Riassunto esame Biologia, prof. Maione, libro consigliato Il mondo della cellula, Becker

°C)

Fase 3 polimerizzazione del DNA. Per questa fase necessaria la presenza di diversi elementi: DNA polimerasi,

– è

desossiribonucleotidi, soluzione tampone (per mantenere ottimale l’ambiente chimico).

Poiché questo processo prevede sbalzi di temperatura nelle varie fasi, l’utilizzo di un termociclatore e della Taq

polimerasi (una DNA pol resistente ad alte temperature) ha permesso l’automatizzazione del processo.

Applicazioni della PCR:

Diagnosi molecolare diretta utilizzando un primer o una sonda, si può individuare una differenza in due alleli di un

–

gene anche di un singolo nucleotide, in quanto basta un nucleotide non complementare perché l’oligonucleotide non si

appai in modo stabile e non avvenga l’amplificazione.

Inserendo un primer per il gene normale in tre campioni di gene per l’emoglobina beta di tre individui (1 due geni

normali, 2 con entrambi i geni mutati e 3 eterozigote), e studiando i prodotti tramite elettroforesi, si avrà che il gene dei

campioni degli individui 1 e 3 sono stati clonati, mentre il 2 no. Ripetendo l’esperimento con un primer per il gene mutato,

i geni dei campioni 2 e 3 saranno stati clonati, mentre l’1 no.

Individuazione di genoma virale nel siero di un campione di sangue (ad esempio per l’HIV) si centrifuga il campione

–

per isolare il siero con il virus a RNA, che viene messo in condizioni di poter essere retro trascritto e amplificato via PCR

e poi studiato tramite elettroforesi su gel, confrontandolo con un campione di siero non infetto.

Tipizzazione genetica (fingerprinting)– si basa sull’analisi di due tipi di sequenze altamente variabili presenti nel genoma

umano: le VNTR, ripetizioni in tandem in numero variabile e le STR, brevi ripetizioni in tandem.

Si possono confrontare le regioni altamente polimorfiche dei cromosomi di uno stesso individuo o tra individui diversi. La

combinazione dell’analisi di più regioni polimorfiche fornisce un fingerprint dell’individuo.

Applicazioni: test di paternità (le VNTR sono ereditate dai genitori), medicina forense (confrontando i fingerprint di vari

individui con quello dell’individuo da identificare).

Altre applicazioni dell’ibridazione degli acidi nucleici

Southern blot

Per indivuare la presenza o meno di una specifica sequenza in un campione (ad esempio per individuare le sequenze

polimorfiche per la tipizzazione genetica) si usa la tecnica Southern Blot.

Dopo la digestione di una molecola di DNA con enzimi di restrizione e l’elettroforesi su gel, i frammenti vengono trasferiti

su un filtro di nitrocellulosa (il trasferimento si dice e ibridati con una sonda marcata, poi visibili per

“blotting”)

autoradiografia. Questa tecnica viene utilizzata per il confronto dei dati ottenuti dalla tipizzazione.

Ibridazione in situ

Permette di individuare uno specifico acido nucleico (anche RNA) in cellule, tessuti o embrioni.

FISH (ibridazione in situ a fluorescenza)

Permette di rilevare aberrazioni cromosomiche, in quanto permette di localizzare i geni sui cromosomi. Se vengono

inserite sonde multiple per tutti i tipi di cromosomi, permette l’analisi del cariotipo.

Northern blot

Stesso meccanismo della southern blot, ma usata per rivelare la presenza di specifici mRNA (invece di DNA), quindi

permette di individuare se un gene, oltre ad essere presente, viene o meno trascritto.

Western blot

Utilizzata per rivelare la presenza di proteine, utilizzando come sonde gli anticorpi corrispondenti.

Ibridazione su microarrays

Microarray (microgriglia) = supporto solido sul quale sono posizionati migliaia di frammenti di DNA sonda, ciascuno per

un gene specifico.

L’ibridazione su microarrays permette di confrontare l’espressione genica di due campioni cellulari.

Infatti viene estratto dalle cellule l’mRNA, convertito poi in cDNA per PCR a trascrittasi inversa (RT­PCR). Il cDNA di

ciascun campione viene marcato con un colore e poi viene messo sulla griglia, in modo da permettere l’ibridazione tra

cDNA e i frammenti sonda. la presenza o meno dei colori rivela se il gene contenuto in ciascuna sonda trascritto o

è

meno nelle cellule dei campioni.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Metodo basato sull’uso dei didesossinucleotidi (metodo di Sanger).

i didesossinucleotidi si differenziano dal desossinucleotidi per l’eliminazione di un secondo ossigeno al 3’ del

desossiribosio. Questa eliminazione impedisce la polimerizzazione.

Si prende un filamento singolo di DNA, a cui viene aggiunto

- un primer marcato

Si aggiungono dessossinucleotidi (normali) in grandi quantità

- In quattro campioni diversi si aggiungono DNA polimerasi e

- didesossinucleotidi (un tipo per campione: uno ha la

didesossiadenina, uno la didesossitimina, uno la

didesossicitosina e uno la didesossiguanina) in rapporto 1:100

con il desossinucleotide corrispondente.

Nei quattro campioni vengono copiati brevi filamenti, che sono

- interrotti nei punti in cui la DNA polimerasi inserisce un

didesossinucleotide. I filamenti di uno stesso campione hanno lunghezze diverse, ma sappiamo che terminano

tutti con il nucleotide inserito come didesossi nel campione.

