Biologia Generale e Cellulare II, Crimi

Laura Tomellini, biologia generale e cellulare II

Università degli Studi di Verona

CdL Biotecnologie (L-2) a.a. 2019-2020

Il ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è una serie di eventi ordinati che avviene nelle cellule eucariotiche e che porta alla crescita e alla duplicazione cellulare. Il ciclo si compone di diverse fasi (fase G₁, fase S, fase G₂ e fase M), ognuna delle quali è legata a eventi particolari. Il periodo di tempo che precede la divisione cellulare (M) è detto interfase: in una cellula di mammifero, l’interfase può durare sino a 23 ore in un ciclo di 24, con la fase S che può richiedere sino a 10-12 ore; quest’ultima, infatti, è la fase di replicazione del DNA. Le fasi G₁ e G₂ (fasi GAP) servono all’accrescimento della cellula, che consiste nell’aumentare il contenuto in proteine e organelli.

Il ciclo non avviene continuamente per tutte le cellule: avviene solo se vi sono le condizioni e se le cellule hanno ricevuto segnali che inducano alla divisione. Esistono anche cellule che non vanno incontro a divisione e che restano bloccate, anche per tutta la loro vita, in una fase di quiescenza (fase G₀). Nel caso in cui le condizioni non siano favorevoli, anche una cellula in fase G₁ che si deve dividere può fermarsi in una fase G₀ e completare la divisione in un secondo momento. Anche la fase G₂ può essere bloccata, ma transitoriamente: una volta che la fase S è stata completata, il materiale genetico è duplicato, quindi la cellula è comunque destinata a dividersi.

Sistema di controllo del ciclo cellulare

Le diverse fasi sono soggette a controlli, grazie all’esistenza di "sensori" che assicurano che tutto si stia svolgendo nel modo corretto e che bloccano il processo nel caso in cui l’evento non sia stato completato. È quindi necessario un sistema di controllo che permetta di far fluire il ciclo correttamente; questo sistema deve possedere: interruttori che accendono e spengono i singoli eventi, un timer per determinare l’inizio e la durata degli eventi, un meccanismo per ordinare gli eventi e un meccanismo che assicuri che ciascun evento abbia luogo una sola volta per ciclo. Inoltre, il sistema dovrà potersi adattare a tipi cellulari specifici e alle diverse condizioni ambientali.

Esperimenti di fusione cellulare dimostrano il ruolo di segnali chimici citoplasmatici nella regolazione del ciclo cellulare: due cellule in stadi diversi del ciclo cellulare vengono fatte fondere (impulsi elettrici, proteine virali, ecc.) formando così una cellula unica con due nuclei (eterocarion). Per esempio, fondendo una cellula in fase S (che sta dividendo il materiale genetico) con una cellula in fase G₁ (che ancora sta preparandosi per giungere alla fase S), viene indotto il passaggio della cellula in fase G₁ alla fase S: questo dimostra la presenza di un segnale di inizio della fase successiva. Fondendo, invece, una cellula in fase M (che si sta già dividendo) con una cellula in fase G₁ (che non ha ancora duplicato il materiale genetico), la cellula in fase G₁ comincia la divisione, nonostante non abbia il materiale genetico duplicato per dividersi: questo dimostra che, una volta indotto il passaggio in una fase successiva, questo non può essere fermato.

Punti di controllo del ciclo cellulare

Durante il ciclo cellulare, il passaggio alla fase successiva è determinato da punti di controllo che agiscono come dei freni di emergenza: il sistema va avanti in modo autonomo a meno che non ci sia la necessità di fermarlo a seguito di alterazioni. I punti di controllo si trovano in G₁, per stabilire l’ingresso in S, e in G₂, per stabilire l’ingresso in M. Il punto di controllo G₁ dipende dalla presenza di nutrienti e di fattori di crescita che inducano la cellula a dividersi; inoltre, è necessario che il DNA sia intatto e che le dimensioni della cellula siano idonee.

L’ingresso in fase M, invece, avviene solo se il DNA è intatto e si è replicato completamente (verificabile grazie a marcatori molecolari) e se le dimensioni della cellula sono idonee. Nel caso in cui il DNA non sia totalmente replicato, la cellula può fermare il ciclo e appurare se è possibile ripararlo; in caso contrario, la cellula non entrerà in fase M.

