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Biologia dello sviluppo, lezioni Appunti scolastici Premium

Appunti di biologia applicata indirizzo biomedico, esame biologia dello sviluppo basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Garagna dell’università degli Studi di Pavia - Unipv, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia dello sviluppo docente Prof. S. Garagna

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ESTRATTO DOCUMENTO

Protostomi abbiamo snodo che da vita a blastomeri con una simmetria a spirale, oppure alla schiusa (molting) con

stadio larvale. Sia Protostomi che Deuterostomi,

presentano durante lo sviluppo

embrionale tre foglietti embrionali e

questo è un altro snodo rispetto ai

Diblasti. Ctenofori e Cnidari sono

diblastici. Snodo ulteriore, e qui siamo

proprio agli arbori, è quello dei Poriferi.

Tutti gli snodi sono legati a diverse

modalità di segmentazione e

gastrulazione e sulla generazione di due

o tre foglietti embrionali. Quindi tutto il

mondo vivente può essere classificato

semplicemente osservando i primi stadi

dello sviluppo embrionale.

Studi recenti hanno dimostrato che il

foglietto embrionale evolutivamente più

recente, che è il mesoderma, non esiste

nei Diblasti come foglietto organizzato,

ma come cellule che hanno

caratteristiche assimilabili al mesoderma

dei Diblasti.

Indipendentemente dal gruppo che

analizziamo, esiste uno stadio, chiamato

“Stadio Filotipico” che è comune a tutti.

In questo stadio gli embrioni hanno

definito gli assi corporei (destro-sinistro,

anteriore-posteriore, dorsale-ventrale), il

tubo neurale, i somiti, la notocorda, la

struttura della testa. Durante questi primi

momenti dello sviluppo, fondamentale è

la conformazione dei patterns, quello che

darà vita sostanzialmente alla morfologia

finale.

Si riconosce anche una simmetria del

corpo che però non è poi così perfetta. 5

Ecco cosa verrà studiato (guarda slide sotto):

Al termine della Segmentazione abbiamo due tipi cellulari diversi: trofectoderma e cellule della massa cellulare.

Un altro momento clou del differenziamento cellulare, è quando si distinguono le cellule germinali, quel gruppo

di cellule che darà origine al patrimonio riproduttivo dell’individuo, rispetto le cellule somatiche. Le cellule

germinali si originano in una regione extraembrionale, poi migreranno all’interno dell’embrione. Da queste cellule

si origineranno gli spermatozoi o gli oociti; quelle quattro-cinque

cellule in origine daranno vita a milioni di altre cellule. La cosa

straordinaria ed esclusiva delle cellule germinali (e che le differenzia

anche rispetto le cellule somatiche), è che queste stesse cellule

possono dare origine tanto a spermatozoi quanto a oociti. Tant’è che

queste stesse cellule, che poi si posizioneranno nella zona specifica

dell’embrione, le creste genitali (pari), nella commistione di cellule

somatiche e genitali, possono dare origine sia a testicoli che ovari;

vengono chiamate infatti bipotenti e non esiste nessun altro

esempio, nello sviluppo di un organismo, con questa potenzialità così

straordinaria. Serve solo un piccolo trigger, in un certo momento

dello sviluppo embrionale, che definirà se il destino di quelle cellule

sarà di dare origine ad una cellula germinale femminile, un ovario, o

spermatozoo e testicolo.

Le cellule germinali sono deputate alla continuità della specie e le

cellule somatiche sono quelle danno vita al soma. Estremizzando,

solo le cellule somatiche moriranno, ma le cellule germinali avranno

vita infinita perché fondendosi daranno vita ad un nuovo embrione. Gli psicobiologi dicono che amiamo tanto i

nostri figli proprio perché sono la continuazione di noi stessi. Altro aspetto importante è che qualunque

mutazione che avvenga in maniera somatica è indifferente alle generazioni successive, mentre mutazioni che

avvengono nella linea germinale, sono estremamente importanti per le generazioni successive, perché sono le

uniche che vengono ereditate; dopo di che se si affermerà o meno la mutazione, dipenderà da altro. 6

Durante il processo di gametogenesi maschile si generano gli spermatozoi. C’è una mirabile diversità di forme

(guarda immagine). Forse le forme più banali sono quelle dei vertebrati. In questa diversità di forme possiamo

però distinguere tre elementi principali:

-la presenza di un nucleo piccolissimo(in tutte le specie

è la cellula più piccola);

-una struttura deputata alla motilità;

-la totale assenza di citoplasma.

Questa cellula è piccolissima, sia perché il nucleo viene

impacchettato in volume piccolissimo, ma anche

perché durante il processo differenziativo, in

moltissime specie ed in particolare nei mammiferi, il

citoplasma viene espulso. Ciò è finalizzato a rendere

più efficiente il trasporto e renderla una cellula

leggera.

Invece l’oocita si può distinguere per la dimensione,

non certo per la forma (anche se c’è quella un po’ più

tonda e quella un po’ più allungata). La differenza più eclatante dunque negli esempi sotto raffigurati, è la

dimensione legata sostanzialmente alla quantità di tuorlo. Laddove l’embrione si sviluppa all’interno del corpo

materno ed è dunque il corpo materno a fornire tutto il nutrimento all’embrione, la cellula è piccolissima e il

tuorlo sarà assente. Sarà invece presente in modo consistente in quelle specie in cui l’embrione si sviluppa

esternamente al corpo materno e il tuorlo serve proprio a dare nutrimento. Proprio sulla base delle dimensioni

delle uova possiamo distinguere (guarda tabella sottostante):

Nota che un’altra differenza fra queste, non è solo la quantità ma anche la localizzazione del tuorlo. La differente

localizzazione del tuorlo definisce già una polarità delle uova che può essere: polo animale-polo vegetativo o

come nel caso degli insetti: polo anteriore-polo posteriore. Si vedrà come questo sia molto importante nel

definire la modalità di segmentazione. 7

Allo stadio di 64 cellule, parlando di uomo e topo,

avviene la schiusa: l’embrioncino sguscia dalla zona pellucida e può impiantarsi nell’utero materno perché una

serie di molecole presenti sulla superficie dell’embrione, riconoscono altre molecole presenti sulla superficie

dell’utero.

La segmentazione può avvenire in diverse modalità che riguardano soprattutto l’orientamento del piano di

segmentazione. Così possiamo avere la

segmentazione che porta alla formazione di 4

blastomeri tutti uguali (noi in dettaglio

studieremo quella dei mammiferi). Il piano di

segmentazione è talmente importante che ad

esempio, la spirale destrorsa o sinistrorsa,

determinerà alla fine dello sviluppo, la

direzione destrorsa o sinistrorsa della

chiocciola, influirà su ciò che sarà il morfotipo

finale.

La Gastrulazione attraverso una serie di

movimenti cellulari, darà origine al

blastoporo (e ci saranno i deuterostomi ed i

protostomi). La formazione dei tre foglietti embrionali avviene attraverso l’espressione e l’organizzazione di una

serie di eventi che sono: espressione di geni specifici, risposta a segnali cellulari. Questo determina un

cambiamento nella forma, nei movimenti cellulari, la proliferazione o l’apoptosi e sarà proprio la serie di questi

eventi coordinati, che governerà tutto lo sviluppo del nuovo individuo. Per esempio durante la gastrulazione c’è

l’invaginazione delle cellule della regione più esterna dell’embrioncino, e le cellule intermedie fra due strati

determineranno il terzo foglietto embrionale. Quindi avremo endoderma, ectoderma, mesoderma e saranno i

segnali che derivano sia dalle cellule del foglietto superiore che quelli dal foglietto inferiore, che specifecheranno

il destino organizzativo di questo terzo foglietto.

Lo zigote al termine della segmentazione, darà origine alla blastocisti; all’interno della massa cellulare interna ci

sarà evento differenziativo a dare origine sostanzialmente a due tipi cellulari che saranno rispettivamente:

l’ipoblasto e l’epiblasto. L’embrione deriverà solo da uno di questi due, ovvero dall’epiblasto.

Gli studi iniziati negli anni ’70, hanno messo in evidenza che solo tre cellule che compongono l’embrione daranno

origine al nuovo individuo e tutte le altre concorreranno a dare origine a tutti i tessuti extraembrionali.

Nonostante ci siano oggi laboratori straordinari che studiano solo la segmentazione, non si sa ancora quali siano

quelle cellule, non sono ancora state individuate, né dal punto di vista morfologico, né dal punto di vista

molecolare.

L’embrione si annida nello spessore della mucosa uterina e andrà incontro ala suo destino. Da un gruppo di cellule

derivano i tre foglietti embrionali e da ognuno dei tre foglietti embrionali dei tipi cellulari differenziati e distinti. Le

cellule germinali non derivano dai tre foglietti embrionali, ma da un gruppo di cellule che sta all’infuori

dell’embrione. Oggi in vitro è possibile coltivare l’embrioncino fino ad un certo punto, dopo non è possibile far

proseguire lo sviluppo in provetta. Però grazie agli studi che hanno portato i padri della biologia dello sviluppo a

8

costruire una mole di conoscenze, oggi siamo in grado da quel gruppetto di cellule di derivare in vitro delle cellule

che chiamiamo Cellule Embrionali Staminali. Non sappiamo quali di queste cellule siano, ma attraverso una

procedura specifica di coltura, tre cellule si selezionano rispetto a tutte le altre e quelle tre, quattro, cinque cellule

daranno vita a milioni e milioni di cellule, ad una linea stabile di cellule embrionali staminali. In vitro si riesce a

coltivare quelle cellule in modo tale da ottenere qualcosa che è analogo funzionalmente ai tre foglietti embrionali.

Otteniamo gruppetti di cellule che chiamiamo Corpi Embrioidi. Dai corpi embrioidi, se si è bravi, si riesce ad

ottenere tutte quelle cellule comprese le cellule germinali, anche se le cellule germinali sono un po’ imperfette.

L’imperfezione sta nel punto critico della ricombinazione, cosa che ancora non si riesce a fare. La ricerca in questo

settore avanza rapidamente.

