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Il meccanismo dello splicing e gli spliceosomi
Per questo meccanismo sono necessari gli spliceosomi, grandicomplessi molecolari che promuovono e catalizzano lo splicing. Questi sono costituiti da 5 diversi tipi di RNA (U1, U2, U4, U5, U6) e da oltre 200 proteine. RNA e proteine sono organizzati in strutture dinamiche sul pre-mRNA formando gruppi di complessi RNA-proteine detti small ribonucleoprotein o snRNA, che prendono il nome dal tipo di RNA che contengono.
Gli snRNA:
- Riconoscono il sito di splicing al 5’ e il sito di ramificazione grazie a regioni complementari.
- Posizionano i siti di splicing in modo che possano avvenire le reazioni di transfericazione.
- Catalizzano tali reazioni (non intervengono ulteriori enzimi).
Dopo che gli snRNA hanno riconosciuto il sito di splicing, arrivano altri RNA e proteine e si forma il complesso dello spliceosoma: il pre-mRNA viene tagliato all’estremità 5’, questa nuova estremità viene legata ad un’adenina localizzata nella sequenza del punto di ramificazione.
siha la formazione di una struttura a cappio detta lariat. Viene quindi evidenziato il sito di splicing al 3’ e si ha il secondo taglio, l’introne viene così rilasciato e poi degradato. Il gruppo OH all’estremità 2’ dell’adenina si comporta da nucleofilo, lega quindi il fosfato libero al 5’ formando un legame diesterico; questo legame determina la rottura del legame tra l’OH all’estremità 3’ dell’introne e il fosfato all’estremità 5’ dell’esone, si stacca così la struttura a cappio e i due esoni vengono uniti tra loro.• Poliadenilazione: la poliadenilazione coincide con ka terminazione della trascrizione operata dall’RNA polimerasi II. Quando a livello del trascritto primario compare la sequenza AAUAAA (che individua il sito di poliadenilazione) si ha un taglio del filamento di RNA in via di trascrizione e la successiva aggiunta di una coda di poli A catalizzata dallaformattazione del testo utilizzando tag html:
poli A polimerasi.L'mRNA maturo non viene tutto trascritto, contiene infatti delle sequenze non codificanti a valle e amonte della zona centrale codificante dette 5'UTR e 3'UTR.Vi è un ulteriore fenomeno di modificazione detto splicing alternativo: un processo mediante il quale da uno stesso pre-mRNA si possono formare mRNA diversi unendo gli esoni in sequenze alternative.Questo fenomeno garantisce l'ampia diversità di proteine dei vertebrati.
Codice GeneticoQuando parliamo di trascrizione noi ci riferiamo semplicemente al fenomeno di passaggio dapolinucleotidi nel DNA (che viene semplicemente copiato in una sequenza di nucleotidi con le seguentidue differenze: U invece che T e ribosio al posto del desossiribosio) a un filamento complementare diRNA.Nella traduzione, che consiste nel passaggio dall'RNA ad una proteina, il linguaggio cambiacompletamente: da una sequenza lineare di nucleotidi ad una lineare di aminoacidi.Questo meccanismo di
La conversione (traduzione) del linguaggio viene esplicitato nel codice genetico, che ci rende chiara la corrispondenza tra nucleotide sul DNA e sull'RNA e aminoacidi della proteina. 85 Fin dai primi del 900 era chiara una correlazione tra genotipo e fenotipo che fu ampiamente studiata: inizialmente, per quanto riguarda gli enzimi, si capì che a livello del DNA vi dovevano essere delle regioni che codificassero per determinati enzimi (valutando effetti mutageni delle radiazioni sul DNA, ad esempio sulla neurospora crassa (muffa del pane) per determinare correlazione geni-enzimi). Vari altri esperimenti sono stati poi condotti per confermare la relazione tra informazioni genetiche locate nel DNA (geni) e proteine (Crick e Brenner, 1961). Non era tuttavia chiaro il meccanismo specifico per passare da geni a proteine. La corrispondenza tra nucleotidi e aminoacidi è una corrispondenza che prevede l'organizzazione del meccanismo traduzionale in triplette. Si suppose infatti
inizialmente che a 1 nucleotide corrispondesse 1 aminoacido; tuttavia, avendo solo 4 nucleotidi differenti, tutto ciò non spiegava la presenza di ben 20 differenti aminoacidi; si suppose allora che a ogni coppia di nucleotidi corrispondesse 1 aminoacido; tuttavia tutte le possibili coppie di nucleotidi sarebbero solamente 16 (4^2) e questa ipotesi ugualmente non spiegava la presenza di 20 aminoacidi. Si suppose infine che ogni aminoacido fosse codificato da triplette di nucleotidi: in questo modo le possibili combinazioni sono 64 (4^3), ben sufficienti a spiegare l'esistenza di 20 aminoacidi. Basandosi su queste ipotesi è stato ben identificato che a livello del DNA abbiamo una sequenza polinucleotidica trascritta poi in una sequenza nucleotidica di RNA che viene letta dall'apparato della sintesi proteica a livello dei ribosomi a triplette (codoni); 3 nucleotidi specificano per un aminoacido. Dei 64 codoni, 3 sono codoni di stop (indicano dove la sintesi proteica si interrompe).deve arrestare) e non codificano per nessun aminoacido (sono: UAA, UAG, UGA). Gli altri 61 codificano per aminoacidi.
Il codice genetico presenta due caratteristiche fondamentali:
- È degenerato (o ridondante): più codoni possono codificare per uno stesso aminoacido), tuttavia il codice genetico non è ambiguo, infatti uno stesso codone non codifica mai per 2 aminoacidi differenti.
