Biologia per esame orale parte 2 (staminali,organismi modello,biotecnologie)

Tutte queste caratteristiche lo rendono uno dei più importanti organismi modello, per quanto possa apparire all'apparenza distante dai vertebrati superiori (uomo).

C. elegans cresce facilmente su piastre Petri, alimentato con batteri. Ha una taglia molto piccola per cui possono crescere migliaia di vermi in una piastra. Il corpo è trasparente e dunque visibile al microscopio.

- In laboratorio è possibile conservare i vermi congelati (-80 °C) in glicerolo e azoto liquido.

L'IDEA DI STUDIARE UN VERME RISALIE AL 1963

In una lettera a Max Perutz, direttore del Laboratorio di Biologia Molecolare di Cambridge, spiegò l'idea di studiare un organismo multicellulare semplice, con poche cellule per spiegare aspetti importanti della biologia. (Sydney Brenner)

Come studiare questo organismo modello?

• Identificando tutte le cellule
• Tracciando il loro posizionamento nel corpo dell'animale
• Creando mutanti

PREMIO NOBEL

2002 Horvitz, Sulston e Brenner

- Regolazione genica nella biologia dello sviluppo e per la scoperta della morte cellulare programmata (apoptosi).

2006 Fire e Mello

- Interferenza da RNA (RNAi).

RNAi: nello SCREENING di FARMACI

RNAi può essere condotto in C. elegans su larga scala in multiswell. In ciascun pozzetto viene aggiunto molecole di RNA e nematode.

DNA MICROARRAYS

Attualmente esistono 2 tipi di chips per C. elegans:

1. Chip di cDNA contenente circa 20.000. (Reinker 2000) Grazie a questo chip Kim e colleghi, (2001) hanno realizzato un database di riferimento contenente i risultati di circa 500 esperimenti di microarrays. Utile per analizzare il profilo di espressione di un gene in termini di che annotazione.
2. Chip di oligonucleotidi (Hill 2000). Si tratta di chips commerciali che consentono un'analisi quantitativa del mRNA del gene di interesse.

Tutte queste caratteristiche lo rendono uno dei più importanti organismi modello, per quanto possa apparire all'osservatore distante dei vertebrati superiore o distilitomi.

→ Il C. elegans cresce facilmente su piastre Petri alimentato con batteri. Ha un taglia molto piccola per cui possono crescere migliaia di vermi in una piastra. Il corpo è trasparente e bruno.

→ In laboratorio è possibile conservare i vermi congelati a -80°C in glicerolo e azoto liquido.

L'IDEA DI STUDIARE UN VERME RISSALE AL 1963

In una lettera a Max Perutz, direttore del laboratorio di biologia molecolare del Cambridge, spiegò l'idea di studiare un organismo multicellulare, semplice, con poche cellule per capire aspetti importanti della biologia. (Sydney Brenner)

Come studiare questo organismo modello?

• Identificando tutte le cellule
• Tracciando il loro posizionamento nel corpo dell'animale
• Creando mutanti

PREMIO NOBEL

2002 Horvitz, Sulston e Brenner

Regolazione genetica nella biologia dello sviluppo e per la scoperta della morte cellulare programmata (apoptosi).

2006 Fire e Mello

Interferenza da RNA (RNAi).

RNAi: NELLO SCREENING DI FARMACI

RNAi può essere condotto in C. elegans su larga scala in multipozzetti.

In ciascun pozzetto viene aggiunto molecole di RNAi e nematode.

DNA MICROARRAYS

Attualmente esistono 2 tipi di chips per C. elegans:

1. Chip di cDNA contenente circa 20.000. (Reinker 2000)Grazie a questo chip Kim e colleghi (2001) hanno realizzato un database di riferimento contenente i risultati di circa 500 esperimenti di microarrays. Utile per analizzare il profilo di espressione di un gene in termini di comparazione.
2. Chip di oligonucleotidi (Hill 2000)Si tratta di chips commerciali che consentono un'analisi quantitativa del mRNA del gene di interesse.

C. ELEGANS COME MODELLO PER LE MALATTIE UMANE

• ONCOGENI
  • Ras: mostra un identità del 84%, tra primi 3 cloni (Han 1989)
  • Studi condotti in C. elegans hanno permesso di identificare geni coinvolti nella regolazione del Ras. Molti sono il target di farmaci antitumorali.
• ALZHEIMER
  • Psenenina: gene coinvolto in una forma giovanile ereditaria di Alzheimer. Studi condotti sull'ortologo del verme hanno dimostrato che le mutazioni portavano alla formazione di una proteina e paziomemerica attive e che tale fibra è esasrvatuta nella via al segnalazione del recettore Notch (Levytan 1986).
• APOPTOSI
  • Primi studi che hanno dimostrato l'essenza un meccanismo di morte cellulare programmata sono stati condotti in C. elegans (Saundon e Honritz 1971a).
  • Successivamente identificazione di 100 mutazioni che alterano tale via di segnalazione.