Ulteriori esperimenti hanno dimostrato la presenza di un fattore citoplasmatico che controlla il passaggio alla fase M. Infatti, il citoplasma estratto da ovociti che hanno subito la transizione da G₂ a M, micro-iniettato in ovociti bloccati in G₂, induce la transizione alla fase M. Questo trasferimento citoplasmatico induce la transizione da G₂ a M in assenza di stimolazione ormonale (progesterone), dimostrando che un fattore citoplasmatico (Mitosis-Promoting Factor, MPF) è sufficiente per indurre l’ingresso nella fase M della meiosi.

Il fattore MPF

Il fattore MPF si compone di due proteine, la ciclina e la chinasi ciclina dipendente (Cdk). Le Cdk sono presenti nel citoplasma inattivate e la loro attività è regolata dalla presenza delle proteine cicline, in grado di legarsi a questi enzimi. Nel ciclo cellulare vi sono diverse chinasi specifiche per ogni passaggio alla fase successiva, determinati dalle cicline. Infatti, raggiunto un valore soglia di concentrazione della ciclina (accumulata, per esempio, durante l’interfase), questa si lega alla chinasi; a quel punto, l’attività chinasica si innesta e comporta il passaggio dall’interfase alla fase M. Successivamente, con la degradazione e la diminuzione di concentrazione di ciclina, l’attività della Cdk si arresta. Si tratta quindi di un sistema cellulare di misura del tempo che garantisce il corretto susseguirsi degli eventi del ciclo cellulare.

Chinasi e fosforilazione

Le chinasi sono enzimi appartenenti alla famiglia delle fosfotransferasi in grado di trasferire gruppi fosfato da molecole donatrici ad alta energia (come l’ATP) a specifici substrati (fosforilazione).

Esistono diverse cicline e diverse chinasi che controllano i vari passaggi: le principali sono S-Cdk, che regola l’entrata nella fase S, e M-Cdk, che regola l’entrata nella fase M. Tra i bersagli che la Cdk va a fosforilare, vi è anche un enzima che lega ubiquitina alla sua ciclina: in questo modo, la proteina viene riconosciuta come proteina da distruggere, viene degradata e la Cdk viene inattivata.

L’attivazione della chinasi ciclina dipendente, in realtà, non avviene in seguito al legame con la ciclina, ma è necessario l’intervento di altri enzimi, la chinasi attivatoria e la chinasi inibitoria, che fosforilano il complesso; questo permette di controllare che le condizioni siano ideali a procedere con il ciclo. Il complesso ciclina-chinasi viene quindi attivato solo attraverso una fosfatasi attivatrice che rimuove il fosfato inibitore.

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA ha inizio dalle origini di replicazione, sequenze di nucleotidi che sono sparse lungo ciascun cromosoma. Queste sequenze reclutano proteine specifiche che controllano l’avvio e il completamento della replicazione del DNA. Un complesso multiproteico, il complesso di riconoscimento dell’origine (Origin Recognition Complex, ORC), rimane legato alle origini della replicazione durante tutto il ciclo cellulare, dove funge da piattaforma di atterraggio per ulteriori proteine regolatorie che si legano prima dell’inizio della fase S.

Una di queste proteine regolatorie, chiamata Cdc6, è presente a bassi livelli durante la maggior parte del ciclo cellulare, ma la sua concentrazione aumenta transitoriamente all’inizio della fase G₁. Quando la Cdc6 si lega agli ORC in G₁, promuove il legame di ulteriori proteine per formare un complesso pre-replicativo. Una volta assemblato, questo complesso di proteine segnala che l’origine di replicazione è pronta ad essere attivata. L’attivazione della S-Cdk alla fine della fase G₁ determina poi l’inizio della replicazione del DNA. La S-Cdk non avvia solo la replicazione; aiuta anche a prevenire la ri-replicazione del DNA.

La S-Cdk attivata è coinvolta nella fosforilazione della Cdc6, facendo sì che essa e le altre proteine del complesso pre-replicativo si dissocino dall’ORC dopo che l’origine è stata attivata; questo disassemblaggio impedisce di ripetere la replicazione alla stessa origine. Oltre a promuovere la dissociazione, la fosforilazione della Cdc6 da parte della S-Cdk (e della M-Cdk poi, che diventa attiva all’inizio della fase M) lo contrassegna per la degradazione, garantendo che la replicazione del DNA non venga riavviata successivamente nello stesso ciclo cellulare.

Sensori molecolari e controlli del ciclo

Sensori molecolari, molti dei quali di natura sconosciuta, controllano che ciascuna fase sia stata completata nella maniera dovuta. Nel caso di errori, i sensori bloccano l’attività dei rispettivi complessi Cdk. Il punto di controllo meglio conosciuto è quello che blocca le cellule nella fase G₁, nel caso di DNA danneggiato: replicare DNA danneggiato nella fase S è infatti estremamente pericoloso in quanto porterebbe all’introduzione di mutazioni.

