Biologia generale e molecolare - Appunti

Biologia: Canale B Altruda-De Filippi-Turco

Introduzione

Il file che vedete comprende le parti delle tre professoresse che insegnano biologia nel primo semestre. Purtroppo, come potrete notare, la parte di genetica molecolare non ha le immagini, dal momento che quando l’avevo fatta io, le slides erano state rese disponibili dopo che avevo già completato il lavoro di stesura degli appunti. Ad ogni modo, per la parte di genetica molecolare, fatta dall'Altruda, ritengo che ci sia più o meno tutto.

Una lettura ai primi capitoli dell'Alberts è consigliata, soprattutto per quanto riguarda la riparazione del DNA che a noi è stata spiegata da una sua collega straniera non esattamente chiara in italiano. Noterete, poi, che questa parte è fatta in maniera schematica, ma se seguite le lezioni potete facilmente impostarci un discorso soprattutto se vi aiutate con l'Alberts.

Seconda parte: Biologia cellulare

Qui il discorso è piuttosto semplice: quello che c'è qui sono le parole della De Filippi, quindi si potrebbe pensare che c'è tutto. Effettivamente, lei tocca tutti gli argomenti che le interessa che voi conosciate, ma non approfondisce nulla, mentre all’esame fa domande specifiche (vedi 2012-2013: illustrare i meccanismi di controllo che avvengono in fase S del ciclo cellulare) cui ovviamente non saprete rispondere senza l’aiuto dell’Alberts. Purtroppo i capitoli sono parecchi e lunghi.

Terza parte: Lezioni della Turco

Sembra strano ma tutto quello che trovate qui, ovvero le lezioni della Turco, serve praticamente a nulla. Farà una o massimo due domande di teoria (tipo: in quale fase possiamo vedere i cromosomi omologhi al centro della cellula?) e il resto esercizi. Quindi, questa parte l’ho inserita solo per completezza.

Buono studio e spero possano esservi utili,

Edoardo

Genetica molecolare

Introduzione

Cellule procariote: non hanno nucleo e il DNA non è compartimentalizzato, ma sta nell’ambiente cellulare. Vivono da sé e svolgono da sole le loro funzioni. Cellule eucariote: sono cellule molto diverse tra loro. Il DNA si trova nel nucleo, organulo separato dal plasma. Così si controlla l’espressione genica e il DNA passa al citoplasma con l’RNA. Spesso vivono in organismi pluricellulari e si differenziano, fin dallo zigote.

Ci sono eccezioni: il lievito (vive da solo, ma è eucariote per le altre caratteristiche) e il Dictyostelium discoideum (vive da solo, ma in assenza di cibo si unisce per formare una struttura a stelo e risparmiare cibo: spore).

Batteriofago e virus

Batteriofago/fago: infettano la cellula eucariote. Non sono in grado di prodursi il materiale per vivere e riprodursi: si attaccano e con una lisi della parete iniettano il loro DNA e sintetizzano le loro proteine.

Virus: infettano le cellule batteriche. Come i fagi necessitano di una cellula di sponda per vivere e riprodursi. Sono in grado di portarsi via parte del materiale genetico della cellula ospite.

Progetto genoma umano

Progetto genoma umano: terminato nel 2001. Nel DNA umano vi sono 3x10⁹ bp (paia di basi) che corrispondono a solo 25,000 geni invece che 31,000. Gran parte del DNA non dà informazioni e anche se soprannominata junk non è inutile, ma non si sa ancora la sua funzione. Per esempio producono miRNA, regolatori di geni.

Genoma

Genoma: il DNA si riferisce ai nucleotidi, mentre genoma alla sequenza chimica di nucleotidi. I genomi batterici sono circolari e di 4x10⁶ bp per cellula batterica. Il genoma batterico è quasi per intero coperto di informazioni. Quello eucariotico non è circolare ed è costituito di cromosomi. Il 10% è costituito di geni. I fagi hanno un genoma simile a quello dei procarioti e i virus hanno un’organizzazione simile a quella degli eucarioti.

Proteine

Proteine: sono più amminoacidi legati tra loro: più di 20. Gli amminoacidi si legano tramite il legame peptidico e le proteine tramite legame ionico/idrogeno. Struttura primaria: legami peptidici. Struttura secondaria: è il ripiegamento; ad alfa-elica o foglietto-beta. Struttura terziaria: compatta ancora la proteina con legami intracatena. Struttura quaternaria (solo per proteine con più catene polipeptidiche): legami tra le varie catene. Sono un gruppo eterogeneo: enzimi (proteine responsabili delle reazioni metaboliche), i fattori trascrizionali...

