Chimica farmaceutica e tossicologia 1

Sulfamidici

I sulfamidici sono i primi antibatterici usati per via sistemica. Furono scoperti da Gerhard Domagk nel 1932, data che segnò l’inizio della moderna chemioterapia antinfettiva. Il nome dei sulfamidici deriva dalla porzione sulfamidica che è la parte attiva della molecola. Il primo sulfamidico utilizzato fu la sulfamidocrisoidina, un derivato azoico di colore rosso commercializzato come colorante (nome commerciale Prontosil rubrum). Questa è attiva in vivo ma non in vitro: si rivelò essere un profarmaco ovvero una molecola che, dopo fissione riduttiva per biotrasformazione, si scindeva in 1,2,4 triaminobenzene e sulfanilamide, quest'ultima dotata di attività antibatterica.

La sulfanilamide (incolore) fu commercializzata (come Prontosil album, una sostanza incolore) nel 1935.

Meccanismo d'azione

La sulfanilamide, come tutti i sulfamidici, inibisce competitivamente la diidropteroato sintetasicon l’acido p-DHPS, un enzima che catalizza la condensazione della 7,8-diidropterina pirofosfato con l’acido 7,8 diidropteroico. Questa azione è dovuta all’analogia strutturale della sulfanilamide con il PABA. È importante dire che a pH 7.4 il PABA prevale come specie anionica mentre la sulfanilamide prevale come specie neutra. Il PABA ha una geometria interamente coplanare, la sulfanilamide ha una geometria coplanare nella porzione amino benzenica e tetraedrica in quella solfonamidica.

Il meccanismo di azione è il seguente: successivamente l’acido 7,8 diidropteroico viene condensato con l’acido glutammico per dare l’acido 7,8 diidrofolico. In alcuni batteri però la diidropteroato sintasi catalizza una reazione in cui la sulfanilamide si sostituisce al PABA formando un coniugato con la 7,8 diidropterina. La somiglianza strutturale della sulfanilamide con il PABA spiega l’affinità del farmaco con la DHPS. La reazione catalizzata dalla DHPS è una reazione fondamentale, necessaria alla sintesi dell’acido 5,6,7,8-tetraidrofolico. Le cellule che non esprimono la DHPS assumono l’acido folico dall’esterno come precursore dell’acido tetraidrofolico.

Questo composto è indispensabile per la biosintesi delle basi puriniche Adenina e Guanina, nonché degli aminoacidi alanina e cisteina. L’effetto complessivo è quindi batteriostatico (non battericida come le penicilline). Tale composto non risulta essere dannoso per le cellule eucariotiche in quanto quest’ultime assumono l’acido folico direttamente dall’ambiente esterno (ed ecco perché l’acido folico viene considerato come una vitamina, meglio nota come Vitamina B9).

Diversi microorganismi batterici sono incapaci di assorbire l’acido folico dal mezzo in cui crescono, perché non sono dotati di meccanismi di trasporto attivo che consentono all’acido folico di attraversare la parete batterica. Perciò essi sono provvisti di sistemi enzimatici in grado di biosintetizzarlo. L’effetto antibatterico dei sulfamidici può essere annullato aggiungendo quantità sufficienti di PABA nella dieta. La differenza nel modo con cui le cellule batteriche e quelle umane assumono l’acido tetraidrofolico spiega la tossicità selettiva dei sulfamidici. Gli enterococchi, per esempio, assumono l’acido folico dall’esterno e perciò risultano resistenti ai sulfamidici.

Meccanismo d'azione in generale

I sulfamidici sono degli analoghi strutturali dell'acido p-aminobenzoico (PABA) e si comportano da antagonisti competitivi nei confronti di tale acido (antimetaboliti). Essi interferiscono con l'utilizzazione del PABA da parte dei sistemi enzimatici necessari per la crescita dei batteri. Sono quindi dei batteriostatici ed agiscono sui batteri in fase attiva di moltiplicazione.

Il PABA entra nella costituzione dell'acido folico. L'acido folico (dal latino folium) o acido pteroilglutammico è una vitamina del gruppo B, ampiamente diffusa, che è stata scoperta nel corso degli studi sull'anemia macrocitica tropicale che veniva curata con estratti di fegato. I suoi componenti costitutivi sono: un sistema eterociclico fuso (pterina), l'acido glutammico e, appunto, il PABA.

