Fisiologia Genetica, prof. Becchetti

Fisiologia generale anno accademico 2017-2018

Omeostasi

Si intende la stabilità dell’ambiente interno:

• T=37°C
• pH = 7,4 +/- 0,4. Nelle cellule il pH è più variabile rispetto al sangue
• Osmolarità: 300 mOsm
• Molarità dei principali ioni
• Glicemia: 4mM
• O / CO₂

Concentrazioni extracellulari dei principali ioni

Il bicarbonato è la forma principale in cui la CO₂ è trasportata nel sangue. La conversione di anidride carbonica in bicarbonato è catalizzata dalla Anidrasi Carbonica.

Concentrazioni intracellulari dei principali ioni

I termoregolatori sono organismi che tengono costante la propria temperatura interna in un certo intervallo di temperatura esterna. I termoconformatori sono organismi che adattano la propria temperatura in relazione a quella esterna.

Tipi di organismi

• Endotermi: organismi capaci di produrre calore endogenamente
• Omeotermi: organismi a temperatura costante
• Pecilotermi: organismi a temperatura variabile
• Ectotermi: organismi che si scaldano attingendo da fonti esterne

Diffusione semplice

È determinata dalla agitazione termica delle molecole che percorrono un cammino aleatorio. In media le molecole restano interne alla loro posizione iniziale secondo la legge:

\( = 2Dt \)

Dove con D si indica il coefficiente diffusionale.

La proporzionalità non è diretta poiché essendo x la diffusione risulta sempre più lenta all’aumentare della distanza; un raddoppio della distanza equivale ad una quadruplicazione del tempo di diffusione. Questo implica che molecole piccole e per brevi spazi abbiano una efficiente diffusione. Nella diffusione semplice di molecole apolari non c’è uno spostamento lungo una direzione preferenziale. La diffusione semplice non prevede l’azione di una forza esterna ma i movimenti sono dettati solo da fattori statistici. Grosse molecole come proteine o acidi nucleici diffondono con molta difficoltà poiché risentono meno dei moti di agitazione termica, a livello cellulare la diffusione semplice risulta essere abbastanza efficace. Non è assolutamente efficace per dimensioni che superano il centimetro.

Flusso

Il flusso è un vettore in 3 dimensioni tuttavia ci interessa solo la sua componente perpendicolare alla superficie biologica considerata. La densità di flusso (J) si misura in mol/A*t.

I Legge di Fick: \( J = -D \cdot \frac{\Delta C}{\Delta x} \)

Il flusso ha segno positivo se segue le x in ordine crescente e nella direzione in cui [C] diminuisce. Per concentrazioni uniformi J=0. In una membrana cellulare la dimensione della membrana stessa non influenza troppo la diffusione ed il flusso procede in modo lineare. Tuttavia, dato che la membrana è lipidica, il coefficiente diffusionale va riferito alla membrana stessa e non al mezzo acquoso. Se la molecola è apolare nella membrana la sua concentrazione sarà maggiore di quella esterna. Se la molecola è polare la sua concentrazione nella membrana sarà inferiore a quella esterna.

Si riadatta quindi la Legge di Fick:

\( J = -P \cdot \Delta C \)

Dove K_p rappresenta il Coefficiente di Partizione in relazione al mezzo in cui la molecola entra. Definiamo la permeabilità come: \( P = \frac{D \cdot Kp}{\Delta x} \). Risulta: \( J = -P \cdot \Delta C \)

Si nota come il flusso dipenda solo dalla differenza di concentrazione poiché D_m e K_p sono coefficienti propri della molecola mentre \(\Delta x\) è lo spessore della membrana attraversata. In organismi privi di sistema circolatorio si necessita di una superficie corporea molto sottile e piccola per far avvenire la diffusione dei gas respiratori.

Grafico di Collander

Acqua e anidride carbonica nonostante la loro bassa K_p hanno una alta permeabilità. In generale una molecola che instaura ponti-H ha difficoltà a diffondere nelle membrane. La permeabilità all’acqua è importante per ragioni osmotiche collegate alle proprietà colligative. Tuttavia, il flusso d’acqua per osmosi è superiore a quello calcolato attraverso la legge di Fick. Si pensa che il contributo maggiore sia dato dagli urti delle molecole del soluto che richiamano a loro volta altra acqua.