Plasmidi

Plasmidi: sono molecole di DNA circolari o no. Di solito piccoli, circa 1x10³ nucleotidi. Si trovano nelle cellule batteriche. I geni più importanti che danno la resistenza agli antibiotici. In ambiente sfavorevole: sono mantenuti nelle cellule batteriche e dipendono da queste per le funzioni di sintesi; oppure la cellula batterica ne trae vantaggio.

Cloroplasti e mitocondri

Cloroplasti e mitocondri: il DNA è presente in essi. Il DNA mitocondriale è più piccolo di quello genomico. Su di esso esistono geni che codificano proteine utili al mitocondrio. Genoma circolare simile a quello batterico.

Storia del DNA

Gli acidi nucleici sono stati riconosciuti alla fine degli anni '70 dell’800. All’inizio del ‘900, Ganod propone la teoria cromosomica dell’eredità. Si sapeva che le proteine erano composte da 20 amminoacidi e che il DNA da 4 nucleotidi: ecco perché si era convinti che le informazioni ereditarie fossero contenute nelle proteine.

La dimostrazione sperimentale arrivò grazie ad esperimenti sui batteri: sono facili da crescere e il loro ciclo vitale è rapido. Griffith negli anni ’40 cercò di scoprire quale molecola nella cellula batterica portasse le informazioni: usò batteri S (inoculandoli in un topo questo moriva perché vi era una tossina) e batteri R (inoculandoli in un topo sopravviveva perché non conteneva tossine). Crescendo su un substrato gelatinoso R e S davano origine a colonie riconoscibili. Il ceppo S veniva ucciso dal calore e nel topo portava a non morire. Ceppo S (ucciso dal calore) + ceppo R portava lo stesso alla morte del topo perché dei batteri sono vivi. Una parte dell’informazione è ancora presente nei batteri uccisi dal calore.

Nel 1944 il gruppo di Avery cerca di capire se sono proteine o DNA a portare informazione. Purifica proteine e DNA dal ceppo S. Ceppo R + proteine → il topo vive; ceppo R + DNA → il topo muore. Il DNA ripristina le funzioni del ceppo S. Prima trasformazione: passaggio di DNA da un batterio a un altro.

Nel 1952 Hershey e Chase utilizzarono batteriofagi e marcarono selettivamente le 2 molecole componenti un fago: acido nucleico e capside fatto di proteine poco eterogenee. Marcare = inserire un elemento radioattivo nella composizione di DNA e delle proteine. Il DNA è ricco di atomi di P (isotopo 32) e nelle proteine vi è S (isotopo 35). Inseriti gli isotopi nella coltura i fagi diventano radioattivi. Infettati fagi non marcati e centrifugandoli, i batteri si accumulano sul fondo e lì si trova il fosforo. Con lo zolfo invece si ottiene una struttura proteica che sta all’esterno della cellula. Informazione nel DNA quindi.

Struttura acido nucleico

Watson e Crick studiarono negli anni ’50 la struttura dell’acido nucleico partendo da alcuni dati:

• Struttura dei nucleotidi (ribosio/desossiribosio + basi puriniche/pirimidiniche). Nucleoside: zucchero + base azotata; nucleotide difosfato/trifosfato: idrolisi dei legami tra gruppo fosfato dà energia, reazione esoergonica.
• Chargaff notò che le basi puriniche erano uguali in % a quelle pirimidiniche. %A=%T e %G=%C;
• Analisi cristallografica: periodicità della molecola. Il DNA è formato da 2 filamenti posti in modo antiparallelo. Orientamento 5’→3’ (1° nucleotide e ultimo non legati a nulla): così si rispetta la simmetria cristallografica.

Nucleotidi

Nucleotidi: gli zuccheri stanno all’esterno e P ancora più all’esterno. Le basi azotate stanno all’interno e sono legate con legami a idrogeno. L’elica ha orientamento destroso. Distanza nucleotide-nucleotide = 0,34 nm; ripetizione dell’elica = 3,4 nm. I legami del DNA sono complementari e ciò spiega anche come si replica. Le sequenze A-T sono meno stabili di quelle G-C. I legami idrogeno tra nucleotidi semplificano la duplicazione e la trascrizione del DNA.