Si confrontano i frammenti tramite elettroforesi su gel

-

mettendo un campione in ogni pozzetto. Vedendo a quale campione appartengono i frammenti, dal segmento più

leggero a quello più pesante, si ricostruisce la sequenza del DNA.

Questo processo può essere automatizzato marcando i ddNTP con marcatori fluorescenti diversi ed effettuando il

processo in un’unica provetta e un unico pozzetto. I frammenti che terminano con diversi didesossi appaiono con colori

diversi.

Applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante

Ottenere proteine di utilità medica, in quanto un vettore permette l’espressione del gene estraneo. Sono state

• prodotte in questo modo proteine come l’insulina, l’eritropoietina, proteine usate come vaccini (epatite B,

influenza, herpes..)

Studiare la funzione del singolo gene clonato

• Ottenere organismi geneticamente modificati

• Effettuare terapie geniche e cellulari

•

Studio della funzione di geni clonati

La sequenza nucleotidica (regolativa o codificante, in base alla modificazione che si vuole ottenere) modificata in vitro.

è

Le modificazioni devono essere di piccola entità (ad esempio un cambio di base) per far sì che il gene mutato si appai al

normale.

Il gene viene fatto appaiare con un plasmide a singolo filamento contenente il gene normale e (il gene aggiunto) funziona

da innesco per la sintesi del secondo filamento mutato. Il plasmide viene poi trasferito in una cellula, i cui discendenti

conterranno al 50% il gene mutante.

L’analisi del fenotipo permette di capire la funzione della mutazione.

Organismi geneticamente modificati

Possono essere ottenuti in vari modi:

Sostituzione genica: il gene mutato viene sostituito a quello normale.

- Knockout genico: il gene normale viene disattivato.

- Addizione genica: il gene mutato viene aggiunto a quello normale; sono attivi entrambi.

-

Il knockout e la sostituzione sono basati sulla ricombinazione omologa tra dna cromosomico e vettoriale. Il dna inserito

innattiva il gene nel caso di knockout o lo sostituisce con un gene mutato in caso di sostituzione.

TOPO KNOCKOUT

Per produrre un topo knockout si interviene sulle cellule staminali embrionali in vitro. Si prendono cellule staminali

embrionali e vi si introduce il dna modificato; si fanno crescere colonie. Si identificano le rare colonie in cui avvenuta la

è

sostituzione (la ricombinazione omologa un processo raro nelle cellule animali). Le cellule modificate vengono iniettate

è

in embrioni precoci, poi impiantati nell’utero di un topo femmina per la gravidanza. Gli embrioni sono formati in parte da

cellule normali e in parte mutate. La progenie chimerica (chimera= animale con due o più popolazioni di cellule

è

geneticamente distinte).

Gli individui che contengono il gene modificato nelle cellule della linea germinale (cellule sessuali, quindi trasmissibili alla

prole) vengono fatti riprodurre con topi normali. La progenie comprenderà individui eterozigoti con il gene mutato.

Facendo riprodurre eterozigoti tra loro si ottiene il topo knockout, con entrambe le copie del gene modificate (inattivate)

TOPO TRANSGENICO

Per produrre un topo trasgenico si inserisce DNA nel pronucleo di uova fecondate, poi impiantate nell’utero di una madre

adottiva. Tra la progenie ci sarà il topo transgenico.

PIANTA TRANSGENICA

Le piante transgeniche vengono create per aumentare la loro resistenza ed il valore nutritivo.

Viene creato un plasmide ricombinante con il gene di interesse, poi introdotto nella cellula vegetale in coltura.

ANIMALI FABBRICA

Animali modificati geneticamente perché producano prodotti con proteine di interesse.

Ad esempio le pecore vengono modificate con l’aggiunta di un gene per una proteina ematica umana che viene secreta

nel latte e poi raccolta e purificata per il trattamento di malattie come la fibrosi cistica.

Terapia genica

Consiste nel trasferimento di informazione genetica in cellule somatiche. Il gene terapeutico può essere una copia

normale di un gene (per sostituirne uno alterato) o un gene utile a contrastare una patologia.

La terapia genica può essere effettuta in vivo o ex vivo.

In vivo il vettore con il gene terapeutico viene somministrato direttamente nel paziente.

Ex vivo le cellule vengono prelevate dal paziente e modificate in laboratorio, per poi essere ritrapiantate.

Terapia cellulare

La terapia cellulare basata sull’utilizzo di cellule staminali e consiste nell’inserimento nell’organismo di queste cellule

è

per ricreare un tessuto. Serve per la cura di patologie caratterizzate dalla distruzione di uno specifico tessuto.

Cellule staminali cellule indifferenziate capaci di dare origine a progenie differenziata

–

Le cellule staminali embrionali sono totipotenti, cioè possono dar vita a tutti i tipi di cellule somatiche.

Le cellule staminali adulte hanno un potenziale differenziativo ridotto e sono responsabili della riparazione dei tessuti.

La terapia si basa sul prelievo delle cellule, la loro coltura ed eventuale modificazione genetica ed il successivo trapianto

(autologo perché vengono trapiantate al paziente le sue stesse cellule).

I modelli di terapia cellulare consolidati fin’ora riguardano le cellule staminali emopoietiche per la sostituzione di cellule

del sangue malate e le cellule staminali epidermiche che vengono fatte crescere a creare un lembo di epidermide per

ripopolare la superficie danneggiata.

COMUNICAZIONE INTERCELLULARE

Le cellule comunicano tramite segnali extracellulari.

Lo scambio di segnali si basa su alcuni principi principali:

Sintesi e rilascio di molecole segnale da parte della cellula segnalatrice. Questo avviene