<<Pensiamo a che rivoluzione sarà quando dalle cellule staminali si riuscirà ad ottenere le cellule germinali. Ne deriveranno

tante conoscenze dal punto di vista biologico. L’ Ottocento è stato dominato dalla chimica, il Novecento dalla fisica, ma

questo millennio.. è della biologia! Ovviamente serve un’accettazione sociale per ottenere dalle cellule somatiche delle

cellule germinali. Significherebbe poter dare a delle persone l’opportunità di avere figli partendo da una propria cellula

somatica per impossibilità riproduttiva. Sarebbe una rivoluzione anche dal punto di vista etico e giuridico. Sono temi di

riflessione per la società ai quali si dovrebbe pensare già da ora perché la scienza è sempre più avanti della giurisprudenza. >>

Al termine della Gastrulazione si avranno i tre foglietti embrionali. Dall’ectoderma si avrà: il tubo neurale,

epidermide. Ci sono tre tipi di mesoderma.. Guarda le immagini sopra e sotto. Si genereranno anche le creste

genitali e quindi testicolo ed ovario. (Segue lettura delle slides con le strutture che si formano per ogni foglietto). 9

Tessuti ed organi però non sono costituiti da un unico tipo cellulare, ma sono costituiti dall’insieme dei tipi

cellulari che derivano dai tre foglietti embrionali. Si pensi ad esempio alla innervazione: tutti gli organi e tutti i

tessuti sono innervati e l’innervazione è di derivazione ectodermica. Tutti gli organi e tessuti sono anche

vascolarizzati ed i vasi sono di derivazione mesodermica. Ecco da dove viene la complessità: diversi tipi cellulari

che vengono anche da diversi foglietti, si integrano morfologicamente e funzionalmente. Questa è anche la

grande complessità che stanno affrontando gli ingegneri tessutali. Fare un tessuto può essere tutto sommato

semplice, ma organizzare un organo è un’altra cosa. L’ingegneria tissutale ha fatto dei grandi passi avanti, basti

pensare agli studi che sono già applicati in clinica sugli strati di pelle per i grandi ustionati. I ricercatori sono stati

capaci di rigenerare l’epidermide ma non il derma sottostante. Un gruppo italiano è leader al mondo per esempio

per la cornea, è il gruppo di Rama ed i suoi collaboratori; riescono a fare delle cornee che sono compatibili con il

donatore e sono trapiantate senza rigetto. La medicina del futuro tende ad essere sempre meno invasiva con una

terapia cellulare: o attraverso le cellule staminali che genereranno tipi cellulari differenziati o cercando addirittura

di creare in vitro delle unità funzionali, che possono essere trapiantate nell’organo che è stato danneggiato e che

permettano la sopravvivenza a chi le riceve. Il problema della donazione degli organi è un problema grandissimo;

fortunatamente da quando anche in Italia è stato reso obbligatorio l’uso del casco e delle cinture, gli incidenti

mortali sono nettamente diminuiti e sono anche diminuiti gli organi a disposizione soprattutto dei giovani.

Organogenesi: interazione e riorganizzazione delle cellule dei tre foglietti embrionali a dare origine agli organi del

corpo.

Morte cellulare: Così come proliferazione e differenziamento cellulare sono indispensabili alla generazione del

nuovo individuo, ugualmente la morte cellulare è

indispensabile. E’ un evento che permette la formazione

definitiva della forma. L’ esempio più bello è quello della

formazione della zampa o della mano. Si parte da una

struttura indifferenziata e il differenziamento porterà

all’individuazione di quelle che saranno le dita ad esempio nel

caso della mano; queste saranno riunite ed è proprio grazie

alla morte cellulare che avviene fra una struttura ed un’altra, che permetterà l’individualizzazione di ogni singola

struttura. Una mutazione in questo porta ai palmati perché la morte cellulare non ha potuto compiere il suo

corso. Anche la morte cellulare programmata, apoptosi, interviene nei processi differenziativi e nel mantenere

l’omeostasi tissutale, cioe’ l’equilibrio dinamico tra morte e crescita cellulare. L’equilibrio dinamico garantisce la

nostra stessa esistenza proprio perché garantisce l’omeostasi tessutale. Anche se i mammiferi e l’uomo in

particolare, è la specie che ha meno capacità rigenerativa. Al contrario delle lucertola ad esempio che rigenera in

giro di pochi giorni la coda persa. In alcuni organismi, in particolare invertebrati, il livello di rigenerazione è così

elevato che addirittura diventa un sistema riproduttivo. La Planaria si scinde in due ed ogni metà genera un nuovo

individuo. Un notevole livello di

rigenerazione però esiste anche nella

nostra specie: i capelli cadono ma poi

ricrescono; la pelle si desquama ma

poi ricresce; il ricambio delle cellule

del sangue: è stato messo in

evidenza che ogni 20 anni circa nella

nostra specie, l’apparato scheletrico

si rinnova; se ci rompiamo un osso

questo si riaggiusta. Tutto ciò accade

fisiologicamente ed è omeostasi

tissutale. Quindi la morte cellulare è

un evento morfogenetico non

soltanto durante lo sviluppo

10

embrionale e fetale, ma anche nella vita adulta. Tutti noi abbiamo un accrescimento, quindi divisione cellulare e

morte cellulare. Il neonato ha un testone enorme, ma mano che si cresce c’è una riproporzione delle parti del

corpo e anche questo è oggetto di studio della biologia dello sviluppo.

Cosa importante da assimilare perché riguarda una serie di eventi fondamentali nella biologia dello sviluppo ma

anche nella biologia delle cellule staminali: Il Differenziamento è qualcosa che a livello molecolare viene

determinato attraverso una serie eventi: controllo della trascrizione dei geni, controllo post-trascrizionale,

produzione di proteine (ma le proteine possono essere modificate e dare origine a vie diverse). Questi eventi

molecolari si integrano e si evidenziano da un punto di vista cellulare nel modo seguente. Si parte da una cellula

indifferenziata che per definizione è una cellula il cui destino non è ancora stabilito e può dare origine a diversi

tipi cellulari. All’interno di queste cellule indifferenziate poi si distingueranno le cellule: totipotenti, pluripotenti,

unipotenti. Sia che studiamo il fenomeno in vitro o in vivo, la cellula indifferenziata, per un contesto che può

essere intrinseco alla cellula stessa o estrinseco, cioè derivante dall’ambiente esterno (ambiente di coltura,

segnalazione cellula-cellula o segnalazione ormonale), questa cellula in funzione di quegli eventi molecolari, passa

da un contesto di indifferenziamento ad uno di specificazione e la cellula si dice Specificata. La cellula Specificata

ha ancora caratteristiche della cellula indifferenziata, ma ha già intrapreso una via differenziativa. E’ però in uno

stato reversibile e quindi se si cambia il contesto ambientale di quella cellula, si può indirizzarla su una diversa via

differenziativa. Il passaggio successivo è detto di determinazione o committed, cioè la cellula è determinata. Qui

le caratteristiche morfologiche non sono ancora evidenti, però è in uno stato in cui la via intrapresa verso un dato

differenziamento è irreversibile e cioè questa cellula determinata può solo diventare una cellula differenziata

anche se viene cambiato l’ambiente (se si cambia tessuto o coltura). L’ultimo step del differenziamento è la

cellula differenziata. Una cellula si dice differenziata quando ha un fenotipo stabile ed è morfologicamente e

funzionalmente diversa da altre cellule. Questa è una cellula ormai a termine del suo viaggio e che esaurita la sua

funzione può solo andare incontro a morte cellulare. Oltre ad una differenza di destino cellulare e anche di

morfologia, se si hanno dei microarrays, ci si rende conto che anche l’espressione dei geni cambia moltissimo.

Mentre nel caso

della cellula

indifferenziata

molti geni vengono

espressi a vari

livelli, nel caso della

cellula

differenziata,

grossolanamente si

può dire che

vengono solo

espressi gli

Housekeeping-

genes e i geni

tessuto specifici

che vengono

chiamati “Luxury

genes” e sono

quella mangiata di

geni che caratteriz-

za quel tipo

specifico di cellule

in un tessuto (per

esempio quelle del

fegato rispetto al

rene). 11

12

METAZOI lezione del 15.10.14

I metazoi sono organismi pluricellulari che

passano attraverso stadi embrionali di

sviluppo.

Il mondo vivente si divide in:

- Deuterostomi (vertebrati-

qui prima si forma

echinodermi e ascidie),

l’orifizio anale e poi quello buccale

- Proto stomi (tutti gli altri animali),

qui il primo orifizio che si genera definisce la

bocca.

Il processo di sviluppo embrionale è

caratteristico di tutti i metazoi, sia che

facciano parte della categoria di deuterostomi

che protostomi.

Nei deuterostomi e protostomi possono

essere descritte alcune caratteristiche

interessanti come, per esempio,

l’orientamento dei piani di divisione

durante la segmentazione dando origine ad

una nel caso dei

geometria a spirale

o nel caso dei

protostomi radiale

deuterostomi.

Un altro aspetto importante è la

derivazione del celoma:

il celoma deriva per schizocele cioè

nel caso dei

scollamento del mesoderma

, mentre nel caso dei

protostomi il celoma deriva come

deuterostomi

chiusura della parte intestinale separando

la regione mesodermica. SVILUPPO A MOSAICO stadio di 8

I blastomeri allo

hanno gia’ acquisito il

cellule

loro destino

cellulare definitivo.

Ogni blastomero contribuisce

come un tassello allo

formazione dell’individuo, la

perdita di alcune cellule porta

embrioni

alla formazione di

anomali.

Nei Protostomi e deuterostomi sia le uova che si producono, che i blastomeri che si originano nelle prime

fasi della segmentazione, sono caratterizzate da una staminalità diversa: 1

nel caso dei (anellidi e molluschi bivalvi) fin dalle primissime divisioni o dal citoplasma

protostomi

dell’uovo si determinano dei gradienti molecolari tali per cui già alla prima divisione o alla seconda le

cellule che si generano sono diverse le une dalle altre al punto tale che, al fine di generare il nuovo individuo

è necessaria la cooperazione di tutte le cellule, perché se una delle cellule è separata, sia la cellula singola

che il gruppo di cellule che rimangono non sono in grado di proseguire lo sviluppo embrionale; più

precocemente la cellula singola e più tardivamente le altre cellule vanno comunque incontro a morte e

l’embrione non si sviluppa; tale modalità di sviluppo è detta a mosaico o non regolativa.