L'acido folico di per se stesso non ha attività coenzimatica, ma è ridotto nei tessuti dapprima ad acido diidrofolico e quindi ad acido tetraidrofolico. Quest'ultimo viene a sua volta trasformato in una serie di derivati che funzionano come trasportatori intermedi di una unità carboniosa che viene ceduta ad opportuni precursori nel corso della biosintesi di basi puriniche e pirimidiniche e di alcuni aminoacidi (ad es. serina, metionina). L'acido folico è dunque necessario per la sintesi degli acidi nucleici (DNA ed RNA) e quindi per la crescita e la moltiplicazione delle cellule. Nell'uomo ad esempio, la carenza di acido folico si ripercuote principalmente sul quadro ematico poiché le cellule ematiche vengono formate continuamente. I disturbi corrispondenti sono anemia macrocitica (o megaloblastica) e trombocitopenia.

Stadi finali del processo di biosintesi dell'acido diidrofolico

La 6-idrossimetil-7,8-diidropterina difosfato viene condensata ad opera dell'enzima diidropteroato sintetasi con il PABA per dare acido diidropteroico, il quale a sua volta viene condensato con l'acido glutammico per dare acido diidrofolico (FH₂).

I sulfamidici interferiscono con il processo di biosintesi dell'acido diidrofolico in due differenti maniere:

• La prima, e più importante, consiste in una inibizione competitiva della diidropteroato sintetasi.
• La seconda, che può essere operante in alcuni batteri, prevede l'utilizzo dei sulfamidici da parte della diidropteroato sintetasi come 'falsi substrati' per formare degli analoghi dell'acido diidropteroico (incorporazione fraudolenta) che sono inattivi come trasportatori di unità carboniose ed interferiscono invece con le reazioni successive in cui è implicato l'acido folico oltre a sottrarre 6-idrossimetil-7,8-diidropterina difosfato.

La sintesi de novo di acido folico ha luogo in un'ampia varietà di microrganismi comprendenti oltreché batteri anche protozoi e funghi. Questi microrganismi non appaiono estrarre facilmente acido folico dall'organismo ospite, ad esempio quello presente in circolo. Ciò spiega l'ampio spettro d'azione dei sulfamidici. I microrganismi che, come i mammiferi, utilizzano acido folico preformato sono invece insensibili all'azione dei sulfamidici. È interessante notare che, nonostante la loro dissomiglianza strutturale, i solfoni come ad esempio il dapsone agiscono con un meccanismo d'azione simile a quello dei sulfamidici.

L'inibizione della sintesi di acido folico e quindi della crescita batterica da parte dei sulfamidici può essere superata per aggiunta o di PABA in eccesso o dei prodotti finali delle reazioni in cui sono implicati i derivati coenzimaticamente attivi dell'acido folico (timidina, purine, metionina e serina). Queste sostanze possono essere presenti in considerevole quantità nel pus (il pus è una raccolta di cellule fagocitarie, detriti cellulari, fibrina, proteine). Di conseguenza vi può essere una notevole diminuzione di efficacia dei sulfamidici nelle infezioni purulente.

Metabolismo dell'acido folico e siti d'azione dei farmaci 'antifolici'

Il metabolismo dell'acido folico coinvolge diversi passaggi enzimatici chiave:

• GTP CO H₂H N CO HO O OH OH 2 NN (PABA) N NN O P O P OH H Diidropteroato OH OH H N N NH N N N 2 HH 6-Idrossimetil-7,8- Acido 7,8-diidropteroico diidropterina difosfato Inibizione SULFAMIDICI Incorporazione H N CO H NEI2 2 fraudolenta SOLFONI BATTERIO
• Diidrofolato 2 PASN (Acido glutamico) Sintetasi N N SO NHR2H ATP H N N N2 CO HH CO H 22 OO OH N CO HOH N CO H 22 HH H NN N NN N Diidrofolato HH Reduttasi Acido folico (dieta)
• Acido Tetraidrofolico (FH₄) Inibizione Acido 7,8-diidrofolico (FH₂) ANTIMALARICI ANTIFOLICIMETOTRESSATO
• Cofattori FH₄ CHON NH +N NN NN NHCHON NN NH H HHN -N -metilene-FH N -N -metenil-FHN -formil-FH N -formil-FH5 10 4 5 10 410 4 5 4

Questi processi sono essenziali per la biosintesi delle basi puriniche, nucleotidi pirimidinici e alcuni aminoacidi, influenzando quindi la crescita e moltiplicazione cellulare.

Relazione struttura-attività

Il gruppo aminico e il gruppo solfonamidico devono trovarsi in posizione 1,4 tra loro perché l’isomero para è quello attivo. Le porzioni di sulfanilammide che potevano supportare dei sostituenti sono l’N1 solfonamidico e l’N4 anilinico. Tuttavia tutti i solfunammidici sono derivati recanti un acile o un eteroarile in N1 e sono molto più potenti della sulfanilammide da cui derivano.