Dimensione genoma

• Procarioti: Escherichia coli 4,64x10⁶ geni
• Eucarioti: Saccaromices cerevisiae 12x10⁶ geni
• Drosophila melanogaster 140x10⁶ geni
• Homo sapiens 3000x10⁶ geni
• Salamandra 90000x10⁶ geni

DNA nucleare

DNA nucleare: è tutto compattato grazie alla formazione del filo di perle. Si sfruttano gli istoni (circa 100 amminoacidi) e sono in varie classi: H1, H2A, H2B, H3, H4. Sono proteine più basiche del normale e tra le più conservative (una proteina è conservata quando la sua struttura primaria è poco variabile da specie a specie). Gli istoni hanno lo scopo di contattare il DNA e dare origine al filo di perle: queste perle sono nucleosomi formati da DNA che avvolge le proteine istoniche. Ogni istone: il DNA fa 2 giri. In ogni sacchetto istonico vi sono 2 proteine H2A, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4. Dove entra e esce il DNA dal sacchetto vi è un istone H1. Nell’avvolgersi sono impegnati 146 nucleotidi. Dall’avvolgimento elicoidale del filo di perle si ha la fibra (30 nm). Essa dà origine a grandi anse, basandosi su una struttura proteica. Con ulteriori e sconosciuti compattamenti si arriva al cromosoma.

Duplicazione del DNA

Duplicazione DNA

Tutti gli organismi devono duplicare il loro DNA prima di ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare procariote è molto rapido ed è costituito da un’unica fase, mentre quello eucariote ha più fasi: in quella S avviene la duplicazione. La velocità del ciclo dipende dal tipo di cellula: quello delle cellule adulte è normalmente più lungo.

Fasi del ciclo cellulare

• Fase M: fase di mitosi/meiosi
• Fase G1: dopo la divisione si ricostruiscono le strutture, gli organelli e le proteine. Alcune cellule non vanno subito in fase M e allora restano in G1. Ecco perché è una fase con lunghezza varia.
• Fase S: sintesi del DNA. Qualche ora in tutte le cellule.
• Fase G2: tutte le modificazioni pre-fase M

Fase S

Replicazione studiata per la prima volta nei batteri. Si passa da una molecola di DNA a due nuove molecole identiche all’originale. Si aggiungono desossiribonucleotidi basandosi sul principio di complementarità: A-T e C-G. Per creare i legami fosfodiestere occorre energia. Un meccanismo che deve essere perfetto e si suddivide in tre possibilità:

• Conservativo: due molecole di DNA, una del tutto nuova e l’altra è l’originale.
• Semiconservativo: due molecole di DNA con un filamento originale e uno nuovo.
• Dispersiva (presto abbandonata): si presupponeva la formazione di nuove eliche con tratti di nuovo e tratti di vecchio.

Meselson e Stahl hanno dimostrato che è semiconservativo.

Processo di duplicazione

La molecola che duplica è un enzima che catalizza l’aggiunta di desossiribonucleotidi: DNA polimerasi. Vi sono varie isoforme di questo enzima, ma le caratteristiche sono comuni:

• Non sono in grado di idrolizzare i legami idrogeno per separare i due filamenti di DNA.
• Tutte le DNA polimerasi hanno bisogno di uno stampo da cui copiare (deriva da un’elica preesistente).
• Sono in grado di allungare un filamento di DNA e RNA, ma non possono iniziare ex-novo la sintesi di una nuova catena di DNA.
• I due filamenti sono antiparalleli: 5’→3’ e 3’→5’. Tutte le DNA polimerasi catalizzano l’aggiunta di un nucleotide solo all’estremità 3’. Quindi vanno solo in 5’→3’.
• Il substrato sono solo i 4 nucleotidi trifosfato.
• Dietro vi sono attaccate delle strutture che spingono la polimerasi a sintetizzare in modo processivo: la struttura si dice pinza. Senza di essa procederebbe troppo lentamente.

Luogo di duplicazione

Il processo avviene in una forcella. La DNA polimerasi agisce solo più in là. In un punto i due filamenti si separano e lì si ha la forcella di replicazione. Una molecola di DNA in cui i due filamenti sono separati lungo un tratto che funge da stampo.

I due filamenti

Sono sintetizzate due molecole. Quello in cui la sintesi avviene in modo continuo si chiama filamento guida, mentre quello dove avviene in modo discontinuo filamento ritardato. Essendo la duplicazione bidirezionale si hanno due forcelle (per procarioti no dato il DNA circolare).

DNA elicasi

Si occupa di svolgere l’elica a livello della forcella rompendo i legami a idrogeno. Come un cuneo separa i due filamenti. La sua attività richiede idrolisi di ATP. Una delle prime proteine ad agire nella duplicazione.