Le uova a mosaico sono state soprattutto descritte nei in tali gruppi animali si è visto che fin dai

molluschi;

primissimi momenti, dallo stadio di 4 o 8 cellule, i blastomeri hanno già acquisito il loro destino

differenziativo cellulare, sono già determinati; i blastomeri possono dare origine esclusivamente alle linee

cellulari che sono iside nel loro programma di sviluppo, ma non possono dare origine ad altre linee cellulari.

SVILUPPO REGOLATIVO

Nei invece, nelle prime fasi dello sviluppo embrionale vi è una segregazione differenziale di

deuterostomi,

determinanti tra i blastomeri, ma fino ad un certo momento dello sviluppo che dipende dalla specie i

blastomeri sono tutti equivalenti al punto tale che mantengono la loro staminalità; se si separa un blastomero

dagli altri tre blastomeri, ognuno dei due gruppi cellulari riprende lo sviluppo embrionale dando origine a

due individui diversi; questa modalità di sviluppo è detta regolativa.

Anche da un punto di vista biotecnologico sono state sfruttate le caratteristiche di sviluppo regolativo per

generare ad esempio, più individui a partire da un unico uovo fecondato: divisione embrionale che è una

modalità artificiale ma di produzione per esempio animale.

Le uova regolative danno origine ad embrioni regolativi e ciò porta ad una grande potenzialità perché se

ogni uovo e ogni spermatozoo può dare origine ad un nuovo individuo, da un uovo si generano 4 uova e

tale modalità è detta embryo splitting.

CONDITIONAL SPECIFICATION O SVILUPPO REGOLATIVO

This result

contradicts

the germ

plasm .

theory

1. Start with normal 2. Separate the four cells. 3. Each cell develops into a small but normal larva.

four-cell embryo

Il primo ricercatore che ha introdotto il concetto di sviluppo regolativo o conditional specification è stato

Driesch nel 1892.

di “sviluppo

I concetti sono stati introdotti intorno alla metà del 1800.

regolativo e sviluppo a mosaico”

Driesch lavora sul riccio di mare nei primi stadi di sviluppo; rifacendo l’ esperimento di altri ricercatori

l’embrione del

riesce a dimostrare che sia riccio di mare a 4 cellule sia che esso sia separato dalle 4 cellule

possono originare delle larve dando poi origine a degli individui adulti.

L’informazione contenuta in ogni singolo blastomero nel caso del riccio di mare è sufficiente a dare origine

ad una nuova generazione di individui, ma i suoi risultati contraddicono la teoria del plasma germinale di

Weismann. 2

Weismann nel 1880 lavorando su altri gruppi

1. Single-celled embryo contains animali osserva che partendo da un embrione

all nuclear determinants (the

“germ

complete plasm), some ad una cellula, poi da due cellule e 4 cellule

of which are shown here. separa i blastomeri notando che ognuno dei

blastomeri non è in grado di dare origine al

nuovo individuo, formulando così la teoria del

plasma germinale.

In tale teoria sostiene che ad ogni divisione

2. germ plasm divides during first

cell division nelle prime fasi dello sviluppo si separano dei

determinanti dove non si sa se sono nucleari o

citoplasmatici, generando una situazione tale

per cui in 4 cellule, le cellule sono diverse le

une dalle altre.

3. germ plasm divides during Quindi ad ogni generazione cellulare si

second and subsequent divisions originano cellule diverse geneticamente perché

ricevono diversi componenti del plasma

germinale ma Driesch contraddice tale teoria.

In realtà avevano entrambi ragione, ma Weismann lavorava con i

e Driesch con i

protostomi deuterostomi.

Distribuzione asimmetrica

Oggi la rivisitazione molecolare ci permette di dire che, già nelle primissime fasi

dello sviluppo embrionale indipendentemente dal modello animale che si prende

in considerazione, quelli che sono ad esempio dei determinanti citoplasmatici

all’interno del

che hanno una localizzazione, perché esistono dei gradienti,

citoplasma dell’oocita, se il primo solco di divisione separa ed isola i

determinanti molecolari in solo una delle due cellule figlie è evidente che le

cellule figlie sono diverse anche se morfologicamente sono uguali e ognuna di

esse prenderà un destino differenziativo diverso.

BIOLOGIA EVOLUZIONISTICA DELLO SVILUPPO

La biologia dello sviluppo studia tutti gli eventi in cui a partire da una cellula

fecondata, portano attraverso una generazione a generare un nuovo individuo e

attraverso le cellule germinali a riprendere il ciclo.

Gli eventuali cambiamenti che avvengono durante lo sviluppo possono

creare delle nuove forme?

Le nuove forme create, laddove siano il risultato di cambiamenti ereditari, nel tempo possono portare

all’insorgenza di nuove specie.

La biologia dello sviluppo studia quindi non solo l’ontogenesi

ma anche la filogenesi e questo nuovo ambito di studio è detto

“biologia (EVO-DEVO).

evoluzionistica dello sviluppo”

Generiamo da un ceppo ancestrale che condividiamo.

L’ECO-DEVO si interessa anche dello studio di geni che

vengono espressi durante lo sviluppo e sono responsabili

dell’organizzazione del nuovo individuo generando la forma

finale.

I geni che segmentano l’embrione nelle prime fasi dello

sviluppo sono i nei

geni omeotici in drosophila ed i geni hox

e tali geni sono evolutivamente conservati;

mammiferi 3

Tali geni determinano la formazione della regione

centrale del torace e dell’addome e della

anteriore, di

regione posteriore in drosophila e nell’embrione

mammifero. l’uomo

La differenza tra e la drosophila è legata al

fatto che mentre possiede una sola copia

drosophila

nell’uomo,

dei geni omeotici, invece, per ogni singolo

gene esistono più copie. La ridondanza genomica

presenta un grande vantaggio ed è legata al fatto che

se avviene una mutazione in uno dei geni di

drosophila, essendo presente una sola copia la

mutazio

ne

potrà

portare

a

mortalit

à o malformazione; per esempio mutazioni in uno dei geni nel

complesso che determina lo sviluppo dell’addome può portare

a modificazione delle ali; oppure può avvenire la cosidetta

mutazione antennapedia dove al posto delle antenne si

sviluppano le zampette; mentre nel caso del genoma

ridondante come quello dei mammiferi la mutazione di un

gene può essere tamponata dall’ attività di geni che nel

genoma sono in abbondanza.

Sono dei geni evolutivamente conservati. Confronto fra i

pollo e topo:

geni genralmente sono

identificati ed espressi a partire

dalla regione anteriore verso la

regione posteriore. Si nota per

esempio che il gene Hox 5

un’estensione, nelle

presenta

prime fasi di sviluppo in

termine di luogo dove viene

espresso, maggiore nel pollo

rispetto al topo; il risultato

porta ad avere una maggiore

del pollo rispetto al topo, il pollo presenta il collo lungo, ma ciò porta

estensione delle vertebre cervicali

però ad una e

riduzione delle vertebre toraciche una riduzione delle vertebre sacrali e coccigee. 4

Analizzando le vertebre cervicali e toraciche del topo, pollo, oca e pitone possiamo affermare la stessa cosa;

nell’oca: si ha un’ulteriore espansione dell’espressione dei geni che definiscono le vertebre cervicali ed

infatti presentano un collo più lungo;

l’espressione dei geni che

al contrario,

nei serpenti:

determinano le vertebre cervicali sono ridottissimi,

è avuto un’anteriorizzazione dell’espressione

mentre si

del gene per esempio, nella regione anteriore

Hoxc6,

delle vertebre toraciche infatti il pitone presenta un

collo molto ristretto mentre per il resto è costituito dalle

vertebre toraciche; quindi si ha anche un altro

cambiamento morfologico (oltre al collo lungo o corto)

l’anteriorizzazione dell’espressione del gene

cioè che ha portato come conseguenza dal punto di

Hoxc6

vista evolutivo alla perdita dell’arto anteriore.

FRINGUELLI DI DARWIN

I clusters di geni omeotici (Hox sono invariati tra le specie;

differiscono nella regolazione di questi geni nel tempo e nello

spazio i fringuelli osservati da Darwin.

I fringuelli di Darwin derivano tutti da un unico antenato,

trovavano nell’antenato, poi

probabilmente tutti questi fenotipi si

la selezione naturale ne ha selezionate alcune varianti

Tali fringuelli si trovano nelle Galapagos e differiscono per

diverse caratteristiche, ad esempio il becco differisce tra una

specie e l’altra.

Sinervo in un lavoro pubblicato nel 2005 sostiene che la diversità

del becco dei fringuelli di Darwin è dovuta alla diversa

espressione del gene DMT-4; tale gene durante lo sviluppo

embrionale è espresso nelle diverse specie in tempi e luoghi diversi che dipendono dal grado di sviluppo

dell’embrione.

Lo stesso gene codifica per lo stesso carattere, ma la variazione nel tempo e nello spazio della sua

espressione è alla base della diversità dei becchi dei fringuelli di Darwin.

Questi risultati definiscono qual è la base molecolare della

diversità.

(Ci sono stati dei signori che hanno stimato quando specie esistono

sulla terra; sulla terra sono presenti 2 milioni di specie, tra queste

2,2 milioni sono specie marine; nel momento sono stati classificati

1,2 milioni cioè l’86% di specie esistenti sulla terra ed il 91% delle

specie che si trovano in oceano è ancora da scoprire, classificare e

studiare.) 5

La regolazione dello sviluppo avviene attraverso dei segnali:

- legati al programma genetico): modificazioni dei segnali intrinseci possono portare a

Intrinseci (

modificazioni ereditarie dello sviluppo e quindi ad evoluzione.

derivanti dall’ambiente;

- segnali importanti per definire il fenotipo finale di un certo

Ambientali:

organismo, per esempio è stato messo in evidenza che diversi colori delle ali delle farfalle cambiano

in base alla temperatura e alla luce alla quale sono esposti.

la speciazione cioè la generazione di nuove entità biologiche le quali

I grandi enigmi della vita sono:

differiscono dalle generazioni precedenti per una serie di caratteri fenotipici, comportamentali, ma hanno

come risultato finale quello di non permettere più l’accoppiamento fra individui.