LIMITI DI C. ELEGANS COME MODELLO

• C. elegans è un organismo modello relativamente giovane
• Operazioni stressanti sono problematiche per
  • Creazione di geni bersaglio (gene knock out)
  • Costituzione di stock per l'inserzione di geni esogeni
  • Coltivazione di linee cellulari immortalizzate

MUS MUSCULUS

Il topo è un piccolo roditore della famiglia dei Muridi del genere Mus. Esistono una quarantina di specie di questo genere.

Si può trovare il topo comune, quasi tutti i paesi del mondo. Se addomesticato può vivere in ambiente domestico. Vive fino a 3 anni. Pericolosissimo per l'agricoltura e assai diffuso in Italia è il topo campagnolo, che si presenta di taglia + grande rispetto al topo domestico, e con un manto rosso scuro.

ALIMENTAZIONE

Il topo è un animale onnivoro

RIPRODUZIONE

Periodo di riproduzione: tutto l'annoMaturità sessuale: tra le 7 e le 8 settimaneDurata della gestazione: 21 giorniNumero di piccoli per parto: tra 7 e 12

COMPORTAMENTO

Il topo è un animale sociale con gli animali della stessa specieè però necessario separare la femmina e avere piccoli di 20 giorni d’età CANIBALISMO.

Il topo è un roditore che non va in letargo.

GENOMA

• Sequenziamento del genoma è stato completato nel 2002
• Possiede circa 23.786 geni distribuiti in 20 coppie di cromosomi
• Dimensioni simili al genoma umano (14% più piccolo)
• 95% dei geni è omologo a quello umano
• Molti geni presentano lo stesso ordine genico e la stessa distanza intergenica sui cromosomi

ORGANISMO MODELLO

Il topo è molto utilizzato come organismo modello in biologia (in genetica, in embriologia, oncologia, farmacologia, fisiologia) per la simularity morfologica e genetica.

I VANTAGGI

• La piccola taglia
• La facilità di riproduzione e allevamento
• Alto tasso di fertilità (progenie in multipla ottenibile ogni 3 settimane)
• Tempo generazione di circa 19-21 giorni
• Disponibilità di strumenti per la manipolazione genica
• Presenza di molte malattie ereditarie comuni all’uomo (diabete e
• altri disturbi patologici (cardiache, orecchie, disturbi neurologici, glaucoma, ipertensione, obesità).

Circa il 90% degli animali utilizzati nella ricerca biomedica è rappresentato da

• 90% TOPI e RATTI
• 2% CRICETI
• 4% AVVE
• 4% altre specie

· Da circa 4 secoli è comune topolino domestico (Mus Musculus domestico) costituisce il modello animale ideale per lo studio di moltissime patologie umane.

· Agli inizi del 1900 in Europa alcuni amatori iniziano a incrociare topolini per divertimento per hobby, sulla base di caratteristiche ritenute divertenti quali il colore della pelliccia, il comportamento animale.

· In pochi anni si creano delle piccole colonie geneticamente molto pure poiché tutte derivate da topi piccoli progenitori scelti sulla base delle caratteristiche ritenute di interesse (TOPI INBRED).

· È da queste piccole colonie che originano i topolini maggiormente impiegati nella ricerca biomedica grazie a un pionieristico lavoro di alcuni genetisti britannici.

TOPI MUTANTI

TOPI INBRED

• omozigoti per un particolare gene selezionato.
• TOPI NOD che non sviluppano il diabete mellito di tipo 1.
• Wilson topi che si muovono in circolo a causa di una mutazione genetica che incide sull'orecchio interno.
• Topi nudi immunodeficienti che mancano di pelo e di timo.
• Topi non producendo linfociti T e per ciò hanno sistema immunitario compromesso; sono utilizzati negli studi immunologici e nei trapianti.
• TOPI SCID con un sistema immunitario quasi completamente deficitari.

TOPI TRANSGENICI

con un gene esogeno inserito nel genoma

• Topi Giganti con dimensioni anomali con gene esogeno dell'ormone della crescita di ratto.
• ONCO-TOPI con oncogene attivato in modo da aumentare l'incidenza di tumori.

TOPI KNOCKOUT

cui un gene è deleto

• Topi Grassi, sono soggetti ad obesità a causa della mancanza della carboxipeptidasi E.
• Topi Sordi con delezione a carico del gene della miogenina.

Le cellule estratte dalla massa cellulare interna della blastocisti e fatte crescere in coltura le cellule contengono tutto il trasformato con del DNA lineare contenente una copia in stato del gene in esame.

Per selezionare le cellule, con gene knockout opportuno ci sono 2 passaggi. Usacdere tutte le cellule che non hanno integrato il DNA trasformato.

Una seconda selezione include le cellule che hanno integrato DNA col combinazione con omologo. Le cellule con knockout venivi inagamus e dopo iniettata in un embrione a sopite alla cellula a laboratori si formano chimere.