DNA primasi

Le polimerasi non iniziano la sintesi, ma serve un 3’ libero perché si attivino. La primasi, appunto, forma un certo tratto di RNA (una decina di nucleotidi) che è l’innesco. L’innesco serve per la polimerasi che può catalizzare l’aggiunta di desossiribonucleotidi. Nel caso di sintesi discontinua, la polimerasi incontra più primer e ricomincia più volte la sintesi. Gli inneschi (RNA primer) sono sintetizzati ogni 200 nucleotidi e sono eliminati successivamente da un enzima di riparazione. A rimettere insieme i vari pezzi ci pensa la DNA ligasi che ricrea i legami fosfodiestere. Questi frammenti sono detti frammenti di Okazaki.

Proteine SSB

Proteine leganti il singolo filamento, una volta che si è aperta la molecola. Servono a impedire la riformazione dell’elica date le forze dei legami tra nucleotidi.

Modo di sintesi

Nei batteri sono prodotti 1000 nucleotidi al secondo e negli eucarioti 100. Vi sono due filamenti e due DNA polimerasi che procedono in versi antiparalleli. I due enzimi sono tenuti vicini da una proteina e se per quello continuo non si pongono problemi, per quello ritardato invece, più ci si allontana dai due centri più si cresce l’ansa.

DNA polimerasi nei batteri

Sono di tipo I, II e III. Direzione 5’→3’. Attività esonucleasica (indica l’attività di un enzima in un tratto di DNA che trovate le estremità di un acido nucleico lo elimina; N.B. l’attività endonucleasica degrada il DNA non dalle estremità ma dall’interno dell’elica): 3’→5’ (I,II e III) e 5’→3’ (I).

Con tale attività si correggono gli errori. Solitamente la polimerasi commette un errore ogni 10⁴ nucleotidi, ma alla fine della replicazione risulta solo 1 errore ogni 10⁹. Quando si ha un errore l’elica si destabilizza e la DNA polimerasi degrada idrolizzando tutto ciò che ha sintetizzato fino all’errore che va a correggere per poi riprendere la sintesi: funzione detta di correttore di bozze. Tuttavia: troppe mutazioni vuol dire danni, ma nessuna vuol dire mancanza di vita. Una percentuale di errore garantisce la variabilità. La mutazione che blocca la polimerasi 3 porta alla morte. Vi sono 400 enzimi di polimerasi I e pochi di polimerasi III.

DNA polimerasi in un mammifero

5’→3’ (α,β,γ,δ,ε); esonucleasica 3’→5’ (γ,δ,ε); localizzazione nucleare (α,β,δ,ε) e mitocondriale (γ). α e β servono per correggere il DNA mentre δ e ε per la sintesi: δ allunga i primer e ε sintetizza il tratto continuo.

L’origine della replicazione

L’origine è unica, ma negli eucarioti vi sono più origini (più cromosomi infatti). Vi sono 10,000 origini per cromosoma per rendere rapida la duplicazione. Il segnale dell’origine è una sequenza specifica che fa capire che lì avviene il processo di replicazione. Si forma così la bolla. All’origine si attaccano le proteine iniziatrici. Origine ricca di A e T (rendono più facile l’apertura) richiama le proteine iniziatrici poi DNA con DNA elicasi e così via...

Topoisomerasi

Proteine con il ruolo di togliere gli avvitamenti dell’elica di DNA quando la cellula non è in fase di mitosi: quando è una matassa. Vi è topoisomerasi I e II. Si legano in modo reversibile, ma covalente al DNA idrolizzando e rompendo i legami tra nucleotidi. Questo porta allo srotolamento del DNA: dopo questo legame covalente temporaneo si stacca e riunisce i due nucleotidi (la I). LA topoisomerasi II taglia entrambi i filamenti di DNA e non uno. Si lega a uno dei tratti in modo covalente così che le maglie della catena non siano più incatenate e poi ristabilisce il legame tra nucleotidi.

Sequenza telomerica

Gli estremi di un cromosoma, dei filamenti di DNA. Sono sequenze molto ripetitive. La telomerasi genera la sequenza ripetuta e si associa con pochi nucleotidi del telomero esposto (3’ libero): copia e aggiunge nucleotidi di DNA complementari al filamento. Poi si riporta di nuovo nel 3’ e risintetizza un altro tratto per molte volte. Allungato un filamento l’altro si allunga in modo complementare. Queste sequenze non codificano proteine. Senza telomerasi a ogni ciclo i cromosomi si accorciano. Molto attiva nell’embriogenesi, ma sparisce quasi nell’adulto se non nelle cellule tumorali. Sono associati all’invecchiamento e sono importanti in medicina rigenerativa: senza di essi si arriva alla non fertilità, perché non sono rimpiazzabili.

Approfondimento

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