La base scatenante dei fenomeni speciativi è che le popolazioni di partenza non sono più interfeconde e tale

impossibilità porta nel tempo alla popolazione originaria a divergere per molti caratteri morfologici sia

perché può essere avvenuta una mutazione in un gene che non .

È possibile che ci sia un cambiamento nel numero delle vertebre?

del collo della giraffa e dell’oca il numero

Contando le vertebre non cambia , ma ciò che cambia è la loro

dimensione. ECO-DEVO

Ecological developmental biology

delle interazioni tra lo sviluppo di un organismo e l’ambiente.

Si occupa dello studio

I cambiamenti ereditari che modificano lo sviluppo possono contribuire all’evoluzione in quanto generano

diversità evolutiva fenotipica su cui l’evoluzione agisce.

quali determinano l’acquisizione

Il genoma risponde alle sollecitazioni ambientali le di fenotipi specifici che

migliorano la fitness all’ambiente; quindi si ha l’ambiente come sorgente di variazione fenotipica ed il nuovo

fenotipo potrebbe anche permettere una maggiore fitness all’individuo.

l’ambiente esercita delle

È vero che ad oggi variazioni ereditabili, ma tali variazioni, per quel che è noto,

in un’alterazione l’induzione di malattie.

sfociano negativa del fenotipo o

PLASTICITA’ FENOTIPICA

di reagire a stimoli dell’ambiente con

(Capacita’ cambiamenti di forma, di movimento o di grado di

attivita’) Per dare l’idea di come l’ambiente determina

delle variazioni di risposta in organismi

diversi possiamo prendere in considerazione

l’organismo unicellulare Dyctiostelium

è un organismo unicellulare che

discoideum:

si trova negli ambienti umidi, ad esempio

sotto le cortecce degli alberi; tale organismo

vive a vita libera, però le modificazioni

dell’ambiente determinate da una riduzione

delle sostanze nutritive determinano una

risposta cellulare che fa sì che le cellule

singole comincino ad aggregarsi fra loro;

quindi i dyctostelyum si trovano fra le

cortecce degli alberi, ma quando manca il

nutrimento, le singole cellule mandano

segnali di aggregazione.

Il ciclo avviene in 24 ore. 6

Si ha:

1) fra le cellule (in 4-6 ore) le quali iniziano a formare una che cambia forma

aggregazione colonia

man mano che si sposta per cercare ambienti ricchi di cibo.

Inizialmente si forma un

2) poi

aggregato compatto (10h),

l’aggregato

3) diventa appuntito (12h),

verso l’alto

4) (13h),

la colonia inizia ad allungarsi

“slug migrante”

5) dopodiché inizia a muoversi sotto forma di lumaca la quale continua a

(14h)

l’ambiente

cercare e una volta trovato si ferma e comincia nuovamente a cambiare forma;

adatto

“sombrero”

6) (18h): le cellule da una forma affusolata ricominciano ad avere una forma

della quale si forma la struttura a “sombrero”,

sulla sommità

tondeggiante,

tale struttura continua a crescere in altezza mediante l’evento di

7) (20h) e termina dopo

culminazione

24 ore dell’iniziale migrazione generando il che è possibile suddividere in

corpo fruttifero (24h)

tre parti:

una regione basale 2) uno stelo 3) una regione apicale.

1)

Tale struttura aggregandosi e divenendo un organismo pluricellulare è andata incontro ad un cambiamento

conformazionale determinando delle funzioni diverse, e nella sua forma finale tale struttura si può ripartire

in una zona equivalente ad una ed una zona equivalente ad una

regione somatica regione germinale.

8) la regione germinale si e darà nuovamente origine a singole cellule che ricolonizzeranno

disgrega

l’ambiente poiché in esso vi saranno gli elementi nutritivi; mentre la regione somatica degenera.

Quindi il ciclo vitale cambia a seconda delle cellule ambientali da cellula singola ad aggregato cellulare e

nel momento in cui diventa aggregato cellulare acquisisce delle funzioni germinative o somatiche; le cellule

germinative danno origine alla colonia mentre le cellule somatiche degenerano.

Con tale ciclo possiamo visualizzare come influisce l’ambiente su dyctostelium.

PLASTICITA’ DELLO SVILUPPO

(durante la fase embrionale o larvale)

Anche nei vertebrati l’ambiente è determinante al

punto tale da determinare il sesso: alcune specie di

e di a seconda della

tartarughe alligatori,

temperatura alla quale l’embrione viene esposto allo

sviluppo embrionale, il nuovo individuo sarà

maschio o femmina.

L’essere maschio o femmina è la risposta

all’ambiente; la temperatura induce un cambiamento

fenotipico così importante nel diventare maschio o

femmina.

Sono presenti tanti fattori ambientali che

determinano la plasticità fenotipica:

- temperatura,

- nutrizione

(esempio ape

regina): a secondo del tipo di nutrizione che le larve delle dolomiti

assumono si svilupperà una regina rispetto alle operaie;

oppure negli scarafaggi la lunghezza e la

quantità delle corna dipendono dalla

quantità di cibo assunto dallo scarafaggio

durante la vita larvale.

- (atrofia

pressione e gravità,

muscolare negli astronauti): uno dei problemi principali degli astronauti è

che in assenza di gravità tali persone vanno incontro ad atrofia muscolare e

ad una forte demineralizzazione dell’osso con lo sviluppo di osteoporosi.

- luce, 7

- densità di popolazione,

- Stress,

- si è in un ambiente acquatico; in

Presenza di predatori:

figura è possibile osservare gli embrioni di rana ed un

serpente che si sta nutrendo degli embrioni di rana.

Quando il serpente si

avvicina alla pianta e

localizza la foglia o si

avvicina agli embrioni e

comincia a nutrirsi di

embrioni, imprime una

vibrazione alla foglia che è

un segnale per i girini che

un’accelerazione dello sviluppo;

determina per cui se in assenza

del predatore gli embrioni per diventare girini impiegano per

esempio 24 ore, con la presenza del predatore tale fenomeno può avvenire nel giro di pochi minuti e ciò è

dovuto ad un segnale fisico dato dalla vibrazione della foglia a causa del predatore, quindi i più fortunati che

riescono a captare tale segnale di vibrazione vanno incontro ad una precoce schiusa diventando girini e

scappano.

E’ stato determinato che grazie allo stimolo di vibrazione l’80% dei girini si salvano.

PRESENZA DI CONSPECIFICI

(Inversione sessuale)

Un altro esempio di effetto dell’ambiente sul carattere

fenotipico è possibile osservarlo nei pesci.

Situazioni ambientali variabili possono determinare

un’inversione sessuale. Una femmina per esempio può

diventare maschio se il maschio del branco muore; se un

maschio più grande entra nel branco, il maschio può tornare

femmina; questi sono tutti segnali che derivano dalla

condizione del gruppo ed il cambiamento sessuale può

avvenire in soli 4 giorni per demolire le caratteristiche

maschili (che comprendono anche il testicolo ) ed acquisire

femminili (che comprendono anche l’ovaio) e ciò avviene

quelle nel ghiozzo;

l’inversione sessuale può avvenire addirittura in un

nel thalassoma bifasciatum

giorno. FOCOMELIA DA TALIDOMIDE

specie l’ambiente ha un’influenza negativa.

Anche nella nostra

Ci sono alcune zone in cui la confluenza di nati malformati è abbastanza alta.

La talidomide è un farmaco che

negli anni 70 era somministrato

alle donne gravide come

antinausea; sono stati fatti una

serie di studi dei vari farmaci e in

2 o 3 anni, siccome sono state

vendute tante confezioni, è stato

visto che le donne che avevano

assunto la talidomide avevano

avuto una frequenza molto alta di 8

l’assenza dell’arto superiore o lo sviluppo molto

nati con malformazioni (focomelia), in particolare vi era

dell’arto superiore.

limitato

studi hanno messo in evidenza che le malformazioni in seguito all’assunzione della talidomide

Gli

dipendono moltissimo nel momento in cui la talidomide veniva assunta a partire dalla prima mestruazione,

per cui tra 34 e 30 giorni, a distanza di 4 giorni si ha:

assenza dell’orecchio,

-

- malformazioni o assenza dei pollici,

- assenza degli arti superiori,

- brevità degli arti superiori,

lussazione dell’anca,

- malformazione dell’orecchio

-

- assenza degli arti inferiori

- grave brevità degli arti inferiori

- malformazione dei pollici

È stata data una tempistica di pochi giorni tra l’assunzione del farmaco ed il tipo di malformazione del

neonato. LA RIPRODUZIONE

(Funzione essenziale degli organismi viventi per perpetuare la specie)

La riproduzione è quella condizione necessaria per assicurare la vita sul pianeta.

Si possono distinguere due modalità di riproduzione:

1) (agamica o vegetativa): i nuovi individui si originano da un unico individuo

riproduzione asessuata senza l’intervento

con varie modalità di riproduzione (gemmazione, fissione binaria, ecc) di cellule

specializzate per la riproduzione (gameti) da parte di organismi diversi o da organi diversi, quindi

avviene in assenza di gameti.

2) (gamica o anfigonica): prevede che i gameti si fondono per dare origine al

riproduzione sessuata

nuovo individuo. possono essere dei processi distinti e separati.

Riproduzione e sessualità

si intende la formazione di nuovi individui, mentre per si intende la

Per riproduzione sessualità

combinazione di geni provenienti o da due individui diversi o dallo stesso individuo, ma generati da organi

è l’evento finale in cui il genoma del nuovo individuo è

diversi (ovario e testicolo); quindi sessualità

definito dall’unione di genomi diversi, mentre la è la generazione di nuovi individui.

riproduzione

nell’ambito del mondo del vivente una serie di eventi che mettono

Esistono in evidenza come sia stata la

storia evolutiva dell’acquisizione della riproduzione sessuata. produce individui che

La riproduzione asessuata

hanno lo stesso patrimonio genetico del genitore e

può avvenire per fissione binaria, gemmazione,

divisione multipla, frammentazione, rigenerazione

VANTAGGI E SVANTAGGI

Sul pianeta si possono distinguere le due modalità

di riproduzione, sia la riproduzione sessuata che la

riproduzione asessuata ed entrambe le modalità

presentano dei vantaggi e svantaggi.