Pressione osmotica

\( \pi = i \cdot \text{[soluto]} \cdot R \cdot T \)

La pressione osmotica si calcola come: \( \pi = \text{[soluto]} \cdot R \cdot T \)

Le soluzioni biologiche possono raggiungere una \(\pi\) di 7 atm. La pressione osmotica è direttamente proporzionale alla concentrazione molare di molecole molto diluite nel mezzo così da non avere interazioni di disturbo:

La pressione osmotica si trova anche come: \( \pi = \chi \cdot C \cdot R \cdot T \) dove \(\chi\) = coefficiente osmotico.

Per il grosso delle componenti ematiche o dei fluidi, a concentrazioni fisiologiche il coefficiente osmotico è approssimabile a 1. Quindi per semplicità la pressione osmotica è espressa in termini di concentrazione di soluto dato che in organismi omeotermi T resta approssimativamente costante.

1 Osmolare: soluzione che ha la stessa pressione osmotica di una soluzione 1M di un non-elettrolita. In condizioni ideali tutte le soluzioni con lo stesso numero di molecole disciolte hanno la stessa osmolarità. È per questo che una soluzione 1M di sali binari risulta 2 Osm mentre una soluzione 1M di Glc risulta 1 Osm. Una cellula può essere disturbata da una soluzione, seppur iso-osmolare, a causa delle diverse concentrazioni degli ioni.

Dunque, l’osmolarità è definita in base alla misura effettuata con un osmometro ideale. Soluzioni isosmotiche esercitano la stessa pressione osmotica del sistema a cui ci si riferisce. Se una soluzione esercita una pressione osmotica minore dell’altra viene detta iposmotica, viceversa è detta iperosmotica.

Tonicità

La tonicità è invece definita sulla base della risposta cellulare alla soluzione. Una soluzione è isotonica se non provoca sostanziali alterazioni del volume cellulare. Se la cellula si idrata e gonfia la soluzione è ipotonica (ma non necessariamente iposmotica). Se la cellula si disidrata e collassa la soluzione si dice ipertonica.

Reazione dell'eritrocita

CO₂ + H₂O → HCO₃^- + H⁺ e questa reazione è catalizzata dalla Anidrasi Carbonica. Il bicarbonato si forma nel globulo rosso e poi viene espulso nel plasma. L’eritrocita scambia bicarbonato con il cloro del plasma senza consumo di ATP. Questo è quindi un trasporto passivo.

Diffusione facilitata

Per molti metaboliti l’ingresso nella cellula è legato alla presenza di trasportatori proteici, tuttavia la direzione del movimento è ancora legata alla osmolarità delle soluzioni.

Trasportatori del glucosio

Il glucosio è trasportato attraverso diversi canali GluT. Il trasportatore per casi statistici può rivolgere il sito di legame all’esterno o all’interno e una volta legato Glc rilasciarlo secondo gradiente. Il glucosio è poi sottratto intracellularmente per fosforilazione. Si può scrivere un equilibrio:

Il flusso iniziale di glucosio è sostanzialmente unidirezionale poiché non ci sono concentrazioni apprezzabili di glucosio libero all’interno della cellula. Il trasporto facilitato non segue l’andamento di Fick come per la diffusione semplice poiché il glucosio trasportato dipende dal numero di GluT presenti in membrana. Si tende quindi ad un Jmax con la progressiva saturazione dei trasportatori. Inoltre, i trasportatori riconoscono con alta specificità il loro metabolita, GluT non trasporta fruttosio, galattosio o G6P.

Si ricava quindi la seguente legge: \( J = \frac{J_{Max} \cdot [Glc]}{K_{0.5} + [Glc]} \) dove K_0.5 è la concentrazione di glucosio per cui: \( J = \frac{1}{2} J_{Max} \). Questa equazione è valida se il flusso in uscita non è apprezzabile come in miociti o neuroni. Gli epatociti, a differenza, possiedono una non indifferente fuoriuscita di glucosio dato che presiedono al controllo della glicemia del sangue.

Tipi di GluT(n)

• GluT1: Tipicamente degli eritrociti. Ha una K_0.5 = 1.5 mM per il D-Glc, esso non riconosce quasi per nulla il L-Glc la cui K_0.5 è 3mM.
• GluT2: Di epatociti e enterociti, ha una K_0.5 di 7mM quindi il fegato ha una bassa affinità per il glucosio e lo lascia disponibile per gli altri organi. Si nota come per valori glicemici normali l’attività di GluT2 sia scarsa. Il neurone invece capta di più il glucosio grazie al suo trasportatore GluT3.
• GluT3: Si trova nei neuroni. Ha una K_0.5 di 1.8mM.
• GluT4: Si trova in miociti e adipociti. Ha una K_0.5 di 5mM. Ha una affinità minore dei neuroni poiché le cellule adipose hanno delle scorte energetiche.

