Biologia sintetica

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

È basata sull'utilizzo di attrezzi dei quali normalmente i batteri si servono per la loro fisiologia che si sono stati in grado di identificare e riprodurre in artificiale e utilizzare per scopi diversi da quelli della fisiologia del batterio. Nell'articolo di Haynes il meccanismo che viene implementato è quello riportato nella figura sottostante.

I due anelli sono due cromosomi di DNA a doppio filamento. È DNA accessorio che i batteri tipicamente utilizzano per il trasferimento dell'informazione. Queste molecole si chiamano plasmidi e vengono mantenuti all'interno dei batteri e viene utilizzato per trasferire ad altri batteri delle proprietà funzionali. Un batterio tipo ha un genoma di 4 milioni di paia di basi cui 4 mila geni dei quali ci si può servire. È stato verificato che il set minimo di geni che possono servire a un batterio per sopravvivere è intorno a 500 coppie di basi.

Un plasmide trasporta quale migliaio di paia dibasi che possono diventare nelle situazioni più voluminose non più di 10 mila.

I plasmidi hanno una regione che viene definita amp ovvero resistenza all’ampicillina. Sostanzialmente unbatterio codifica attraverso un gene che non tiene nel genoma ma che mantiene nel DNA plasmidico la sequenza di DNA che trascrive e traduce in una proteina che permette di resistere ad una molecola diampicillina che aggredisce i ribosomi batterici impedendone la riproduzione. Per difendersi i batteri usanoproteine di membrana che fungono da pompe che eliminano dal citoplasma batterico l’antibiotico e diconseguenza si difendono dal blocco della sintesi proteica. Il fatto di avere il progetto che sintetizza laresistenza all’ampicillina in un elemento trasferibile è in grado di far sì che i batteri che hanno questomeccanismo di difesa possono conferirlo ai batteri.

Che non ce l'hanno. Si può quindi lavorare con questi elementi che possono essere introdotti nel batterio e utilizzati per scopi che possono essere di interesse. L'interesse sta nel sito di clonaggio, ovvero il sito nel quale è possibile copiare sequenze di DNA di interesse. L'introduzione di plasmidi modificati in batteri viene chiamata trasformazione dei batteri. L'introduzione di DNA nel plasmide si chiama clonaggio molecolare. Si possono modificare artificialmente le regioni residuali del plasmide e introdurre nei batteri sequenze che trascriveranno e tradurranno in proteine che potrebbero fare comodo. Questa tecnologia viene utilizzata per produrre farmaci ricombinanti. Bisogna poter aprire i plasmidi utilizzando degli enzimi di restrizione sfruttando il fatto che gli estremi del DNA plasmidico che è stato aperto saranno complementari ad un segmento di DNA che vorremmo introdurre che è stato tagliato con lo stesso enzima di restrizione.

L'uso dell'enzima di restrizione con delle estremità coesive determinate dal taglio, per esempio, con EcoRI creando delle estremità in grado di includere frammenti le cui estremità siano state tagliate con gli stessi enzimi di restrizione. Si necessita di uno standard per poter operare in questo campo. Uno standard è rappresentato dallo standard assembly10. Si ha una differente rappresentazione schematica del vettore plasmidico dove si ha la resistenza all'antibiotico, un elemento che è l'unico che induce il batterio a tenere il plasmide. A monte e avalle della parte biologica di interesse mostra in sequenza i siti di restrizione caratteristici di due enzimi in prefisso rispetto alla parte biologica e due specifici siti di restrizione in suffisso. Nella sequenza gli enzimi contengono il meccanismo con cui si standardizza il processo di clonaggio. 26 Martina Lazzari Biologia sintetica LMaa 2020-2021 La sequenza di EcoRI è GAATTC.

altre sono lievemente differenti. X e S hanno una caratteristica interessante, si chiamano isocaudameri perché hanno la stessa sequenza di basi complementari tra di loro nelle estremità coesive (CTAG) ma hanno le regioni fiancheggiatrici che sono differenti (per X si ha T e A e per S si ha A e T in senso 5'-3').

Il taglio è un evento e il riconoscimento del sito di taglio un altro. Il riconoscimento dei rispettivi enzimi di restrizione viene effettuato sulla sequenza di 6 coppie di nucleotidi. Ogni enzima quando taglia lo fa in maniera asimmetrica.

Quello che dovrebbe emergere è che seguendo il principio per il quale estremità coerenti sono in grado di ibridarsi tra di loro quello che ne viene fuori è che una volta aperte le sequenze con X o con S potranno legarsi tra di loro. Una sequenza tagliata con X può legarne una tagliata con S. Una volta che questo si verifica la conseguenza che ne deriva è una sequenza in senso

5’-3’ del tipo ACTACA e in senso 3’-5’ TGATCT. Si ha una sequenza detta cicatrice che non può essere ritagliata né da X né da S. Avendo una sequenza che si vuole montare su un plasmide che ne contiene un’altra in posizione 5’ bisogna tagliare il primo plasmide con E ed S e il secondo con E ed X. In una fase successiva di ricombinazione E sarà equivalente alla sequenza ottenuta con lo stesso enzima di restrizione nell’altro vettore ed S sarà equivalente alla sequenza del secondo vettore con X. Dopo la ligazione il sito di saldatura tra S ed X non sarà più riconoscibile da S e X e si avrà una cicatrice. Dall’altro canto l’assetto del blocco che è stato prodotto sarà nuovamente quello iniziale, ovvero una regione, chiaramente più complessa, che avrà sempre prefisso EX e suffisso SP.