Vantaggi della riproduzione asessuata:

- facilita la riproduzione in popolazioni

costituiti da individui distribuiti su ampi areali la cui densità di popolazione è bassa; quindi se due

individui si trovano a 20 km di distanza, quando essi si riproducono asessualmente possono

nell’ambiente, non c’è nessuna

continuare ad esistere difficoltà della ricerca del partner. 9

- organismi che si generano da organismi parentali, quindi per riproduzione asessuata, hanno il

vantaggio di sopravvivere meglio se le condizioni ambientali si mantengono costanti in quanto in

ambienti costanti è più facile trovare delle situazioni in cui gli organismi si riproducono per

all’interno

riproduzione asessuata ed essi non hanno la necessità di mantenere la variabilità genetica

della popolazione

- produzione di molti individui in tempi brevi in ambienti favorevoli.

Svantaggi della riproduzione asessuata:

l’ambiente va

- Quando incontro a delle modificazioni, gli organismi identici sono sfavoriti,

- le caratteristiche di questi organismi cambiano lentamente,

c’è una bassa variazione nella

- strategia di sopravvivenza ,

quindi organismi che variano poco possono essere molto lenti nell’acquisire dei vantaggi da parte di

- nuove risorse energetiche.

La riproduzione asessuata è la modalità riproduttiva che risulta vantaggiosa in ambienti stabili.

La riproduzione asessuata e’ tipica degli organismi che si dividono per scissione.

La trasmissione di geni senza riproduzione e’comune tra gli organismi unicellulari.

un’organismo all’altro attraverso pili sessuali,

I batteri sono in grado di trasmettere geni da (coniugazione),

in assenza di riproduzione.

Gli individui che si riproducono asessualmente, possono in qualche modo effettuare degli atti di sessualità,

quindi sono in grado di trasmettere attraverso la coniugazione del materiale genetico da un organismo

all’altro, ma nel momento in cui trasferiscono tale materiale genetico non si riproducono.

anche i parameci che si riproducono per scissione realizzano la sessualità attraverso il

Esempio Paramecio:

processo di coniugazione.

Durante la coniugazione i parameci scambiano materiale genetico ma non si riproducono.

Quando i parameci si riconoscono e si uniscono attraverso la formazione di un ponte citoplasmatico

succede che

i mentre vanno incontro ad una serie di divisioni meiotiche

1) macronuclei degenerano, i micronuclei

portando alla formazione, inizialmente, di otto micronuclei per cellula,

Tutti i micronuclei degenerano eccetto uno

2) Il micronucleo rimasto si divide ulteriormente formando un

3) micronucleo stazionario e un

,

micronucleo migrante

i micronuclei migranti attraversano il ponte citoplasmatico e si uniscono ai micronuclei stazionari

4) dei partners,

una volta avvenuto ciò, i micronuclei si staccano e si riforma un nucleo diploide;

5) quando i parameci si separano, questo nucleo si divide mitoticamente

6) generando un nuovo

macronucleo e due micronuclei.

La riproduzione è asessuata (si riproducono per divisione binaria) ma in questo modo si ha uno scambio del

materiale genetico e ciò è uno dei primi esempi di sessualità.

In un lavoro è stata studiata la storia del micronucleo e del macronucleo.

Fin adesso sono stati fatti degli esempi in cui le cellule degli organismi unicellulari si aggregavano dando

delle strutture all’interno delle quali alcune cellule assumevano la funzione di cellula germinale e

origine a

altre assumevano la funzione di cellula somatica. 10

Negli organismi che sono stati descritti, a svolgere la funzione germinale e somatica non è la cellula, ma il

dell’Oxitrycha o del paramecio è silente dal punto

nucleo, infatti il in tutta la vita per esempio

micronucleo

di vista trasduzionale e si attiva esclusivamente quando avviene il processo appena descritto.

al contrario , durante la sessualità degenera, ma è l’unica struttura che viene trascritta

Il macronucleo,

durante tutta la vita dell’animale, compresa la duplicazione, quindi svolge le funzioni essenziali per la vita

del soggetto. Il macronucleo si forma dal micronucleo attraverso una serie di amplificazioni e di

frammentazione generando una situazione in cui quasi ogni singolo gene costituisce un cromosoma, sia in

condizione singola che in più copie, addirittura i geni in alcuni cromosomi possono essere associati

diversamente dando quindi origine ad una variabilità elevata.

Il risultato di tutto questo è che nel macronucleo di Oxitricha sono presenti 15.600 cromosomi ed in tutto

sono stati descritti 18.400 geni; ognuno di questi frammenti è stabilizzato per evitare la perdita, da delle

telomerasi che sintetizzano i telomeri alle due estremità in modo da rendere stabili i cromosomi.

è stato un organismo modello che ha permesso di identificare i telomeri ed il meccanismo di

Tetrahymena

duplicazione dei telomeri.

L’uomo in termine di numero genetico possiede 20.000 geni.

L’EVOLUZIONE DEI SESSI

Ciclo vitale in Chlamydomonas Chlamydomonas:

- è un organismo unicellulare biflagellato,

- si riproduce per divisione binaria (asessualmente).

Quando nella popolazione due individui definiti mating

type (plus e minus) si incontrano si ha:

- delle membrane dei flagelli,

riconoscimento

contatto delle membrane citoplasmatiche

- estensione di un cono di fecondazione da parte

degli individui PLUS (polimerizzazione di actina)

- fusione dei citoplasmi

- fusione dei nuclei con formazione di uno zigote

diploide (unica cellula diploide nel ciclo vitale)

- lo zigote va incontro a meiosi dando origine a 4

individui

Mentre prima il plasmodio si fondeva, ma rimaneva

separato, cioè non si assisteva alla fusione delle cellule;

adesso invece le due cellule diventano germinali.

Tali cellule trascorrono la vita riproduttiva come cellule

somatiche dando origine a nuovi individui, ma nel

momento in cui il mating type plus trova il minus le due

cellule si fondono, si comportano come due cellule

germinali dando origine ad un nuovo individuo che

diventa diploide; tale individuo a questo punto va incontro

ad una vera e propria embriogenesi e da un unico zigote si

generano 4 cellule (come se fosse una segmentazione). Le

4 cellule sono aploidi, vanno incontro a maturazione, sono

liberate dall’involucro dando origine a 4 individui diversi.

In questo caso si ha riproduzione le due cellule si comportano come i gameti.

asessuata,

c’è fusione dei genomi, ma anche

Si ha - perché - perché da due cellule diploidi si

sessualità riproduzione

originano 4 cellule finali. Quindi si fa un passo verso la riproduzione sessuata. 11

E’ stato pubblicato un lavoro che mette in evidenza che il ceppo è determinato dalla presenza

plus o minus

del genoma del mating locus (MT) dove vi è una regione

all’interno della quale vi è un gene detto MID.

Il gene MID:

- appartiene ad una famiglia di fattori di trascrizione la

dall’assenza di azoto;

cui espressione è innescata

- determina la trasformazione della cellula nel sesso

gametico,

- è responsabile del differenziamento verso il fenotipo

minus ed

- è in grado di reprimere il differenziamento verso il

programma plus.

Quindi lo stimolo ambientale determina la risposta genica,

generando un cambiamento all’interno della cellula tale per

cui le cellule da un comportamento somatico diventano cellule

germinali, vanno incontro a fusione e originano un nuovo

individuo. EVOLUZIONE DEI SESSI

Acquisizione di importanti

principi dello sviluppo:

• differenziazione di tipi

cellulari in uno stesso

individuo.

• precoce separazione delle cellule somatiche dalle

germinali

• la divisione ordinata di una cellula genera un numero

definito di cellule che si organizzano in modo prevedibile

Se ci si sposta verso organismo unicellulare, ma che vive a colonie, si può

descrivere un altro caso verso l’evoluzione del sesso come Volvox.

Esistono varie specie di Volvox ed ogni specie è costituita da un numero fisso di cellule.

Alga verde. Organismo pluricellulare, costituito da una colonia cellulare formata da solo

Volvox Carteri:

due tipi di cellule, disposti secondo uno schema ordinato.

In questo organismo si può fare per la prima volta una istinzione tra cellule somatiche e cellule germinali;

le cellule somatiche sono quelle disposte sulla superficie della sfera (circa 2000 cellule flagellate) mentre le

all’interno e sono dette

cellule germinali (16 grandi cellule) sono quelle che si trovano sono le

gonidi,

cellule responsabili della generazione delle colonie. In questo caso la

determinazione del sesso è

geneticamente determinata ed è

innescata da uno stimolo

ambientale. si riproduce con

Riproduzione:

due modalità asessuata e

sessuata.

La modalità asessuata:

prevede che

- le cellule che si trovano

all’interno dette gonidi,

presenti in numero fisso, 16

gonidi, vanno incontro a 11-12

ripetute divisioni cellulari,

alcune sono asimmetriche e

12

daranno origine a 16 grandi cellule (nuovo gruppo di gonidi) formando una nuova colonia formata

dalle cellule dell’involucro e dai gonidi

- al termine delle divisioni tutte le cellule sono state prodotte da un gonidio

- inizialmente i gonidi si trovano

all’esterno, e solo quando la colonia

matura, attraverso una serie di movimenti

cellulari che ricordano la gastrulazione

(inversione) il volvox embrionale si

cosicche’ i gonidi si ritrovano

rovescia

all’interno della colonia e le cellule

somatiche si troveranno all’esterno.

- Quando le nuove colonie sono mature vengono liberate dalla colonia madre (componente somatica)

sostanze nutritive.

che rilasciando nell’ambiente

muore,

- le nuove colonie rientrano nel ciclo riproduttivo sessuale.

la morte e’ parte normale e geneticamente programmata

È tra i piu’ semplici organismi in cui

- del ciclo vitale. Riproduzione sessuata

In presenza dello stimolo ambientale dovuto al

cambiamento della temperatura, le colonie si

riproducono sessualmente; esse sono identiche alle

colonie che si riproducono asessualmente.