La proteina coinvolta nel passaggio dalla fase G₁ alla fase S è la proteina p53; si tratta di una proteina che la cellula produce e degrada continuamente. Nel momento in cui, però, vi sono danni al DNA, causati, per esempio, da radiazioni di raggi X, le regioni danneggiate attivano proteinchinasi che fosforilano la p53. In questo modo, la proteina non viene più degradata, bensì va a legarsi al DNA in una regione che attiva la trascrizione di un gene specifico, il gene p21, che, una volta trascritto in mRNA, produce la proteina p21 che, nel nucleo, è in grado di legare la S-Cdk.

La chinasi e la ciclina non possono più, quindi, subire i processi finali di attivazione (rimozione del fosfato inibitore) e restano inattive: così la cellula non entra in fase S e non può replicare il suo DNA. Potrà farlo solo nel momento in cui il DNA verrà riparato, la chinasi verrà disattivata e la p53 comincerà a essere nuovamente degradata. Questo meccanismo è legato alla morte cellulare: infatti, la p53 agisce anche su un’altra via di segnale nel caso in cui il DNA non venga riparato, inducendo l’apoptosi.

Punti di controllo nel ciclo cellulare

Punti di controllo si trovano in tutte le fasi del ciclo cellulare e la loro azione inibitrice risponde a stimoli ambientali o ad alterazioni di processi molecolari fondamentali. Per esempio, esiste un punto di controllo che previene l’uscita dalla fase S nel caso in cui regioni del DNA non siano state ancora completamente replicate; un altro è quello della fase G₂, che controlla se il DNA è danneggiato o non è stato del tutto replicato; infine, il ciclo può essere bloccato all’inizio della fase M se i cromosomi sono mal fissati al fuso mitotico.

La fase S

La replicazione del DNA avviene durante la fase S del ciclo cellulare. La replicazione fedele del DNA è essenziale per trasferire alle cellule figlie la stessa informazione genetica. Durante la replicazione, ognuno dei due filamenti antiparalleli della doppia elica del DNA viene copiato per generare due nuovi filamenti, che si legheranno a quelli parentali utilizzati come stampo. Questo modello di replicazione, proposto da Watson e Crick nel 1953, prende il nome di replicazione semiconservativa, ma non è l’unico: secondo il modello conservativo, la formazione della nuova doppia elica deriva dall’unione dei due filamenti neosintetizzati, mentre, secondo il modello dispersivo, alcune regioni vengono replicate su un filamento, altre sull’altro, e quindi i filamenti di DNA delle cellule figlie saranno una chimera con parti direttamente ereditate e parti neosintetizzate.

Esperimenti hanno dimostrato che la replicazione avviene secondo il modello semiconservativo, ossia la doppia elica si apre creando una forcella replicativa e i due filamenti fungono da stampo per generare i nuovi filamenti di sintesi; ogni cellula eredita, quindi, un filamento parentale e un filamento nuovo.

Esperimenti sulla replicazione del DNA

Il primo esperimento è stato condotto su batteri incubati con timidina triziata ([³H]timidina), a cui è stato permesso di andare incontro a un ciclo cellulare; la molecola di DNA figlia avrebbe dovuto possedere un filamento radioattivo e uno no, se la replicazione fosse stata veramente semiconservativa (l’autoradiografia mostra, infatti, un solo filamento circolare punteggiato, ossia quello neosintetizzato, poiché quello parentale non è radioattivo). A questo punto, anche le cellule figlie sono andate incontro a divisione e l’autoradiografia ottenuta durante il processo denota la presenza di un nuovo filamento radioattivo.

L’esperimento definitivo che ha permesso di comprovare questa teoria è stato realizzato con azoto pesante (¹⁵N): sono state fatte crescere cellule batteriche per molte generazioni in un ambiente contenente ¹⁵N, di modo che al loro interno avessero solo DNA con azoto pesante. Centrifugando il DNA di queste cellule su gradiente di densità (ottenuto con cloruro di cesio, CsCl), esso si va a disporre in una banda specifica. Le cellule con DNA formato da basi con ¹⁵N sono poi state poste in un terreno di crescita con azoto naturale (¹⁴N) per una generazione. Centrifugando il DNA delle cellule figlie, la banda di densità risulta fermarsi in una posizione più elevata rispetto a quella del DNA pesante: l’interpretazione è che il DNA pesante è andato diviso ugualmente nel DNA delle cellule figlie, insieme a del DNA leggero di neosintesi. Facendo nuovamente dividere queste cellule in terreno leggero e centrifugando il DNA, si otterranno due bande: una di DNA ibrido e una di DNA leggero. Questo perché nella seconda generazione una doppia elica sarà formata da due filamenti di DNA leggero, mentre un’altra doppia elica deriverà dalla replicazione di un filamento parentale pesante.

