti.

Qual è la sostanza chimica che causa la trasformazione?

Avery e colleghi, 1944: l’esperimento si svolgeva distruggendo chimicamente le cellule

precedentemente uccise al calore, utilizzando enzimi che rimuovevano selettivamente

particolari componenti (proteine, polisaccaridi, acidi nucleici) e che in seguito venivano

iniettate nel topo insieme a batteri vivi del ceppo R.

Rimuovendo gli acidi nucleici il topo non moriva, ciò significava che il principio

trasformante era stato bloccato e che tale principio era rappresentato dal DNA, che

perciò racchiude le informazioni genetiche.

Hershey e Chase, 1952: Batteriofago T2, virus che infetta l’Escherichia coli, particella

infettiva formata da materiale genetico avvolto da un involucro proteico (capside).

Durante il ciclo infettivo il virus si attacca al batterio e inietta il suo DNA che si replica e

che induce la cellula batterica a sintetizzare proteine fagiche. Al termine la progenie

fagica uccide la cellula batterica e si riversa all’esterno.

La domanda che si posero Hershey e Chase era: l’informazione genetica del T2 è

composta da DNA o da proteine?

Utilizzarono così degli isotopi radioattivi di due diversi elementi per marcare proteine e

DNA: Isotopo per marcare le proteine

₃₅S:

◌ Isotopo per marcare gli acidi nucleici

₃₂P:

◌

Allevarono due diverse colture di fago, differentemente marcate, una con fosforo e

l’altra con zolfo.

Dalla coltura allevata con si liberavano particelle con DNA marcato, mentre dalla

₃₂P

coltura allevata con si liberavano con particelle con proteine del capside marcate.

₃₅S

In seguito le due popolazioni venivano messe separatamente ad infettare nuovi batteri

e omogeneizzando le cellule batteriche per far staccare il capside dalle cellule, si

notava che le cellule infettate con fagi con proteine marcate la radioattività si ritrovava

solo nel rivestimento esterno e la progenie era perciò priva di radioattività, mentre le

cellule infettate con fagi con DNA marcato presentavano una radioattività interna al

batterio e si ritrovava nella progenie fagica.

Ciò confermava che è il DNA e non le proteine a

trasmettere il materiale genetico.

In alcuni virus il materiale genetico è invece

racchiuso nell’RNA come ad esempio per il virus

del mosaico del tabacco, il coronavirus e il virus

dell’HIV.

Fraenkel e Conrat, 1957: Virus del mosaico del

tabacco, causa lesioni alle foglie di tabacco,

hanno nucleo di RNA rivestito da subunità

Figura 2: Coronavirus proteiche (capside). Venivano create particelle

ibride con subunità proteiche di un ceppo (B) e con l’RNA di un altro ceppo (A). In

seguito ad infezione presentava caratteristiche del ceppo A. 2

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

Gli acidi nucleici nucleotidi, base

Gli acidi nucleici sono DNA e RNA. Sono polimeri di monomeri formati da

azotata, zucchero gruppo fosfato.

uno a cinque atomi di carbonio e un acido ribonucleico,

L’RNA è chiamato acido

mentre il DNA è chiamato

Desossiribosio, C 2¹ Ribosio, C 2¹ desossiribonucleico per via del tipo di

zucchero che contengono. Il DNA

desossiribosio

contiene il mentre l’RNA

C C ribosio.

contiene il Gli atomi di

carbonio all’interno dello zucchero

H OH sono numerati da 1 a 5 con (¹).

Ribosio e desossiribosio differiscono

solo per un atomo di ossigeno a livello

del carbonio 2¹.

Un’altra differenza tra i due acidi nucleici è a livello delle basi azotate.

purine pirimidine,

Le basi azotate sono anelli azotati e si dividono in e le purine sono

formate da un doppio anello e sono adenina e guanina, mentre le pirimidine sono

formate da un anello singolo e sono timina, citosina e uracile.

Nel DNA le basi azotate sono citosina-guanina e adenina-timina, mentre nell’RNA al

posto della timina è presente l’uracile.

Anche nelle basi azotate gli atomi di carbonio sono numerati, da 1 a 9 nelle purine e da

1 a 6 nelle pirimidine. La numerazione non presenta appendice per distinguerla da quella

degli zuccheri. Nucleoside Nucleotide

Zucchero + base= Nucleoside + fosfato =

La base azotata si lega al carbonio 1¹ dello Gruppo fosfato

legame covalente,

zucchero attraverso un mentre

il gruppo fosfato si lega al carbonio 5¹ mediante un

legame estere .

1 O-

I diversi nucleotidi dell’ossatura carboniosa del DNA

sono perciò uniti dal gruppo fosfato che forma O- P O

legami covalenti (molto forti) in prossimità del

carbonio 5¹ dello zucchero del proprio nucleoside

e a livello del gruppo OH in 3¹ di un altro nucleotide. O-

La catena nucleotidica ha una polarità e procede

in direzione 5¹-3¹, ad un’estremità del filamento si

trova infatti un gruppo fosfato libero ed all’altra un gruppo OH libero.