Con il cambiamento della temperatura la colonia

produce un ormone diffusibile in grado di determinare

un cambiamento sessuale della colonia per formare i

gonidi che stanno all’interno e daranno origine a dei

gruppi di cellule che sono gli spermatozoi;

le colonie femmine che si riproducono sessualemte:

- rispondono allo stimolo ambientale

producendo da ogni gonidio un uovo,

- le uova sono fecondate dagli spermatozoi,

raggiungono l’oocita

- gli spermatozoi

- ed uno spermatozoo feconderà un uovo dando

origine ad uno zigote,

- lo zigote (condizione diploide) costituisce la

forma di resistenza dell’individuo e riesce a superare

l’inverno. In inverno le temperature si abbassano ed è

l’unica forma di sopravvivenza del volvox per

ricominciare poi la primavera dove la temperatura si rialza con il ciclo di riproduzione asessuata.

La moltiplicazione cellulare dei gonidi porta alla formazione di 128 strutture nella colonia maschile che

daranno origine a spermatozoi ed un numero più basso di gonidi che daranno origine ad oociti.

in evidenza l’evoluzione

Alcuni ricercatori hanno messo che avviene verso la riproduzione sessuata

attraverso l’acquisizione di funzioni da parte del gene di Chlamydomonas che definiva il carattere

MID

plus o minus, i ricercatori hanno messo in evidenza che esiste un omologo del gene MID di

l’attività di questo

Chlamydomonas e tale gene è determinante per la specificazione sessuale ed è proprio

gene che permette il differenziamento del sesso maschile o del sesso femminile. 13

Normal sperm (1 eyespot) aberrant sperm (2 eyespots)

In questo lavoro hanno generato delle colonie femminili transgeniche.

(fig a sinistra): lo spermatozoo del maschio è a forma di falce, in

Osservando la colonia maschile

questa struttura vi è un addensamento nella regione cefalica detto eyespot. Se le femmine sono

transfettate ( figura a destra) con il gene MID si generano dei maschi che producono dei gruppi di

spermatozoi, ma il numero dei gruppi è molto più basso (32 uova prodotte), quindi ci sono meno gruppi

di spermatozoi e morfologicamente sono aberranti ed invece di avere uno spot ne ha due.

Questo esperimento, però, ha messo bene in evidenza il fatto che se si originano degli organismi

transgenici con il gene MID, le colonie che erano femmine daranno origine a spermatozoi; se invece

nella colonia maschile si fa un Knock- down del gene MID, le 128 gonidi daranno origine a 128 uova,

perché si deduce che il gene MID è fondamentale per il differenziamento sessuale della colonia in

termini della produzione di gameti. .

pseudo-female pseudo-female fertilized by wild-type male sperm

with 128 eggs sperm packets

Hermaphrodite

with eggs and sperm packets

Zygote produced by selffertilization 14

È stato pure messo in evidenza che se si modula quantitativamente il knockdown , cioè invece far

scomparire completamente il prodotto del gene si modula quantitativamente, si ottengono delle colonie

ermafrodite. Quindi il differenziamento sessuale determinato del gene MID è responsabile del

differenziamento dei gonidi a produrre o spermatozoi o oociti, la produzione degli uni o degli altri è

determinata dai livelli quantitativi dell’espressione del gene MID, infatti:

se c’è una maggior quantità di gene MID si ottengono

- gli spermatozoi,

mentre se c’è una minor quantità di gene MID si ottengono oociti,

- - se è presente una quantità intermedia di gene

MID si ottengono colonie ermafrodite.

Conclusione:

- un singolo gene conservato, MID, si è

evoluto dal suo ruolo iniziale in

Clamydomonas per diventare un gene che è

importante nella formazione dello

dell’oocita.

spermatozoo o

una continuità genetica ed

- C’è

evolutiva tra il modello riproduttivo dato dal

mating type, alla specificazione ed alla

determinazione del sesso verso la produzione

di gameti maschili o femminili.

Quindi ci sono delle cellule che funzionano

come gameti come in Chlamydomonas;

probabilmente la modalità riproduttiva

presente nel mating type è più antica rispetto

alla formazione dei gameti.

Quali sono state le forze evolutive che hanno portato ad

evolvere gameti di forme differenti e ad ottenere uova e

spermatozoi con una anisogamia così importante?

della

Nell’evoluzione riproduzione sessuata si sono

affermati due importanti meccanismi :

- MEIOSI : riduzione del numero cromosomico ad

aploide

- RICONOSCIMENTO tra differenti gruppi di

accoppiamento (matyng types).

Con conseguente evoluzione di :

- ANISOGAMIA : (dalla meiosi) cioè si ha una

diversa dimensione tra i gameti

- OOGAMIA: in particolare oggi in molte specie si

osserva la differente morfologia tra uova e

spermatozoi. 15

RIPRODUZIONE SESSUATA

Svantaggi:

in tutte le popolazioni che si riproducono sessualmente c’è un costo energetico nella produzione dei

- gameti. è dato dall’incontro fra individui, nella riproduzione sessuata individui

- Un costo energetico elevato

diversi si devono incontrare (almeno che il soggetto non sia un ermafrodita sufficiente).

In tutte le popolazioni che si riproducono sessualmente c’è la cosidetta (esempio maschio

lotta dei sessi

che rincorre la femmina).

Vantaggi :

- La variabilità genetica che è garantita nella discendenza (crossing-over, unione nei gameti) assicura

la sopravvivenza in ambienti diversi.

Favorisce l’adattamento

- e la sopravvivenza in condizioni ambientali variabili. 16

DETERMINAZIONE DEL SESSO 17 ottobre 2014

L uo o, da sempre, si è interessato alla differenza che contraddistingue il maschio dalla femmina di

organismi della stessa specie, per capire che cosa determinasse il sesso.

Aristotele, nel 335 a.C., affermava che la femmina era un maschio mutilato, il cui sviluppo si è fermato

poiché il freddo ventre materno ha prevalso sul calore del seme del maschio. Passano 2000 anni e la storia

non cambia, bisogna arrivare alla fine del 1800 affinché Geddes e Thompson, affermano che la

dipe de e dal se e ate o a a he dall a ie te.

determinazione può In effetti, è ancora vera la causa

ambientale, in quanto le tartarughe e i coccodrilli hanno questo tipo di determinazione del sesso. Dodici

M Glu ha o fe ato l i po ta za dei fatto i a ie tali.

anni dopo, Stevens e Wilson, osservando il

modello animale, ovvero le cellule di una Drosophila maschio e di una femmina, hanno notato delle

differenze nelle strutture cromosomiche. Infatti la femmina aveva due cromosomi XX il maschio X0 o XY.

Finalmente, Morgan riesce a prendere il premio Nobel agli inizi del 900, studiando in Drosophila il numero

dei cromosomi X, il cui rapporto tra i numeri di questo cromosoma determina il sesso.

Meccanismi di determinazione del sesso

Vi sono diversi meccanismi in diverse specie, che si classificano sostanzialmente in tre grandi categorie:

 Materno;

 Ambientale, Enviromental Sex Determination, ESD;

 Genetico, Genetic Sex Determination, GSD.

Tra quelli materni il più noto è quello delle api. Le uova fecondate si sviluppano in operaie sterile o in

regine, questo dipende dal nutrimento che viene dato alla larva. Invece le uova non fecondate che si

sviluppano partogeneticamente, svilupperano delle api di sesso maschile. Esempi di meccanismi genetici ce

ne sono tanti, ad esempio il DSD, Dosage-dependent Sex Determination (rapporto X:A) che determina il

sesso in Drosophila, in cui la presenza del cromosoma Y, nel rapporto con X, sviluppa un maschio.

L importanza del cromosoma Y è che porta dei geni che guidano il differenziamento del gamete maschile e

vengono espressi a livello del testicolo, fondamentali per organizzare lo sviluppo del gamete maschile. Sono

stati studiati degli organismi modello per quanto riguarda la determinazione del sesso di tipo ambientale

sia per gli invertebrati, come nel caso della Bonellia viridis, che per i vertebrati, come i coccodrilli e le

tartarughe. Bonellia viridis è un echiuride marino o oliva di mare. La femmina è un animale abbastanza

sifo e he si ap e all este o o

grosso, ha un una sorta di ombrello,

e questa è la regione dalla quale viene filtrata l acqua per la

nutrizione. Il maschio non è nelle proporzioni giuste, in genere la

femmina arriva anche ad essere lunga 15 cm, mentre un maschio

arriva ai 3 mm. Questo vive simbionte nel corpo della femmina, dove

feconda le uova, che si sviluppano a formare la larva, poi esce dal

Questa è una larva indifferenziata non

sifone e diventa larva natante.

è né maschio né femmina. Il fatto di diventare maschio o femmina

dipe de dall a ie te i ui vive. In particolare è stato visto che se

questa larva si trova in un ambiente in cui non vi sono altri esemplari di femmine, si sviluppa in femmina; se

fe i e, o sull

questa si deposita in prossimità di ombrello del sifone, questo si svilupperà in maschio. I

i e ato i ha o dedotto he la dete i azio e del sesso dipe de da u o sti olo i esso ell a ie te

ell

dalla femmina stessa. Per verificare sperimentalmente che questo fattore emesso ambiente derivasse

espe i e to: ha o p eso dell l ha o

dalla Bonellia femmina, hanno fatto questo acqua di mare e

suddivisa in tanti beckerini e hanno preso tante Bonellia femmine e ne hanno fatto una pappetta, hanno

diluito uesta pappetta all dell

interno dei beckerini con acqua di mare, partendo da una concentrazione

molto alta, diluendo fino ad arrivare all acqua di mare pura. Infine, hanno preso le larve indifferenziate e le

ha o esse all i te o di uesti beckerini. Così dove era presenta molto estratto di Bonellia femmina, le

ell

larve si sono sviluppate tutte in maschi dove la quantità di femmine era bassissima, acqua di mare

pura, le larve erano tutte femmine, naturalmente decrescendo la quantità di maschi e aumentando quella

di femmine a seconda della concentrazione. Così, i ricercatori hanno dimostrato che il fattore inducente il

e i esso dalla fe i a ell

sesso è dato da ciò che vie ambiente. In questo caso il meccanismo di

determinazione del sesso non è geneticamente determinato, non vi sono geni specifici ma il genoma

risponde ad uno stimolo, quello dato dalla Bonellina.