Trasporti attivi

Trasporti attivi primari

Generalmente i trasporti attivi sono usati per portare molecole contro gradiente attraverso l’idrolisi di ATP. Si dividono in primari, dove il trasportatore ha attività chinasica, e secondari, dove la ATP è utilizzata indirettamente. Un altro metodo di classificazione si basa sulla direzione e numero di molecole trasportate: uniporto, simporto (cotrasporto) e antiporto (scambiatore).

Pompe ioniche

Le pompe ioniche usano ATP per trasportare ioni contro gradiente. In quasi tutte le cellule si esprimono le seguenti pompe:

• Pompa Ca²⁺: si trovano diverse isoforme su plasmalemma e sulle membrane degli organelli. Estrudono il calcio usando ATP. Le pompe degli organelli pompano Ca²⁺ nel lume sottraendolo al citosol. Extracellularmente [Ca²⁺] = 2mM mentre nel citosol [Ca²⁺] = 2nM. Il calcio totale della cellula tuttavia è di più poiché si trova spesso complessato a proteine o altre molecole.
• Pompa Na⁺/K⁺: a ogni ciclo di trasporto estrude 3Na⁺ per importare 2K⁺ con la spesa di 1ATP. Questa pompa è espressa nella quasi totalità delle cellule animali ma non nelle cellule vegetali. Questa pompa è formata da due subunità α che effettuano il trasporto associate a due subunità β accessorie.

Studi sulla pompa Na/K

• Avvelenamento da cianuro: CN è un veleno mitocondriale che agisce sui mitocondri a livello del complesso IV così da bloccare la produzione di ATP. Il flusso di Na⁺ rallenta in maniera graduale mentre togliendo il cianuro riprende a regimi fisiologici abbastanza rapidamente.
• Dipendenza da ATP: si parte da una condizione di scarica cellulare (blocco della sintesi di ATP con vari veleni). Le successive aggiunte di ATP stimolano temporaneamente la pompa fino a trovare per quale valore di concentrazione di ATP la pompa raggiunge la massima efficienza, si è trovato [ATP]=3mM.
• Effetto della Ouabaina: questo è un inibitore della pompa sul lato extracellulare poiché funge da ligando specifico. Quando un trasportatore scambia due componenti lo fa in modo accoppiato. La Ouabaina, che si ricava dalla Digitale purpurea, legandosi sul lato extracellulare blocca lo scambio.
• Modello eritrocita: si è usato per capire la stechiometria della pompa. La procedura prevede l’incubazione di giorni a 2°C per bloccare l’attività della pompa e permettere la libera diffusione di Na⁺ e K⁺. Successivamente si riporta a 37°C e si misura che Na:K = 3:2.

ATPasi P

• SERCA: acronimo di ATPasi sarco-reticolo endoplasmatico Ca²⁺ dipendente
• Pompa Na/K: le diverse subunità possono variare a seconda della cellula in cui la pompa è espressa
• Pompa H/K: responsabile dell’acidificazione del lume dello stomaco
• Pompa H: in cellule vegetali
• Pompa Ca: si trovano in due batterie diverse su due linee cellulari diverse
• Pompa Cu: servono a trasportare il rame, un utile cofattore metallico.

ATPasi V

Pompe protoniche che caricano di acidi gli ambienti contenuti in vacuoli, vescicole e altri organelli.

ATPasi F

Anche esse sono intracellulari e pompano protoni nei mitocondri. Sfruttano il gradiente protonico per sintetizzare ATP.

ATP Binding Cassette

Sfruttano l’energia di idrolisi di ATP per estrudere composti organici della cellula. Si trovano ad esempio nella barriera ematoencefalica.

Trasporti attivi secondari

Si distinguono da quelli primari poiché in questo caso il trasportatore attivo di membrana sfrutta un gradiente favorevole, solitamente di sodio, per trasportare contro gradiente un’altra molecola. Na⁺ ha infatti una forte tendenza ad entrare nella cellula.