Watson e Crick

Nel 1953 furono i primi a fornire informazioni dettagliate sulla struttura a

doppia elica del DNA, per cui vinsero il premio Nobel nel 1962 insieme a Chargaff che

svolse invece un’analisi sulla quantità di basi azotate nei diversi organismi, provando che

in tutti i diversi DNA la quantità di adenina è uguale alla quantità di timina mentre la

quantità di citosina è uguale alla quantità di guanina ed esiste perciò un rapporto

purina-pirimidina. diffrazione del DNA ai raggi X

Basandosi anche sugli studi di svolti da Wilkins e Franklin

che provavano che il DNA è organizzato in filamenti paralleli e substrutture

periodicamente ripetute, Watson e Crick svilupparono il famoso modello che valse loro

il Nobel.

Il modello mostrava come i filamenti paralleli di DNA si avvolgono in un’elica destrorsa

(da sinistra a destra), ovvero in senso orario. Da tale modello si ricavò l’attuale struttura:

1 Legandosi ad un altro zucchero all’interno dell’ossatura carboniosa, il gruppo fosfato forma un legame

fosfodiesterico, ovvero è legato a due molecole di zucchero attraverso due legami esterei. 3

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

Il DNA è composto da un’ossatura zucchero-fosfato esterna con basi perpendicolari alla

struttura ed interne ad essa, legate da legami H, con coppie di basi distanti 0,34 µm.

Ogni giro completo contiene 10 coppie di basi ed aveva una lunghezza di 3,4 µm. I

filamenti hanno senso opposto e sono perciò antiparalleli.

All’interno dell’ossatura le basi azotate formano legami H, facili da rompere, formando

coppie complementari. L’adenina forma un doppio legame con la timina mentre la

citosina forma un triplo legame con la guanina.

Forme alternative di DNA:

Esistono diverse forme di DNA:

A-DNA: si può osservare solo a bassa umidità e alte concentrazioni saline, ha elica

◌ destrorsa e contiene 11 coppie di basi per giro;

B-DNA: si trova in condizioni fisiologiche (alta umidità) ed è la forma principale.

◌ Ha elica destrorsa e 10 coppie di basi per giro.

Z-DNA: ha elica sinistrorsa, sono presenti molte regioni ricche di citosina-guanina

◌ e ha 12 coppie di basi per giro.

Struttura dell’RNA:

Ha singola catena polinucleotidica, zucchero desossiribosio, uracile al posto della timina

e polarità 5¹-3¹. Assume strutture secondarie ripiegandosi su sé stesso tramite

appaiamento di basi.

I cromosomi

Il DNA è organizzato nelle cellule in cromosomi, una struttura di DNA altamente

condensato su strutture proteiche. Il cromosoma rappresenta per tutte le specie la sede

del genoma, ovvero l’insieme del materiale genetico. Nelle diverse specie cambia però

il numero di cromosomi, per la specie umana sono 46.

Cromosomi procarioti: le cellule procariotiche, ovvero le cellule batteriche,

◌ hanno un singolo cromosoma, formato da una molecola di DNA circolare a

monoploidi.

doppia elica, il genoma si trova in singola copia e sono perciò definiti

nucleoide

Il DNA ha struttura densa, viene chiamato e si trova in una zona ben

distinta del citoplasma. Alcuni batteri hanno il genoma suddiviso in due o più

molecole circolari o lineari. La lunghezza del DNA batterico è di 1mm, 1000 volte

superiore alla grandezza della cellula.

Il DNA perciò si compatta in una forma condensata, associandosi a proteine. La

molecola circolare si avvolge e si ripiega su un nucleo proteico centrale, alcuni

topoisomerasi girasi

enzimi come la e la fungono da catalizzatore per

l’avvolgimento. Il DNA superavvolto forma poi anse a cui partecipano proteine

HU.

basiche (con carica + e pH neutro), la più diffusa è la proteina

Nella cellula batterica dell’Escherichia coli ogni ansa contiene circa 10mila

nucleotidi per un totale di 400 anse. Le anse si irradiano ognuna a partire da un

nucleo proteico centrale formato da diverse proteine, ogni ansa è perciò

indipendente dalle altre.

Cromosomi eucarioti: i cromosomi sono racchiusi nel nucleo, sono formati da una

◌ doppia elica di DNA lineare che si estende da un’estremità all’altra del

cromosoma. Le cellule eucariotiche possiedono due copie del loro genoma e

diploidi.

quindi dei cromosomi (23 coppie per l’uomo) e sono infatti dette cellule

Lo stato di condensazione del DNA varia a seconda delle fasi del ciclo in cui si

trova la cellula. Nelle cellule che non si stanno dividendo il DNA è presente in

filamenti dispersi nel nucleo sotto forma di cromatina, ovvero un insieme di DNA,

proteine e una piccola parte di RNA. proteine non

Le proteine presenti nella cromatina sono di due differenti tipi:

istoniche istoni.

e Gli istoni sono proteine basiche, perciò con carica positiva, che

hanno un ruolo nell’impacchettamento del DNA avente carica negativa. Queste

proteine istoniche sono: H1, H2a, H2b, H3, H4. 4

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

Le proteine non istoniche sono proteine acide cioè con carica negativa, sono

eterogenee e variano a seconda delle fasi di vita della cellula, svolgono funzioni

durante fasi come replicazione, trascrizione e regolazione dell’espressione dei

geni. La cromatina assume diversi gradi di

condensazione in base alla fase del ciclo

cellulare in cui si osserva. Durante l’interfase la

cromatina è sciolta e non vi è presenza dei

cromosomi. Durante la divisione cellulare invece

la cromatina è più condensata e i cromosomi

sono ben definiti e separati.