- È universale: è valido in tutte le forma di vita conosciute, e ciò indica che tale meccanismo è filogeneticamente molto antico.
NB. Questa caratteristica ha una grande importanza applicativa: possiamo infatti far esprimere ad un batterio una proteina di interesse anche umana mediante l'inserzione della regione esonica del gene umano in un plasmide e poi nel DNA circolare batterico, si possono così produrre ormoni di natura proteica ma anche enzimi ricombinanti (costituiti da regioni proteiche del microorganismo patogeno da riconoscere in grado di
scatenare una adeguata risposta immunitaria senza inoculare il patogeno stesso vivo, morto o modificato che sia). Non è sovrapposto: i nucleotidi che fanno parte di un codone non possono appartenere anche ad un codone successivo. È continuo: non ci sono nucleotidi che non fanno parte di codoni. La decodifica del codice genetico è stata fatta intorno agli anni Sessanta (1960 e anni successivi). ESPERIMENTO DI NIRENBERG E MATTHAEI Questi scienziati misero a punto un sistema di sintesi proteica in vitro, dove ponevano un estratto batterico e dei ribosomi, fornendo poi una sequenza di polinucleotidi (inserendo in questa miscela degli aminoacidi marcati in modo tale da poterli evidenziare). I primi polinucleotidi che furono sintetizzati furono i poli-Uracile, poli-Adenina e il poli-Citosina. I polipeptidi che si ottennero da questo sistema in vitro furono per i poli U delle sequenze di fenilalanina, per i poli A esclusivamente lisina e per i poli C sequenze diprolina.Da qui si dedusse che il codone UUU codificava per la fenilalanina, l'AAA per la lisina e il CCC per la prolina.
Utilizzando combinazioni diverse di polinucleotidi sono stati identificati anche tutte le altre corrispondenze per arrivare a stabilire l'intero codice genetico.
L'essenza dell'espressione genica sta quindi nella decodifica di questo messaggio e nella linearità tra l'informazione presente a livello dell'RNA e la sequenza di aminoacidi che poi saranno uniti a livello della sintesi proteica a formare le proteine.
A questo punto possiamo dare una definizione di gene abbastanza generale.
Il gene è una porzione di genoma costituita da DNA e più raramente da RNA (nel caso di alcuni virus) ed è composta da sequenze trascritte e sequenze regolatorie (rappresentate da quelle regioni che sono presenti fuori dalla regione trascritta: enhancer, silencer, regioni promotrici che non sono necessariamente trascritte ma che fanno parte.
del gene nel suo complesso).Dal punto di vista dell'ereditarietà costituiscono le unità fondamentali vitali, cioè quelle che aveva individuato Mendel nei suoi studi. I prodotti dei geni non sono soltanto le proteine ma anche gli RNA funzionali che abbiamo descritto.
Traduzione del DNA
La traduzione è il processo attraverso il quale il messaggio codificato nella molecola di mRNA viene convertito in proteina. Tale processo avviene nel citoplasma, per cui gli mRNA dovranno essere trasportati attraverso i pori nucleari grazie al meccanismo delle esportine; i ribosomi liberi dovranno passare attraverso i pori nucleari per arrivare nel citoplasma (le due subunità giungeranno sempre separatamente).
Gli attori di questo processo sono sempre gli stessi in entrambi i casi:
- mRNA
- Ribosomi: complessi enzimatici costituiti da due subunità, una maggiore e una minore, che si uniscono solamente quando si legano al mRNA.
- tRNA: trasportano uno specifico
amminoacido legato all'estremità 3' (è sempre presente la• tripletta CCA). Nella regione inferiore si può riconoscere una tripletta di nucleotidi che prende il nome di anticodone, il quale si legherà allo specifico codone complementare presente sul mRNA.
87• Amminoacil tRNA sinetasi: enzima che catalizza il caricamento di un amminoacido sul relativo tRNA, formando il complesso amminoacil-tRNA. Ogni enzima legherà il tRNA e il corrispondente aminoacido. Legato l'ATP si lega l'aminoacido, poi l'ATP si idrolizza e si forma un intermedio, chiamato aminoacido attivato, in cui l'aminoacido è legato all'AMP perché vengono eliminati due fosfati sotto forma di pirofosfato (legati insieme e poi idrolizzati) e si viene a formare l'aminoacil-AMP. Questo intermedio è importante perché in questa forma l'aminoacido può essere trasferito al tRNA formando così l'aminoacil-tRNA.
che viene poi rilasciato nel citoplasma. In particolare, il gruppo COOH si legherà al 3' ossidrile del tRNA formando un legame estere, quindi si ha il legame dell'amminoacido al 3'. Questo è da sottolineare perché non è indifferente, infatti ci indicherà la direzione della sintesi proteica. L'amminoacido viene legato tramite la sua regione carbossilica all'OH del 3' ossidrile del tRNA (legame di tipo estere). In questo modo si forma l'amminoacil-tRNA. IPOTESI DEL VACILLAMENTO Quello che però è stato visto è che all'interno della cellula in realtà non ci sono 61 tRNA (61 è il numero di codoni codificanti amminoacidi), ma ce ne sono un po' meno (circa 40/50, dipende dalla specie). Quindi uno stesso tRNA può riconoscere codoni diversi purché codifichino per lo stesso amminoacido. Questo meccanismo è chiamato meccanismo del vacillamento, ed èdovuto al fatto che in prima base del tRNA (corrisponde al primo nucleotide)
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