Duplice direzione della replicazione del DNA

Comprovata la teoria, rimane da capire se, in cellule procariotiche, il DNA si replica a partire dall’unica origine di replicazione andando solo in una direzione o in entrambe le direzioni. Il primo processo sarebbe più lento, il secondo più rapido. Grazie allo studio a microscopia elettronica del DNA batterico, è stato possibile osservare che l’apertura della forcella dall’origine di replicazione proseguiva in modo bidirezionale. L’origine di replicazione è una particolare sequenza nucleotidica; i due filamenti di DNA che dovranno fare da stampo sono separati da particolari proteine dette proteine iniziatrici. Nei batteri, questo processo è connesso con l’induzione sulla membrana della strozzatura che porta poi alla divisione nelle due cellule figlie.

Replicazione del DNA negli eucarioti

Negli eucarioti, la replicazione del DNA è più complicata, in quanto il sito di inizio non è uno solo, ma molti, e i cromosomi non sono circolari e sono molteplici. Ognuno dei cromosomi possiede diverse origini di replicazione e coinvolge repliconi multipli: le bolle di replicazione formate dalle origini avanzano fino a fondersi l’una all’altra e creare il cromosoma completo. L’avanzamento della bolla di replicazione, come nei batteri, è bidirezionale.

Il DNA non riprende a duplicarsi fino a che la cellula non ha completato il proprio ciclo: questo fenomeno è stato studiato molto per capire il motivo per cui le fasi non si ripetano prima che sia terminato un ciclo. Rispetto alla fase S, è stato studiato in modo molto dettagliato ed è stato scoperto che, per duplicare il DNA, c’è bisogno di un macchinario di autorizzazione alla replicazione: fino al momento in cui non si esce dalla fase M, il DNA non può essere replicato, in quanto un sistema proteico (che comprende, per esempio, la geminina) inibisce il licensing system, quello che autorizza il DNA a prepararsi alla replicazione. Quando il DNA è stato replicato durante la fase S, viene inibita ogni possibilità di avere un’ulteriore copia di quel DNA grazie alla presenza di proteine e della M-Cdk che, al termine della fase G₂, permette l’ingresso in fase M. Una volta terminata la fase M, la Cdk viene inibita, la geminina degradata e si attiva il processo di assemblaggio del complesso di pre-replicazione: infatti, nella fase G₁, il DNA viene preparato per poter entrare nella fase di replicazione; tra le proteine assemblate vi sono le ORC e le proteine di caricamento delle elicasi. Una volta attivata, la S-Cdk scatena l’attività del complesso di pre-replicazione, facendo avviare la replicazione del DNA. Questo fa sì che il ciclo di replicazione del DNA avvenga soltanto in questa fase e, una volta terminato, sia inibito per tutto il tempo necessario a finire il ciclo e a entrare in fase G₁, dove avviene nuovamente l’assemblaggio del complesso di pre-replicazione. Questo è un esempio di come gli eventi di una fase del ciclo non possano essere ripetuti prima che tutto il ciclo sia concluso.

DNA elicasi e il processo di separazione della doppia elica

Una delle proteine che partecipano allo scatenarsi della replicazione è la DNA elicasi, in grado di legarsi al DNA e separare la doppia elica nei suoi due filamenti. Questo processo determina la rottura dei legami idrogeno tra le basi azotate: l’energia necessaria è fornita dall’idrolisi di ATP che avviene all’interno di questo complesso enzimatico, che la utilizza anche per avanzare sul filamento di DNA. La DNA elicasi è una proteina dalla struttura esagonale, formata da sei subunità uguali che non hanno, però, una simmetria totale: durante l’attività, infatti, l’idrolisi dell’ATP induce in alcune subunità una conformazione differente.

Le DNA elicasi agiscono ai due lati della forcella che deve essere aperta e permettono l’apertura della doppia elica scorrendo sul filamento. Le sei subunità si presentano in tre conformazioni differenti, a seconda che leghino ATP, ADP e gruppo fosfato.