Per quanto riguarda i Rettili, vi sono varie specie sia tra le tartarughe che tra i coccodrilli che rispondono a

uale l

questo meccanismo di determinazione ambientale, che dipende dalla temperatura alla embrione si

sta sviluppa do. Questa te pe atu a espo sa ile di u attività enzimatica che determina la produzione

di ormoni. Il meccanismo importante nel determinare il sesso, è controllato dalla quantità di ormoni

l e io e

circolanti. Se questi ormoni sono maschili, testosteroni, si sviluppa in maschio, se predominano

gli o o i fe i ili, l e io e si sviluppa in femmina. A regolare i livelli di questi ormoni è un enzima che

si chiama Aromatasi, responsabile della conversione del testosterone in estradiolo. Nel caso di questi Rettili

è sensibile alla temperatura. Per cui per quanto riguarda gli studi fatti sul genere Emis, è stato descritto un

di effetto, ui di l

momento dello sviluppo embrionale in cui la temperatura non ha alcun tipo embrione è

ancora in una condizione indifferenziata in particolare ad essere indifferenziati sono le gonadi degli

embrioni, che possono diventare tanto testicoli quanto ovari. La gonade indifferenziata sia nella sua

componente germinale che nella sua componente somatica a seconda degli stimoli ambientali dati o dai

geni espressi, può seguire due vie differenziative diverse, diventare un testicolo o diventare un ovario,

o p odu e ovo iti. È l

produrre spermatozoi unica condizione cellulare che permette questa diversa

opposta possibilità di differenziamento, non esiste un altro esempio in tutti gli organismi, che abbia questa

potenzialità. Man mano che la gonade si abbozza diventa differenziata, nel caso di Emis, se la temperatura

alta, l attività aromatasica è alta e il testosterone verrà convertito in Estradiolo specifico, e tutto il

differenziamento della gonade indifferenziata prenderà la via per divenire un ovario, se la temperatura è

assa l attività a o atasica rimane bassa, i livelli di Estrogeni bassi e quelli di Testosterone alti, così la

gonade indifferenziata si differenzierà in Testicolo. A seconda delle specie, è la proteina stessa ad essere

sensibile alla temperatura o è il gene che esprime la proteina che può essere diffenziamente attivata dalle

he o solo dell attività

alte temperature. Esiste una variabilità, una differenza possibilità di controllo,

p otei a a può esse e a o te di uesta sull espressione del gene. Questo giustifica il fatto che in alcune

specie, la temperatura alta, porta allo produzione di maschi e, la temperatura alta, alla produzione di

femmine. Interessante è che il gene della Aromatasi è controllato positivamente da due geni Sox9 ed

he so o due ge i i po ta ti a he pe la dete i azio e del sesso ei a ife i, ui di u

Dmrt1

percorso in termini di geni che vengono coinvolti nella determinazione del sesso, essi sono evolutivamente

o se vati, a i e a is i he egola o l esp essio e di uei ge i o, ta t he se si esa i a il o do

vivente i meccanismi di determinazione del sesso sono incredibilmente diversi, e insorgono varie volte nella

storia evolutiva dei vertebrati. La tabella indica

questa variabilità, i più semplici sono gli uccelli e i

mammiferi, in cui la determinazione del sesso è di

tipo genetico e dipende dal corredo cromosomico,

nel caso dei mammiferi il sesso con bimorfismo

cromosomico è maschile (XY), nel caso degli uccelli

è femminile (XW). Anche gli anfibi hanno questo

tipo di determinazione del sesso, i coccodrilli hanno

una determinazione del sesso che è esclusivamente

legata alla temperatura, ma se si esaminano specie

diverse di tartarughe si trovano meccanismi diversi,

ci sono tartarughe come Emys che hanno una determinazione del sesso legata alla temperatura e altre che

hanno la determinazione del sesso maschile in cui gli eterocromosomi sono maschili, e altre in cui il sesso

eterocromosomico è femminile. I pesci, oltre ad avere una determinazione del sesso di tipo genetico e

legata alla temperatura, hanno addirittura ciò che viene definito Behavioural, cioè che dipende dal contesto

i ui l o ga is o si t ova el g uppo. Vi so o i a ila spe ie des itte di pes i, e all i te o di ueste

i ui la dete i azio e del sesso ge eti a, a all i te o di uesti i so o situazio i

si trovano dei gruppi

estremamente complesse in cui la determinazione del sesso dipende anche dal rapporto e dal numero dei

cromosomi, nel caso del maschio il rapporto fra il numero dei cromosomi tra X e Y, sistemi complessi in cui

a determinare il sesso sono dei geni presenti su dei cromosomi sessuali ma anche sugli autosomi, in alcune

situazioni sono i B-cromosomi ad essere importanti. La determinazione del sesso di tipo ambientale,

ovvero legata alla temperatura, è più semplice, ma ci sono situazioni legate al fenotipo, come il colore degli

animali, agendo su un asse di tipo endocrino, il pH, la densità della popolazione, lo stato sociale, la velocità

dell a ua, e

di crescita, il pH situazioni in cui questi due meccanismi si trovano insieme, quindi vi sono

dete i a ti ge eti i a so o i flue zati a he dall a ie te. All i te o di uelle ila spe ie, ad oggi,

si è appurato che la determinazione del sesso legata alla temperatura, riguarda solo 13 famiglie e 60 specie.

Come nel caso dei rettili, il momento critico per la determinazione del sesso è quello che riguarda lo stadio

larvale, in cui le gonadi si sono formate ma sono in uno stato indifferenziato, non è quindi precoce, non è

e io ale a già posti ipato al o e to vi i o all o ga oge esi. U aspetto he deve esse e

considerato, da un punto di vista evolutivo, è che naturalmente le variazioni di temperatura hanno una

rilevanza ecologica ed evolutiva incredibilmente importante, perché mentre nel caso della determinazione

del sesso genetica, il rapporto dei sessi alla nascita è 1:1, in questo caso il rapporto sessi può cambiare

tantissimo. Le strategie riproduttive dei pesci sono numerose, si possono trovare delle popolazioni

gonocoriche, di maschi e femmine, o anche specie in cui la riproduzione è esclusivamente legata alla

ovve o lo spe atozoo pe et a all i te o

femmina, quindi una situazione di partenogesi o gimnogenesi,

dell uovo a o o t i uis e o il proprio genoma, non si fonde con il pronucleo femminile e viene

oppu e l

eliminato, questo ha quindi una funzione di attivatore; ibridogenesi, in cui avviene la fecondazione

ma alla meiosi, il genoma paterno viene eliminato, uno straordinario esempio per gli studi epigenetici. Poi

e ui si può t ova e u po di tutto, dal tipo

esistono delle specie che sono ermafrodite seriale, in cui

l i dividuo si it ova o e fe i a, dive ta as hio e poi ito a fe i a, sotto o dizio i della

composizione del branco, oppure può essere di tipo sequenziale e qui si trova una sequenzialità

proterogina, da femmina diventa maschio, o proterandria, da maschio diventa femmina, oppure possono

all i te o dello stesso i dividuo si it ova o sia le ovaie he i testicoli,

essere simultanei o sincroni, in

questo caso la riproduzione può essere autosufficiente, o non autosufficiente, quindi deve esserci lo

L e af oditis o u a o dizio e he si it ova f e ue te e te t a gli i ve te ati, a

scambio di gameti. pes i, all este o dei pes i u a o dizio e patologi a he p ovo a

tra i vertebrati è presente solo nei

sterilità. ta t che anche negli organismi con

La determinazione del sesso non è un processo conservato,

determinazione di tipo genetico, possiamo distinguere situazioni come quelle di Drosophila rispetto al topo

o all uo o, i ui Drosophila dipende dal numero di cromosomi X ma è cell-autonomous, cioè il corredo

o oso i o di og i ellula he o po e l e io e fo da e tale a defi i e il desti o differenziativo di

quella cellula. Quindi, non vi sono ormoni circolanti che modulano o influenzano il destino differenziativo

delle cellule. Nel caso dei mammiferi, il cromosoma chiave è quello Y, ma un aspetto fondamentale è che il

fenotipo finale maschile dipende dagli ormoni circolanti, non è quindi sufficiente il corredo cromosomico,

ma è essenziale anche la quantità e la tipologia di ormoni circolanti. La determinazione del sesso è stata

studiata da va i i e ato i all i izio dell 9 , da Mo ga a B idge, il quale con la bilancia, indicava il

dosaggio tra gli autosomi e i cromosomi X. XY è maschio, X0 è maschio sterile, XX è femmina, ma anche XXY

fe i a. L Y i po ta te pe il diffe e zia e to dei ga eti as hili, o e ad ese pio i X il uale,

ste ile. Se l i dividuo o oso i a e te fe i a, ovve o XX,

non avendo cromosomi Y, è un maschio

ma se nelle primissime fasi della segmentazione per errori di segregazione un X viene perso, in quella

ellula e ei suoi de ivati l assetto o oso i o X , X si svilupperà e la cellula porterà in se un

programma di sviluppo di sesso maschile. Il

risultato sarà quindi un individuo che avrà

caratteristiche sia maschili che femminili e verrà

definito ginandromorfo. Il moscerino,

rappresentato in figura, ne è un esempio, perché

non ci sono ormoni circolanti che influenzano e

mediano lo sviluppo di quella cellula primigenia in

ui avve uto l e o e mitotico. Questo avviene

a he i alt e situazio i o e elle fa falle, he ha o l ete o o oso a fe i ile, a ha o la stessa

l a i ale se a ostituito da due disti te età, a he i uesto aso u e o e

situazione, anche qui

mitotico nelle primissime fasi della segmentazione ha portato una cellula a perdere un cromosoma, sempre

pe l ife i, i ui l a uisizio e del fe otipo

assenza degli ormoni circolanti. Diversa è la situazione dei ma

de iva dall i teg azio e di t e fatto i, l’assetto cromosomico

ovvero (XX o XY), il quale è determinante a

differenziare le gonadi, quindi, nello sviluppo fetale sono le gonadi che si formeranno a seconda del sesso;

gli ormoni prodotti da esse, determineranno il sesso fenotipico, quindi lo sviluppo in maschio o in femmina.