Il loro sostituente su N1 esercita un effetto elettronattrattore e conferisce all’idrogeno sulfonammidico un pka tra 5 e 7, cioè in equilibrio tra la sua forma neutra e forma anionica. Grazie al suo comportamento di acido debole, il sulfamidico partecipa a un equilibrio in cui la forma neutra coesiste con la forma anionica: la forma neutra penetra meglio nel citoplasma batterico e quella anionica interagisce meglio con la DHPS.

Ne consegue che a pH fisiologico, i sulfamidici eccessivamente ionizzati o insufficientemente ionizzati hanno difficoltà a raggiungere il bersaglio o a interagire con esso. Inoltre, il gruppo aminico libero è essenziale per l’attività, perciò tutti i sulfamidici in cui tale funzione è mascherata costituiscono dei pro farmaci.

Farmacocinetica

Sono bene assorbiti per via orale (tranne quelli usati come antisettici intestinali), in parte eliminati per via renale ed in parte metabolizzati. Si distribuiscono in tutti i tessuti e si legano all’albumina plasmatica in maniera variabile. Sono disattivati mediante acetilazione metabolica all’N4 e glucuronazione dell’azoto anilico nel fegato. L’emivita è molto variabile: dalle 6 – 12 h (come il sulfametossazolo) fino alle 24 ore.

L’efficacia della sulfanilammide, infatti, dipende dalla sua concentrazione. L’interazione Sulfanilamide-Proteina è data dal seguente equilibrio: S + P → SP. Nei sulfamidici classici il legame SP è relativamente debole e dura dalle 4 alle 6 ore. Nei sulfamidici di ritardo il legame SP dura fino alle 24 ore.

Le diverse tipologie

I sulfamidici si dividono nelle seguenti classi:

• Sulfamidici sistemici: (N1 sostituiti) che hanno un’azione generalizzata e a loro volta si dividono in:
  • Sulfamidici classici: hanno un'emivita ridotta e la loro assunzione varia tra le 3 e 4 volte al giorno. Richiedono una somministrazione ogni 4 - 6 ore poiché rimangono in circolo per un tempo relativamente breve perché il legame che formano con le proteine plasmatiche non è molto forte. Un esempio è il sulfatiazolo.
  • Sulfamidici di ritardo: realizzano un legame più forte con le proteine plasmatiche, che fungono quindi da deposito e ne determinano il rilascio lento e graduale. Vanno somministrati ogni 24 ore.
• Sulfamidici delle vie urinarie: (N1 sostituiti) vengono assorbiti facilmente ma altrettanto facilmente vengono eliminati dal circolo ematico (t_1/2 <6 ore); si accumulano a livello del tratto urogenitale dove esercitano la loro azione antibatterica.
• Sulfamidici azoici intestinali: sono sostituiti sia sull’azoto N1 che N4 e, per questa ragione, sono caratterizzati da scarsa assorbibilità (<5%). Vengono trattenuti nel tratto gastrointestinale ed esplicano la loro azione chemioterapica unicamente a tale livello (per esempio, la Sulfasalazina).

Da notare che l’entità del legame con le proteine plasmatiche dipende dalla struttura del sulfamidico e ne condiziona il tempo di eliminazione.

Effetti indesiderati

Tra gli effetti indesiderati si annoverano la cristalluria delle urine. Si consiglia di bere molta acqua e assumere carbonato di sodio come alcalinizzante. Possono dare crasi ematica e nei soggetti con deficit di glucosio 6 fosfato deidrogenasi (favismo), la somministrazione di questi, può scatenare episodi di anemia emolitica. Possono causare anche la Sindrome di Steven-Johnson caratterizzata da eritema con lesioni bollose con interessamento delle mucose (reazione di ipersensibilità).

Spettro d’azione e resistenza batterica

I sulfamidici mostrano proprieà batteriostatiche sulla maggior parte dei batteri gram positivi (Streptococchi, Stafilococchi, Pneumococchi, Clostridium e Nocardia), su alcuni batteri gram negativi (Neisseria Meningitidis, Neisseria Gonorrhoeae, Escherichia Coli, Proteus Mirabilis, Vibrio colera) sulla Chlamydia trachomatis e su alcuni protozoi (plasmidi della malaria, Toxoplasma gondii).

