Fisiologia generale - potenziale d'azione

Na+ e che la corrente tardiva uscente è dovuta agli ioni K+.

Figura: La corrente transmembranaria registrata durante una depolarizzazione stazionaria della membrana mostra

tipicamente tre fasi: 1) corrente capacitiva della durata di 20-50 μs diretta verso l’esterno, dovuta alla scarica del

condensatore di membrana; 2) corrente transitoria in ingresso della durata di circa 1-2 ms; 3) corrente ritardata in uscita

che permane per tutta la durata della depolarizzazione.

Figura: gli esperimenti del blocco del voltaggio permettono di registrare l'andamento temporale delle correnti ioniche

durante un potenziale d'azione. (A) in questo esperimento, il potenziale di membrana d un assone gigante di calamaro

era bloccato a un valore di +60mV per un tempo di almeno 5 ms. (B) La traccia a mostra la corrente transmembrana

totale registrata in risposta al blocco del voltaggio illustrato in A; questa corrente è trasportata sia da ioni Na+ che K+.

La traccia b mostra la corrente trasportata solo dal K+, registrata in un mezzo povero di Na+ in condizioni di blocco del

voltaggio tali che Vm=E(Na). In tali condizioni, la corrente di sodio I(Na) è uguale a 0, data l'assenza di una fem agente

sugli ioni Na+. (C ) Sottraendo la traccia b alla a, è possibile evidenziare l'andamento temporale di I(Na). [Adattato da

Hodgkin e Huxley, 1952].

Hodgkin e Huxley dimostrarono che la rapida corrente iniziale diretta verso l'interno è dovuta all'entrata di ioni sodio

attraverso la membrana. I 2 bloccarono il voltaggio al valore del potenziale di equilibrio di Na+, un valore al quale non

vi è alcuna fem agente sugli ioni Na+, infatti Vm – E(Na) = 0. In più ridussero la concentrazione extracellulare di Na+

sostituendo NaCl con cloruro di colina in acqua di mare dove era immerso l'assone. Quando, in queste condizioni, il

potenziale veniva portato a E(Na), la corrente entrante non era più misurabile ma era presente una corrente tardiva

diretta all'esterno (traccia b della figura sopra). Esperimenti successivi dimostrarono che la corrente tardiva è associata

all'uscita di ioni potassio. Riportando l'assone in condizioni di normale concentrazione di sodio, la corrente precoce

entrante ricompariva, indicando che la sua origine è dovuta a un transitorio ingresso di ioni Na+ nella cellula. Quando la

componente tardiva della corrente viene sottratta alla corrente totale, il risultato è il profilo temporale della corrente

entrante trasportata dal Na+. Questi esperimenti condussero alla formulazione dell'ipotesi che un'improvvisa

depolarizzazione provochi la breve apertura di un numero significativo di canali selettivi per Na+ inducendo un

aumento della conduttanza di questo ione attraverso la membrana tale da permettergli di fluire verso l'interno

dell'assone. In un mezzo extracellulare normale, il gradiente elettrochimico che agisce su Na+ (Vm – E(Na)) dovrebbe

spingere gli ioni sodio ad entrare nella cellula. Così in accordo con la legge di Ohm, quando g(Na) aumenta, anche

I(Na) cresce: I(Na) = g(Na) * (Vm – E(Na))

Identificando le componenti del Na e del K nella corrente registrata in blocco del voltaggio si determina la dipendenza

di gNa e gK dal tempo e da Vm: gNa = I(Na)/(Vm-ENa) gK = I(K)/(Vm-EK)

Una importante proprietà di I(Na) è che anche quando Vm viene tenuto costante ad un valore di depolarizzazione, I(Na)

raggiunge un massimo in 1 ms per poi ritornare rapidamente al suo valore antecedente lo stimolo. Risulta pertanto che

I(Na) e dunque g(Na), deve scaturire da 2 processi distinti: un attivazione (aumento nel tempo di g(Na) dovuto alla

depolarizzazione) e una inattivazione (ritorno nel tempo della g(Na) al suo livello di base).