La cromatina in

interfase appare

Figura 4: Forma distesa della cromatina come una collana di

perle unite da un filo

nucleosomi linker.

sottile, le perle sono dette e il filo E’ la forma

più distesa ed ha diametro di 11µm.

Il nucleosoma è il primo livello di organizzazione della cromatina

ed è formata da:

8 proteine istoniche:

◌ 2 H1

- 2 H2a

- 2 H2b

- 2 H3

- 2 H4

-

146 coppie di nucleotidi di DNA superavvolto che

◌ ¾

compie un giro e sull’ottamero

La lunghezza del linker può variare da cellula a cellula.

Nel secondo livello di condensazione l’istone H1 si lega al linker

fibre,

e avvicina i nucleosomi creando le nel terzo livello

proteine non istoniche formano l’impalcatura (scaffold) su cui

anse

la fibra si condensa formando indipendenti. Figura 3: Livelli di

Il livello più condensato è quello del cromosoma. condensazione

Porzioni specializzate del cromosoma:

Nel cromosoma metafasico il DNA replicato è formato da due doppie eliche dette

cromatidi fratelli, uniti in prossimità del centromero.

centromero

Il è una sequenza

di nucleotidi specifici che

vengono riconosciuti da

proteine centromeriche che

fanno da ponte con le fibre

del fuso mitotico.

Nel cromosoma umano il

centromero è formato da 171

coppie di basi, è detta

sequenza satellite alfa e si

ripete 5mila-15mila volte.

telomeri

I sono invece regioni

terminali dei cromosomi

formate da sequenze nucleotidiche ripetute che hanno la funzione di impedire che le

estremità dei cromosomi vengano degradate o che estremità di cromosomi diversi si

uniscano tra di loro, facilitando inoltre la replicazione di DNA all’estremità senza subire

una perdita di materiale Figura 5: Ansa T

5

LUCIA GIULINI APPUNTI GENETICA

genetico. Il telomero cambia sequenza e numero di ripetizioni nelle differenti specie, nei

TTAGGG

vertebrati e perciò nell’uomo la sequenza è e viene ripetuta 500-3mila volte.

3¹ protundente.

All’estremità dei telomeri il DNA è a filamento singolo e viene chiamato

anse T,

Il DNA telomerico inoltre forma l’estremità 3¹ protundente si ripiega all’indietro

invadendo la regione telomerica a doppio filamento e appaiandosi con la regione

complementare, allontanando il filamento che in origine era appaiato.

POT1

La proteina protegge il filamento che è stato allontanato mentre complessi proteici

TRF1 TRF2

come e si associano alle anse T stabilizzando la struttura.

La replicazione del DNA

Il DNA all’interno della cellula deve potersi

replicare ogni volta che la cellula si divide.

Il processo deve essere preciso, poiché devono

crearsi due doppie eliche identiche l’una all’altra

e alla doppia elica parentale, inoltre deve essere

un processo molto veloce vista la moltitudine di

nucleotidi presenti nel genoma dei diversi

organismi. Ad esempio nell’E. coli la replicazione

avviene alla velocità di 1000 nucleotidi al secondo.

Il modello di Watson e Crick aveva già in passato

suggerito come durante la replicazione del DNA

ognuno dei due filamenti parentali serve da

stampo per dare origine a un filamento

complementare.

Questo tipo di replicazione è detta

semiconservativa poiché ciascuno dei due

filamenti originati conserva uno dei due filamenti Figura 6: Replicazione

della doppia elica parentale.

Oltre al modello di Watson e Crick furono proposte

replicazione conservativa dispersiva.

altre alternative ovvero la e quella Il modello della

replicazione dispersiva prevedeva la frammentazione del DNA e il riassemblamento

casuale dei frammenti dopo la replicazione.

Il modello conservativo

prevedeva che i due filamenti

parentali dopo aver

funzionato da stampo si

riassociassero, in modo da

originare una doppia elica

composta da filamenti

parentali e una doppia elica

composta esclusivamente da

filamenti appena sintetizzati.

La prova che confermò il

modello semiconservativo fu

l’esperimento di Meselson e

Sthal. Questi due studiosi

decisero di distinguere i

filamenti parentali da quelli

neosintetizzati attraverso due Figura 7: Modelli di replicazione

isotopi dell’azoto: ovvero

₁₄N

l’isotopo comune e N₁₅ ovvero l’isotopo più pesante e più raro, contenente