Alcuni esempi sono:

• Sodio in – Aminoacido in
• Sodio in – Protone out (antiporto per liberare la cellula dal carico acido)
• Sodio in – Glucosio in
• Sodio in – Calcio out (utile nelle risposte muscolari)

Il trasportatore dissipa gradienti e quindi la cellula, utilizzando ATP, ne ripristina il giusto equilibrio. Si chiamano “secondari” perché la cellula per sostenere questo trasporto utilizza ATP in un sito secondario (diverso) da quello in cui avviene il trasporto.

Trasportatore aminoacidi

Come sempre il trasporto non è infinito. Con questo metodo la cellula può concentrare l’alanina fino a 10 volte la sua concentrazione extracellulare. Questo ordine di grandezza (10x) è determinato dalla concentrazione di sodio, dato che viene trasportato insieme alla molecola.

Trasportatore glucosio

È presente negli enterociti dell’epitelio intestinale in cui il trasporto è transcellulare e mai paracellulare. Gli enterociti sono uniti da tight junction. Durante la digestione nell’intestino c’è una alta concentrazione di glucosio. Gli enterociti esprimono questi trasportatori secondari che sfruttano il sodio abbondante nel lume intestinale per internalizzare il glucosio.

SGLT1: trasportatore Sodio-Glucosio 1. Mantiene una alta concentrazione di glucosio nel citosol che infatti non è fosforilato perché deve essere subito veicolato nel circolo sanguigno.

Il sodio non può accumularsi troppo perché essendo uno ione il potenziale di membrana della cellula dopo un po’ ne bloccherebbe il passaggio. La cellula trasferisce quindi insieme al sodio il suo controione cloruro per bilanciare le cariche, l’assorbimento dalla dieta di sodio deve essere accompagnato quindi dall’assorbimento contemporaneo di un controione.

Antiporto Na/H

I trasportatori hanno il 50% di possibilità di esporre il sito di legame per il sodio (N) o il sito di legame per i protoni (H) o all’interno o all’esterno della membrana. Dato che il sodio è abbondante extracellularmente i siti N extracellulari saranno saturi. Mentre i protoni sono in genere poco abbondanti da entrambi i lati e quindi i siti H sono meno facilmente saturi. Quello che influenza lo stato di legame dei trasportatori è solo la concentrazione di Na⁺ e H⁺. Solo il trasportatore che ha contemporaneamente saturi N e H può determinarne l’inversione e il rilascio degli ioni. L’estrusione di protoni è quindi favorita dal fatto che la concentrazione di sodio esterna è molto maggiore di quella interna.

Trasportatore elettroneutro

Trasportatore che scambia pari quantità di cariche elettriche. Alcuni esempi sono sodio/protoni e bicarbonato/cloruro.

Trasportatore elettrogenico

Trasportatore che muove una carica netta intera e che quindi genera corrente. Un esempio può essere la pompa Na/K o il trasportatore del glucosio degli enterociti.

Potenziale di membrana

Potenziale di membrana: per cellule muscolari. Gli astrociti della glia sono cellule altrettanto cariche.

\(V_m = -70\) mV.

Potenziale di riposo

Indica il potenziale che una cellula esprime quando non è attiva:

• Cellule eccitabili si iperpolarizzano (miociti, neuroni …)
• Cellule non eccitabili si possono depolarizzare ma non si iperpolarizzano (epatociti, enterociti …)

In una cellula il potenziale elettrico all’interno della membrana plasmatica è negativo, all’esterno è positivo. Una cellula in coltura in laboratorio ha un potenziale molto basso intorno a -20mV. La membrana plasmatica si comporta come un condensatore \(Q = CV\) dove la capacità di membrana è circa 1μF/cm².

Agli inizi del 1900 si iniziò a dare interpretazione del potenziale e della capacità di membrana. Fin dall’inizio si osservò che il potenziale era molto sensibile alle variazioni di potassio extracellulare. Questo fenomeno suggerì che il V_r di una cellula fosse in diretta relazione con le concentrazioni di potassio, intracellulare maggiore di quella extracellulare. Si considera quindi una proteina integrale che fa passare solo potassio e quindi per diffusione semplice si forma un flusso netto in uscita di potassio fino al raggiungimento di una situazione di equilibrio. Il movimento del solo potassio (carica +1) provoca uno squilibrio di cariche che stabilisce un ΔV che ostacola l’ulteriore flusso dello ione: l’esterno si carica positivamente mentre l’interno resta caricato negativamente.