Con la tecnica del blocco del voltaggio Hodgkin e Huxley arrivarono alla conclusione che ciascuna corrente ionica

fosse il risultato dell'attivazione di una distinta conduttanza di membrana selettiva per un particolare ione. A partire da

questi dati, giunsero alla formulazione di equazioni per poter esprimere ogni conduttanza in funzione del tempo e Vm.P

Canali voltaggio-dipendenti per il Sodio: La localizzazione e le caratteristiche dei canali voltaggio-dipendenti sono

state facilitate dalla disponibilità di alcune neurotossine naturali che si legano in modo specifico ai diversi canali. Tra

queste, la Tetrodotossina TTX blocca selettivamente i canali voltaggio-dipendenti rapidi per il Na+. Quando molecole

di TTX marcate radioattivamente vengono aggiunte al mezzo extracellulare, esse si legano ai canali per il Na+. L'esame

di neuroni marcati in questo modo ha permesso di fare una stima della densità delle molecole legate e quindi dei canali

in questione. in assoni amielinici di diversi neuroni sappiamo che la densità dei canali per il sodio Na+ equivale a circa

500 per micrometro quadrato. Quindi occupano circa 1/100 dell'area totale della membrana. Si è quindi stimato che

attraverso ciascun canale possono passare 10^7 ioni Na+ al secondo. L'attività complessiva di migliaia di canali per

Na+, ciascuno dei quali fornisce una piccola corrente unitaria pulsatile, dà origine alla corrente macroscopica I(Na)

responsabile della fase ascendente del potenziale d'azione.

Patch-clamp: tecnica per registrare correnti da singoli canali. Una micropipetta con una punta di diametro intorno a 1-2

um viene posta a stretto contatto con la membrana cellulare e viene poi applicata una leggera suzione, in modo da

realizzare una saldatura molto stretta e caratterizzata da un'elevatissima resistenza tra la pipetta e la superficie cellulare.

Mediante questa tecnica si possono registrare correnti ioniche attraverso singoli canali di membrana mentre Vm in

quella regione è bloccato a valori predeterminati. Quando viene applicato uno stimolo (gradino di voltaggio)

depolarizzante, gli eventi registrati appaiono come correnti tutto-o-nulla aventi un profilo rettangolare che indica una

improvvisa apertura e chiusura del canale ionico sotto registrazione. Le correnti hanno un'ampiezza simile per singoli

canali che condividono una particolare selettività ionica e una data cinetica.

Il numero di canali che in ogni istante si trova in uno stato di apertura dipende dal tempo e dal valore di Vm. In questo

modo, le variazioni macroscopiche di gNa della membrana, che avvengono in funzione di Vm e del tempo, riflettono il

comportamento di migliaia di canali per il Na+, ciascuno dei quali si apre e si chiude durante la depolarizzazione

secondo certi principi probabilistici.

Inattivazione e deattivazione:

Il ritorno al valore di riposo della conduttanza, osservato in risposta alla ripolarizzazione della membrana si chiama

deattivazione. La diminuzione della conduttanza fino al valore di riposo durante la depolarizzazione si chiama

inattivazione. I canali del Na mostrano sia deattivazione che inattivazione, mentre quelli del K mostrano solo

deattivazione.

Separazione farmacologica delle correnti:

Le correnti di membrana possono essere separate farmacologicamente mediante l’uso di inibitori specifici: la

tetrodotossina (TTX) blocca la iNa e permette lo studio della iK; il tetraetilammonio (TEA) blocca la iK e permette lo

studio della iNa. Nella figura sopra la membrana era bloccata a 0 mV e le registrazioni di corrente venivano effettuate in

condizioni di controllo (A), in presenza di TTX (B) o di TEA (C). Nella figura a fianco sono mostrate, sovrapposte, le

correnti di membrana in condizioni di controllo (a) e in presenza di TTX (b) o TEA (c) a diversi potenziali di blocco.