27Martina Lazzari Biologia sintetica LMaa 2020-2021

I plasmidi vengono inseriti

nei batteri con un'operazione di massa. La membrana batterica viene destabilizzata con una scarica elettrica (o shock termico) attraverso l'uso di atomi metallici che appesantiscono il plasmide e ne permettono, con un processo diffusivo, l'ingresso del batterio nel quale il plasmide tende a replicare e assumere un numero di copie a regime che gli è proprio. ORI è una sequenza chiamata origine di replicazione che ha due aspetti significativi:

• È dove viene reclutata la polimerasi per la replicazione del plasmide
• Viene reclutata in un numero di volte che quel plasmide una volta introdotto nel batterio arriva a produrre a regime un certo numero di copie

Il frammento viene amplificato all'interno del batterio sia per la replicazione del plasmide che del batterio. Un batterio trasformato avrà un certo numero di copie del plasmide al suo interno dopo che ne è stata inoculata almeno una, che corrisponde alle specifiche definite.dall'ORI del plasmide. In più è un'operazione che si svolge in dinamico; i batteri hanno un ciclo di replicazione veloce che duplica ogni 40 minuti. Si ha un processo di crescita esponenziale veloce che fa sì che partendo da un batterio se ne abbiano milioni in qualche ora. La procedura standard prevede che nel rispetto delle proporzioni realizzate tra plasmidi e batteri l'ingresso di un plasmide in un batterio, l'ingresso di più plasmidi in un batterio e l'ingresso di nessun plasmide in un batterio. A questo punto occorre selezionare i batteri che portano il plasmide. Questa operazione viene fatta attraverso semina su una superficie semisolida (gel a base di polimeri estratti da alghe, detto agar e nutrimento per i batteri). Se insieme all'agare al terreno di coltura nella piastra è presente l'antibiotico contro il quale il plasmide genera resistenza si avrà la sopravvivenza nella piastra dei batteri che contengono il plasmide.

plasmide con la proteina che espelle l'antibiotico, mentre quelli che non hanno il plasmide, a tempo definito, moriranno. Si avrà quindi come residuo sulla superficie della piastra solo batteri che contengono il plasmide. Questa è una pressione selettiva che si applica sui batteri per verificare quali sono stati modificati.

Le singole colonie vengono chiamate cloni di un solo batterio progenitore.

Si vuole costruire dei sistemi di espressione e il blocco che si inserisce deve essere in grado di essere soggetto a trascrizione e traduzione. Un blocco significativo deve contenere:

• Regione codificante che contiene il messaggio che produce il dispositivo molecolare di interesse
• Il promotore, ovvero il sito di inizio della traduzione, ovvero una piccola sequenza con la quale l'RNAmessaggero viene agganciato dal ribosoma che lo traduce che deve essere una sequenza prevista ma non è inclusa nel progetto

della molecola di interesse che viene sintetizzata. Il promotore indica anche il rateo cinetico con il quale la trascrizione deve avere luogo. Ha una affinità per la polimerasi quindi ha un certo grado di attrattività che fa si che la polimerasi sia chiamata a trascrivere con un clock che è diverso in funzione delle caratteristiche della sequenza del promotore. Esistono due tipi di promotori: - Attivi: sono sempre accesi e variano solo per i ratei cinetici della loro attività. Sono promotori con i quali, una volta costruito un circuito si suppone che con livelli differenti la sintesi della proteina sia sempre attiva. - Regolati: questi promotori possono avere una transizione di stato e quindi aggiungono anche la possibilità di passare da uno stato attivo ad uno inattivo e viceversa attraverso un input molecolare che si può gestire. Il terminatore, ovvero la regione, che significa, per l'RNA polimerasi e per il ribosoma che in quel punto la trascrizione è terminata.

l'operazione è giunta al termine.• RBS, ovvero il sito di legame al ribosoma.Queste informazioni sono contenute nel Registry of Standard Biological Parts. 1L'operazione che si vuole realizzare è inserire una sequenza promotore contenuta in un biobrick in unaposizione 5' a monte di una sequenza che regola l'attacco dei ribosomi contenuta a sua volta in un altrobiobrick. Questo materiale è disponibile come DNA liofilizzato. Per inserire un frammento da briobrick amonte di un'altra parte biologica bisogna tagliare il primo in E ed S, mentre si taglia il secondo biobrick in Esu un versante e in X sull'altro. Fisicamente bisogna attaccare il primo all'interno del secondo sfruttando ilfatto che si ha una diretta compatibilità e complementarietà tra le estremità coesive del taglio realizzato conEcoRI.1 Vengono definiti come BioBrick delle sequenze di DNA standard che codificano ben definite strutture e

rti blocchi di codice. Le funzioni sono definite utilizzando la parola chiave "function" seguita dal nome della funzione e da parentesi tonde che possono contenere eventuali parametri. Il corpo della funzione è racchiuso tra parentesi graffe e contiene le istruzioni che verranno eseguite quando la funzione viene chiamata. Ecco un esempio di definizione di una funzione in JavaScript: ```html ``` In questo esempio, abbiamo definito una funzione chiamata "saluta" che prende un parametro chiamato "nome". Quando la funzione viene chiamata, verrà stampato il messaggio "Ciao, " seguito dal nome passato come argomento. Per chiamare una funzione, è sufficiente scrivere il nome della funzione seguito da parentesi tonde che possono contenere eventuali argomenti. Ad esempio: ```html ``` In questo caso, la funzione "saluta" viene chiamata passando il nome "Mario" come argomento. Il risultato sarà la stampa del messaggio "Ciao, Mario!" sulla console. Le funzioni possono anche restituire un valore utilizzando la parola chiave "return". Ad esempio: ```html ``` In questo caso, la funzione "somma" prende due parametri "a" e "b" e restituisce la somma dei due valori. La variabile "risultato" viene assegnata al valore restituito dalla funzione e viene stampata sulla console il valore 8.