GLI ANIMALI TRANSGENICI

• preparazione degli oociti fecondati
• preparazione dei costrutti
• preparazione delle femmine "pseudogravide"
• screening della progenie

costruzione del transgene → amplificazione del transgene → purificazione del transgene

• Gli animali GM possono produrre principi attivi farmaceutici
• I topi GM sono usati per la ricerca genetica anche applicata allo studio delle malattie umane

Alcuni animali GM possono essere usati come donatori di organi (xenotrapianto)

GENOME EDITING - RICOMBINATIONE

Un vettore (plasmide) che trasporta la sequenza omologa è inserito in una cellula animale

Grazie alle ricombinasi il DNA esogeno viene inserito nel cromosoma

• Inserimento casuale
• Inserimento in sito specifica

Patologie dovute ad alterazione di funzione

Promotore Gene (DNA) Interesse ATG PA (P _A) femmina balb/c

analisi del DNA - topi DONATORI -

in grado di trasmettere il carattere X via ereditarietà

possono diventare per numero copie inserite (2-100)

Effetto posizionale

Alterazione dell’espressione genica di un gene endogeno

I topi transgenici sono ottenuti microiniettando i frammenti di DNA contenenti il gene di interesse, nei pronuclei delle cellule uovo fecondate.

Il DNA si integra nel genoma e viene trasmesso alla progenie.

Il primo topo transgenico è stato prodotto da Palmiter e collaboratori nel 1982.

Gli organismi animali transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali pluripotenti.

Produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici

(insulina, GH, tPA, emoglobina)

Topi Umanizzati

Topi transgenici che contengono geni umani quali ad esempio enzimi metabolici della glicolizzazione, strutture neuronmembrane.

Sono modelli potenzialmente utili per:

• scoperta di biomarkers
• validazione di farmaci in test preclinici

Gene Targeting

Questa metodica (messa a punto dal biologo italo-americano Mario Capecchi (Premio Nobel per medicina nel 2007) insieme a Evans e Smithies) permette di ottenere mutanti knockout = KO

• pluripotenza delle cellule staminali embrionali (ES) di topo.
• Le ES pluripotenti derivano dalle cellule interne della blastocisti del topo e mantenitirsi in coltura anche lunghi periodi (Evans e Kaufman 1981, Robertson 1986). Queste cellule possono ricostituire le linee germinali, infatti restano a distribuirle un nuovo organismo diano e reintegrare o aggregare l'embrione (Evans e Kaufman 1981, Nagy 1993).
• ricombinazione omologa

Topo Chimerico

Le cellule staminali sono prelevate da un topo con il pelo marrone. Dopo la ricombinazione genica le ES sono indotte nella blastocistiproveniente da un topo albino.

Sono generati così modelli animali di malattie umane a carattere monogenico studiamenti disponibili.

• malattie metaboliche e ormonali:
• fibrosi cistica
• percepieradermia, pemfigoide, aritrosi ecc.
• malattie immunologiche ed ematologiche:
• Emofilia A
• Talasemia α e β
• Malattie gaiba vista e dell'udito:
• retiniti pigmentosa
• degenerazioni della retina
• Disfunzioni della crescita neurale:
• albinismo oculocutaneo
• sindrome di accompagnamento
• malattie neurologiche e neuro muscolari:
• Morbo di Alzheimer
• Atassia tardosecerde
• Malattie sindromi familiari di prediposizione al tumore:
• retinoblastoma, Sonic hedgehog
• sindrome di X(expesso) x delson
• sindrome di Gorlin (Ptch)

LE NUOVE FRONTIERE delle BIOTECNOLOGIE

• La BIOINFORMATICA (informatica applicata alla biologia molecolare) ha permesso di passare allo studio di singoli geni a quello dell'intero TRASCRITTOMA e PROTEOMA.
• Interferon da RNA (o RNAi) e microRNA, quest'ultimo permette di velenare la traduzione di mRNA complementari, rendendo possibile l'intervento sull'attività metabolica dell'organismo di interesse.

MICROARRAY: ANALISI dell'ESPRESSIONE GENICA

• banche di DNA relative ad organismi o a tessuti, pieghevole su microchips di pochi cm
• vengono ibridizzate da cDNA provenienti da mRNA estratti da cellule di altro
• inoltrano in tempi brevissimi inducendo mediante geni in condizioni specifiche.

sono supportate da una rapidissima analisi informatica

PERCHE' USARLI?

• Due microarray è la metodica che rileva i livelli di espressione genica di centinaia o addirittura migliaia di geni. Sezioni diversione degli geni sono attive o inattivi, ad esempio in cellule trattata co un farmaco specifico rispetto a cellule non trattate di controllo.

COME FUNZIONA?

1. Preparazione del microarray
2. Preparazione del cDNA dalle due popolazione cellulari
3. ibernazione delle 2 popolazioni di cDNA su microarray