La resistenza batterica che si è sviluppata nel corso degli anni da molti ceppi sopraelencati deriva da mutazioni della DHPS in isoforme prive di affinità per i sulfamidici, sulla produzione di elevate quantità di PABA, sull’efflusso attivo del farmaco fuori dalla cellula.

Esempi di sulfamidici

Sulfatiazolo: Antibatterico sulfamidico classico a breve durata di azione utilizzato in passato e attualmente sostituito da altri chemioterapici meno tossici, in quanto tra l'altro provoca un'alta incidenza di cristalluria. Viene ora utilizzato con altre sulfonamidi in preparazioni per il trattamento topico di infezioni vaginali.

Sulfisossazolo: Viene indicato in presenza di infezioni alle vie urinarie (vaginiti, cistiti). Controindicato in caso di gravidanza (nell'ultimo trimestre), ipersensibilità nota al farmaco e se si mostra porfiria. Alcuni degli effetti indesiderati sono vomito, discrasie, nausea e cristalluria.

Acetilsulfisossazolo: È un derivato del Sulfisossazolo con lo stesso meccanismo d’azione ed uso. La differenza si riscontra nella presenza di un gruppo acetile nell’azoto N1.

Sulfametossazolo e sintesi: Viene utilizzato in combinazione con trimetoprima, per curare infezioni alle vie urinarie, otite media e shigellosi, e polmonite interstiziale da Pneumocystis carinii. Alcuni degli effetti indesiderati sono nausea, febbre, cristalluria, esantemi.

Sintesi dei sulfamidici

La sintesi dei sulfamidici avviene attraverso vari passaggi chimici:

• Acetazione, per proteggere il gruppo amminico, realizzata con cloruro di etanoile
• Clorosolfonazione con 2 equivalenti di acido cloro solfonico (reagiscono tra di loro per dare ClSO₂H)
• Reazione con 3-amino-5-metil-isossazolo (composto eterociclico con azoto e ossigeno)
• Ripristino gruppo amminico tramite idrolisi

Sintesi del 3-amino-5-metil-isossazolo

• Tautomeria cheto enolica (1)
• Reazione con idrossilammina, eliminazione di una molecola d’acqua e ciclizzazione del composto (2)
• Idrolisi basica (3)
• Reazione di clorurazione della funzione carbossilica con penta cloruro di fosforo (4)
• Reazione con sodio azide, riarrangiamento elettronico ed eliminazione di azoto molecolare
• Trasposizione di Curtis con formazione di Isocianato (5)
• Reazione con acqua e conversione del gruppo in acido carbamidico (6)
• Decarbossilazione a caldo (7)

Inibizione competitiva della diidrofolato reduttasi

1,4 diaminopirimidine: inibiscono competitivamente la diidrofolato reduttasi. Il principale agente antibatterico appartenente a questa classe è il trimetoprim.

È un 2,4 diaminopirimidinico, coinvolto nella reazione di trasformazione dell’acido folico e dell’acido diidrofolico in acido tetraidrofolico. Interferisce quindi nella DHFR batterica, ma non in quella umana, l’enzima coinvolto nella reazione di trasformazione dell’acido folico e dell’acido diidrofolico nell’acido tetraidrofolico. Viene usata anche come Antimalarico. Il trimetoprim presenta nella sua struttura un gruppo 3’,4’,5’ metossibenzilico nella posizione 5 dell’anello pirimidinico.

La tossicità selettiva del trimetoprim risiede nella sua capacità di legarsi con alta affinità alla DHFR batterica e di essere priva di affinità per la DHFR umana. Da sola ha effetti batteriostatici e uno spettro d’azione simile a quello dei sulfamidici. La combinazione del trimetoprim con un sulfamidico è caratterizzata da effetti sinergici poiché i due farmaci inibiscono tappe enzimatiche della stessa via biosintetica che porta all’acido tetraidrofolico.

Un’associazione trimetoprim + sulfametossazolo, nel rapporto ponderale 1 : 5, denominato Cotrimossazolo, esplica effetti battericidi su agenti patogeni che risultano poco sensibili all’azione di ciascun componente della miscela e riduce il rischio di ceppi resistenti ad entrambi i farmaci. Viene usato il sulfametossazolo perché è dotato di un'emivita simile al trimetoprim (11 h). Il trimetoprim è una molecola lipofila, debolmente basica, ben assorbito dopo somministrazione orale e si lega poco alle proteine plasmatiche.

Studi di cristallografia ai raggi X condotti su complessi DHFR trimetoprim hanno rilevato che il sito catalitico è occupato dalla forma protonata dell’inibitore impegnata in un ponte salino con la catena COO- di u.