Chimica Inorganica

Chimica Inorganica: Laboratorio

Cromatografia: (“scrittura a colori”)

E’ un metodo fisico di analisi che ci permette di ottenere la separazione dei costituenti di un

miscugliograzie alla migrazione differenziale dei componenti del miscuglio; la prima cromatografia

fu eseguita dal btanico Tswett che scoprì che in un estratto di foglie verde si trovano 6 pigmenti

diversi (2 clorofille e 4 carotedoni).

Fu definita come “la percolazione uniforme di un fluido attraverso una colonna di sostanza più o

menfinemente suddivisa, capace di ritardare selettivamente diversi componenti del fluido”

Cromatografia su colonna

Estratti da foglie verdi, furono depositati in testa ad una colonna in vetro contenente polvere di

CaCO3 (fase stazionaria, FS). Tswett fece passare all’interno della colonna una miscela di etere di

petrolio e etanolo (fase mobile, FM). La diversa affinità dei componenti gli estratti di foglie per il

CaCO3 fu alla base della loro separazione.

Principio: Due composti A e B vengono trasportati da una fase mobile (o eluente), a contatto con

una fase stazionaria, per la quale i due composti presentano affinità differente. Principio: Due

composti A e B vengono trasportati da una fase mobile (o eluente), a contatto con una fase

stazionaria, per la quale i due composti presentano affinità differente. I due soluti A e B si

ripartiscono tra le due fasi secondo un equilibrio descritto dalla grandezza K, detta coefficiente di

ripartizione:

Da una parte la FM tende a trascinare verso il basso A e B; dall’altra A e B possono interagire con

la FS e rimanervi “attaccati”. Cromatografia su colonna A Fase stazionaria AFM AFM BFM BFM KB

B La migrazione è differenziale se KA è diverso da KB . Maggiore è il valore di K, maggiore sarà

l’affinità dell’analita per la FS e più lentamente questo si muoverà rispetto all’eluente.

Cromatografia su strato sottile:

Questa metodologia, molto semplice ed economica, utilizza un sottile strato di fase stazionaria su

un vetro o una lastra di alluminio, sulla quale viene deposta la miscela da analizzare mediante un

capillare in vetro. La lastra viene poi posta in una camera di sviluppo contenente sul fondo la fase

mobile. Questa per capillarità sale lungo la lastrina trasportando i soluti della miscela che migrano

selettivamente nel loro cammino.

La sostanza da separare (in soluzione) viene depositata sulla lastra cromatografica tramite un

sottile capillare in vetro La lastra viene quindi inserita nella vaschetta cromatografica che contiene

sul fondo pochi cm di eluente

La separazione e l’identificazione dei componenti di una miscela può essere agevolmente fatta

sulla base del fattore di ritardo Rf. Rf è il rapporto tra la distanza percorsa dalla specie analizzata

(hA , linea rossa) e la distanza raggiunta dal fronte del solvente (heluente, linea blu).

Cromatografia liquido – liquido:

FM: liquido

FS: liquido che impregna un supporto solido

Cromatografia in fase normale (NPC)

• FM: un solvente o una miscela di solventi apolari o poco polari.

• FS: polare (acqua)

• Supporto: silice (SiO2 ), farina fossile, carta (in strato sottile o colonna).

Saranno trattenuti maggiormente i soluti POLARI: l’eluizione avviene in ordine di polarità crescente

(prima i composti meno polari meno affini alla fase stazionaria e poi via via quelli più trattenuti).

Cromatografia in fase inversa (RPC) • FM: un solvente o una miscela di solventi poco polari o

polari. • FS: apolare. E’ ottenuta legando chimicamente una FS liquida apolare al supporto •

Supporto: silice (SiO2 ) modificata chimicamente

Saranno trattenuti maggiormente i soluti NON POLARI o POCO POLARI: l’eluizione avviene in

ordine di polarità decrescente (prima i composti più polari meno affini alla fase stazionaria e poi via

via quelli più trattenuti)..

Cromatografia liquido – solido:

FM: liquido FS: solido, ad esempio cellulosa, allumina (Al2O3 ), ma soprattutto silice (SiO2 ) La

particella individuale di silice è una struttura porosa in cui gli atomi di silicio esposti all’esterno sono

legati a gruppi OH (silanoli). Questo impartisce polarità alla silice. silanoli Si-OH Meccanismo:

adsorbimento (le forze che legano i soluti alla superficie adsorbente possono essere varie, es.

forze di natura elettrostatica, legame a idrogeno…).

particelle di silice  = 50200 m con struttura porosa ( pori = 40100 nm) che viene attraversata

da eluente e analiti

Cromatografia a scambio ionico:

FM: soluzioni tampone

FS: resina a scambio ionico a carica positiva o negativa.

A seconda della carica della FS si ottiene la migrazione selettiva delle specie ioniche presenti

nella soluzione di carica opposta.

Se lo stirene usato nella reazione presenta gruppi carichi anche il polimero finale avrà gruppi

carichi

Ioni diversi contenuti in una miscela potranno essere separati in base alla loro carica (maggiore la

carica, maggiore interazione con la FS) e le loro dimensioni (ioni più piccoli avranno una maggior

densità di carica e quindi una maggiore interazione) Una miscela contenente, ad esempio, ioni

Na+ e ioni NO3 - fatta passare attraverso una:

Applicazione: analisi di miscele di amminoacidi o di proteine.