In che modo la depolarizzazione di membrana influenza l'apertura dei canali ionici voltaggio-dipendenti?

Hodgkin e Huxley suggerirono che i cambiamenti nel potenziale di membrana potessero regolare g(Na) e g(K) per

mezzo di una modificazione conformazionale indotta in una particella o molecola (gate). Nello stato di riposo la

particella di attivazione e chiusa e quella di inattivazione è posizionata lontano dal poro (passaggio degli ioni). Quando

Vm è bloccato a un livello depolarizzato, la carica di apertura si muove in conseguenza del nuovo campo elettrico

attraverso la membrana, producendo una debole corrente di apertura Ig, e la barriera di attivazione del canale passa in

configurazione aperta. La corrente Ig è sovrapposta ad un iniziale corrente capacitativa Ic che fluisce attraverso la

membrana. Quando la maggioranza dei canali per il Na+ sono aperti, la corrente I(Na) in entrata raggiunge il suo

massimo. Persistendo la depolarizzazione, i canali aperti cominciano a chiudersi quando la particella di inattivazione si

sposta bloccando ogni canale aperto. Dopo che la membrana si è ripolarizzata, le cariche di apertura dei canali per il

Na+ si riorientano dando luogo ad un altra piccola corrente capacitativa. La particella di inattivazione si allontana dal

canale e la barriera di attivazione riporta il canale nel suo stato di riposo.

Selettività dei canali ionici: la selettività di un canale per uno ione si basa in parte sulle dimensioni ioniche in parte su

altre proprietà di specie diffusibili. Le cariche negative localizzate all'imboccatura esterna di un canale selettivo per i

cationi, come il Na+ e K+, attraggono i cationi e respingono gli anioni. I cationi più voluminosi, con un diametro

superiore a 4 A sono troppo ingombranti per passare attraverso i canali per Na e K. I cationi inferiori a 4A passano

tramite il poro ma solo dopo aver perso l'acqua di idratazione che circonda le specie cariche in soluzione. Gli ioni di

adeguata dimensione passano per il canale tanto più facilmente quanto più rapidamente l'ossigeno polare e i gruppi

carichi che rivestono il poro del canale sono in grado di sostituirsi all'acqua di idratazione.

Il potenziale d’azione: rappresentazione dell’andamento temporale delle variazioni di permeabilità al Na+ e al K+ in

relazione alle fasi del potenziale d’azione (figura sotto)

Figura: L’esempio mostra il comportamento del canale del Na In seguito ad uno step di Vm da –90 a –50 mV con Vr =

-60 mV, Ena = 40 mV.

g(channel) = ip/(Vp- ENa) = 1.5pA/90mV = 17 pS

Ψ(channel) = ip* N/F = 107 ioni/s

ΨT = 107 ioni/s * (0.7*10-3)s = 7000 ioni

Ciclo di Hodgkin: mette in relazione il potenziale di membrana e la conduttanza del sodio. E' un meccanismo a

feedback positivo tra la depolarizzazione della membrana e la conduttanza del sodio responsabile della fase ascendente

di un potenziale d'azione. Il ciclo è normalmente avviato da una depolarizzazione della membrana che proviene

dall'esterno del neurone indipendentemente dai canali voltaggio-dipendenti per il sodio. Il ciclo a feedback positivo

viene interrotto normalmente dal meccanismo intrinseco di inattivazione dei canali per il Na+, che pone termine alla

fase ascendente, oppure può essere interrotto durante un esperimento di blocco per il voltaggio.

Canali voltaggio-dipendenti per il K+: la probabilità di apertura di questi canali aumenta in condizioni di

depolarizzazione, anche se rispondono più lentam