Agendo sul pH del tampone eluente si possono trasformare i gruppi –COOH e -NH2 in gruppi

carichi. Amminoacidi e/o proteine si possono quindi caricare positivamente o negativamente

Usando una resina a scambio cationico: i) amminoacidi o proteine cariche negativamente escono

velocemente. ii) amminoacidi o proteine cariche positivamente vengono trattenute parzialmente. iii)

amminoacidi o proteine con elevata carica positiva vengono fortemente trattenute. Ripetendo la

stessa procedura con una resina a scambio anionico ed agendo sul pH del tampone si effettua il

frazionamento delle proteine cariche negativamente

Cromatografia a esclusione dimensionale

FM: soluzione in cui sono contenuti gli analiti da separare FS: resina a porosità controllata

(poliacrilammide, polimeri di destrano o agarosio). Si tratta di una filtrazione su resine con pori di

dimensioni ben definite. Gli analiti si separano in base alle loro dimensioni: le molecole più piccole

( ) vengono rallentate di più; quelle grandi ( ) non sono trattenute dai pori della FS e corrono

velocemente verso l’uscita della colonna

Applicazione: separazione dei componenti di una miscela emoglobina – cianocobalamina

Emoglobina: metalloproteina coinvolta nel trasporto dell’O2 ; è marron ed ha un PM = 65000 Da

(u.m.a.) Cianocobalamina (vitamina B12) è coinvolta nella sintesi degli acidi grassi, nella

produzione di energia, nella sintesi del DNA, ecc.; è rosa ed ha un PM = 1350 Da (u.m.a.)

Emoglobina: metalloproteina coinvolta nel trasporto dell’O2 ; è marron ed ha un PM = 65000 Da

(u.m.a.) Cianocobalamina (vitamina B12) è coinvolta nella sintesi degli acidi grassi, nella

produzione di energia, nella sintesi del DNA, ecc.; è rosa ed ha un PM = 1350 Da (u.m.a.) Una

miscela emoglobina-vitamina B12 può essere separata usando colonnine SEC con limite di

esclusione a 60000 Da.

i) si deposita la miscela in testa alla colonnina; ii) si aggiunge il tampone di eluizione iii) si

raccolgono con provette le frazioni eluite (una ogni 5-10 gocce) Le frazioni 2 e 3 contengono

emoglobina (maggior PM), la 5 e la 6 la vitamina B12

HPLC Si tratta di una cromatografia su colonna in cui si raggiunge un’elevata efficienza utilizzando

una colonna ad impaccamento molto fine ed una pompa ad alta pressione per l’eluizione. Il flusso

in uscita dalla colonna viene monitorato in continuo per identificare in modo accurato le varie

frazioni, quantificarle e raccoglierle in modo separato.

Il risultato è un grafico tempo di eluizione vs. assorbanza (cromatogramma).

Cromatografia gas-liquido (GLC) FM: gas (carrier gas) FS: fase liquida distribuita/ancorata a

particelle di silice o alle pareti della colonna/particelle solide attivate (allumina, silice). La GLC

permette di effettuare analisi di miscele molto volatili. Operativamente il campione viene

vaporizzato all’interno di una colonna cromatografica e trascinato lungo essa da un gas inerte

(tipicamente He, N2 o Ar). Le colonne possono essere costituite da particelle impaccate, o

possono essere realizzate distribuendo o fissando chimicamente la fase stazionaria sulla parete

interna della colonna.

Elettroforesi

Sfrutta la diversa velocità di migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico

(a). E’ possibile sottoporre a elettroforesi molecole che possiedono gruppi o residui ionizzabili:

aminoacidi e proteine, nucleotidi e acidi nucleici. Diverse tecniche: la più classica prevede l’uso di

un supporto solido. FM: soluzioni tampone FS: carta, gel di agarosio, poliacrilammide, acetato di

cellulosa (lunghezza = 50-100 cm, spessore < 1 mm) Diverse tecniche: la più classica prevede

l’uso di un supporto solido. FM: soluzioni tampone FS: carta, gel di agarosio, poliacrilammide,

acetato di cellulosa (lunghezza = 50-100 cm, spessore < 1 mm) (b) Gli analiti carichi positivamente

si muoveranno verso il catodo (-), quelli carichi negativamente verso l’anodo (+)

Non è una cromatografia, ma è pur sempre una tecnica di separazione… La velocità di migrazione

di una molecola carica dipende da: • campo elettrico applicato; • caratteristiche della molecola

quali massa, carica, dimensioni e forma; • tipo di supporto utilizzato per eseguire le separazione (il

gel impone una certa resistenza al moto delle molecole di grandi dimensioni).

L’elettroforesi su gel prevede che (a) la miscela da separare sia caricata sul supporto preparato a

base di agarosio o poliacrilammide e quindi si applichi una tensione. Dopo un tempo variabile

(anche ore) si avrà la separazione…

Se gli analiti non sono colorati sarà necessario rivelarli in qualche modo

Applicazioni:

Separazione di pigmenti:

Le foglie verdi dei vegetali contengono sostanze colorate, pigmenti, le cui molecole presentano dei

gruppi cromofori che assorbono luce visibile.

Le foglie di spinaci vengono triturate per favorire il processo di estrazione dei pigmenti, effettuato

con acetone (i pigmenti sono solubili in solventi organici polari). La cromatografia su strato sottile

(TLC) viene usata per separare i pigmenti presenti negli spinaci, come -carotene e clorofille.

Su un sottile strato di fase stazionaria (gel di silice) su un vetro o una lastra di alluminio viene

deposta la miscela da analizzare mediante un capillare in vetro. La lastra viene poi posta in una

camera di sviluppo contenente sul fondo la fase mobile. Si usano eluenti a polarità crescente,

costituiti da n-esano ed acetato di etile in differenti rapporti (2:1, 3:2, 1:1, 2:3 in volume)