Quindi, il sesso genetico forma il sesso gonadico, e il sesso gonadico determina il sesso fenotipico.

La storia delle determinazioni del sesso nei mammiferi è molto recente, solo nel 1959 si è capito che nella

ost a spe ie la dete i azio e dipe de dall asse za o dalla p ese za del o oso a Y, ui di si apito

che ogni gamete avrà lo stesso tipo di corredo nella femmina, gli ovociti portano solo il cromosoma X e gli

posso o po ta e o il o oso a X o l Y. E u a sto ia he o i ia el o e to i ui stato

spermatozoi

possi ile defi i e l assetto o oso i o della ost a spe ie, o p i a pe h el aso dell uo o, a

differenza degli invertebrati, in cui le cellule venivano bloccate in mitosi con la tecnica dello squash e poi si

facevano scoppiare, era molto difficile ottenere dei buoni cromosomi. A un certo punto nel 1959 Tiseishu si

interessò di studiare la citogenetica degli umani, e dà a un tecnico il compito di preparare i cromosomi, il

quale si accorge di aver formato delle cellule con dei cromosomi meravigliosi, pur avendo seguito lo stesso

p o edi e to, allo a si e ò di ipe o e e i passaggi. I uesta i e a dell e o e, he in realtà aveva

portato a un miglioramento della ricerca, si accorge che il tecnico aveva sbagliato la pesata iniziale,

preparando una soluzione ipotonica, e non isotonica. Il primo passaggio di ipotonia, che fa entrare acqua

nelle cellule e le fa gonfiare, e a quel punto quando si prende il fissativo, che è alcolico, le cellule scoppiano,

e scoppiando si separano i cromosomi il più possibile. In questo modo si è permesso di fare dei balzi in

avanti incredibili nella citogenetica, e nel 1959 si arrivò a stabilire che il numero cromosomico della nostra

spe ie 6. Il sesso dello zigote ui di dete i ato dall assetto o oso i o sessuale dello spermatozoo

fe o da te, e il appo to sessi sa à i a : , a isog a o side a e l i po ta za della egolazio e

uo o,

ormonale. Nei mammiferi ci sono specie monoovulatorie o poliovulatorie. L come il bovino, è una

specie monoovulatoria, partoriscono quindi un cucciolo alla volta, incidentalmente possono essere ovulati

due ovociti che fecondati daranno origine a due impianti e quindi a due feti. Nei bovini, grazie alla

o fo azio e della pla e ta, t a i due feti i olazio e di sa gue e uesto po ta a u o dizio a e to

fe i a e l alt o sia as hio, la ua tità di

degli ormoni, infatti nel caso in cui un feto sia testosterone

circolante sarà molto elevata e ciò porterà a una mascolinizzazione del feto femmina, in questo caso la

l i po ta za degli o o i i ola ti el dete i a e

femmina sarà pure sterile, free martin. Questo mostra

il sesso. Nel caso della nostra specie abbiamo anche casi di alterazione cromosomica. Ad esempio, le

monosomie degli autosomi sono mortali, le uniche monosomie sono quelle legate ai cromosomi sessuali,

ed è quindi possibile avere delle situazioni di tipo X0 45, ovvero la sindrome di Turner, in cui vi è un solo

cromosoma X e sono persone fenotipicamente femmine, perché manca il cromosoma Y, ma sono sterili e

con delle patologie associate alla sindrome. Ma ci sono anche casi di trisomia, la più nota è XXY la sindrome

di Klinefelter, in cui vi è un cromosoma Y i soggetti sono effettivamente fenotipi maschi ma con dei caratteri

di femminilizzazione fenotipica, queste persone presentano, ad esempio, ginecomastia, sono glabre ed

hanno un tono di voce più alto. Esistono casi di mosaicismo come XXXY, e qui il fenotipo finale dipende

sostanzialmente dalla prevalenza degli ormoni circolanti. Quello che deriviamo da queste informazioni è

che il parametro critico è la composizione cromosomica delle gonadi. Il nostro cariotipo è formato da 22

atte zio e sui o oso i sessuali,

coppie di autosomi, più i cromosomi sessuali XX o XY. Se si pone l si nota

come sono diversi tra di loro, X è molto grande e ricco di geni, Y è più piccolo, tendenzialmente

eterocromatico e con pochi cromosomi. Ci sono molti gruppi di studio che hanno focalizzato la loro

attenzione sulla derivazione del cromosoma Y, e hanno messo in evidenza che il sistema cromosomico XY è

olto giova e i te i i evolutivi, o data, all i te o dei a ife i, di i a 6 ilio i di a i. Si ritiene

che la storia evolutiva sia la seguente, negli individui ancestrali i due cromosomi originali erano identici, e si

comportavano come tutti i cromosomi, come ad esempio con il crossing-over in meiosi, a un certo punto su

uno dei due si genera una mutazione molto importante, e si genera un gene che adesso viene chiamato

SRY, il quale, poiché è importante nella determinazione del sesso ed è selezionato positivamente,

determina delle differenze tra i due cromosomi, una differenza primigenia che ha portato nel tempo

all a u ulo all i te o di uesto o oso a di e o i he ha o eso uesto o oso a se pre più

diverso dal cromosoma X. Questo ha causato grandi differenze perché nella meiosi i due cromosomi

avevano sempre minori punti di contatto. La meiosi, oltre ad essere il meccanismo che garantisce lo

scambio di porzioni cromosomiche tra i cromosomi, è un meccanismo di riparo del DNA e utilizza tutta

uella atte ia e zi ati a he a atte isti a del ipa o del DNA, a a o he l appaia e to t a punti di

rottura del DNA e cromosomi avviene questi punti di rottura del DNA vengono chiusi e ogni chiusura è un

controllo della bontà della sequenza del DNA, quindi la meiosi è uno dei meccanismi più efficienti nel

controllo della bontà del DNA. Perciò la mancanza di appaiamento ha portato nel tempo a far divergere

sempre di più quei cromosomi tanto che si è creato un accumulo di porzioni di DNA che non è codificante, o

di geni che avevano perso funzione, e queste porzioni nel tempo sono andate perse, venendo eliminate

fisicamente, ciò giustifica le dimensioni ridotte di Y. Dal cromosoma ancestrale da cui si pensa che potesse

avere circa 1000 geni, al momento in cui è cominciata la divergenza tra X Y, mentre X fa tutto ciò che gli

altri cromosomi fanno in meiosi e quindi il numero dei cromosomi è rimasto invariato, il cromosoma Y è

andato via via perdendo geni, tanto che da circa 1000 geni oggi sono stati mappati circa solo 45 geni. Se si

ammette una perdita lineare di geni, alcuni gruppi di ricercatori hanno stimato che il cromosoma Y sparirà

di l appa izio e di uesto

in circa 4 milioni e mezzo di anni. Questa divergenza, qui sex determinal locus, ha

prodotto una serie di eventi tra i quali una riduzione o una perdita totale di ricombinazione, una perdita di

o ati a, l espa sio e dell ete o o ati a, e olt e a igua da e il o oso a Y dei a ife i, igua da

anche il cromosoma W delle specie che hanno un sistema eterocromosomico femminile, è quindi

caratteristico del cromosoma che non ha un omologo. Questo studio della progressiva degradazione cui è

caratterizzato anche il cromosoma W è stato sostenuto, nel 1914, da un zoologo di nome Muller, che definì

Muller’s ratchet.

questa progressiva degradazione Ci sono due laboratori leader, sostenuti da Jennifer

la p i a u aust alia

Marshall-Graves e Jennifer Hughes, a che pensa che il cromosoma Y sia destinato a

u a e i a a,

morire, a differenza della seconda, che pensa che non lo sia. Alle due ricercatrici è stato

chiesto di dare cinque motivazioni per sostenere la propria tesi, la prima afferma che sparisce perché è

tasso di va iazio e e ad u i effi ie te selezio e, io pe de po zio i, fa e do degli

soggetto ad un alto u evide za di uesto deg

studi comparati attraverso il regno animale, ado sia del cromosoma Y che del

so o a he ei a ife i delle evide ze he l Y o i sia più, i fatti i so o spe ie i

cromosoma W. Ci

ui o ed il sesso dete i ato da ge i SRY o o ologhi ad essi che sono presenti su degli autosomi.

Inoltre, laddove il cromosoma Y abbia avuto delle porzioni di cromosomi in aggiunta, queste sono andate

inesorabilmente in contro al degrado. Il primo motivo contro la teoria della morte del cromosoma Y è

legato al tempo in cui il cromosoma non è sparito, poiché se non è sparito in milioni di migliaia di anni

allo a o otivazio e pe ui de a spa i e, a u a otivazio e u po de ole. I olt e ve o he

non va in contro a ricombinazione ma anche il cromosoma Y ha dei sistemi di controllo, infatti se si

o uesti pu ti di ottu a di DNA all i izio della eiosi,

esamina si possono mappare anche sul cromosoma Y

i meccanismi che sono attivi nel mantenere efficiente il DNA nel cromosoma Y e tutti gli altri cromosomi

sono sufficienti anche se il cromosoma Y non va in contro a crossing-over. In 100mila anni di storia

evolutiva dell uo o il o oso a Y u a o va i o t o a u a purifying selection, ovvero i geni presenti in

questo cromosoma sono li da almeno 100mila anni, il che vuol dire che vi è un vantaggio selettivo a

a te e e uell asso iazio e di ge i. Se si gua da o a he i te pi evolutivi, 6 ilio i di a i, il o oso a

Y non ha perso geni. Quello che si sa sul cromosoma Y è che è costituito da un braccio corto e da un braccio

lungo, che ha pochi geni, ma che ha mantenuto due regioni di omologia col cromosoma X che sono

telomeriche e vengono chiamate par1 e par2, nel caso del topo si trova solo par2, e sono le regioni in cui

avviene il crossing-over. Vi sono pochi geni sul braccio corto e poi vi è una regione centrale in cui sono

presenti dei geni importanti per il controllo della spermatogenesi, chiamata AZF, Azoospermia factor, è

vero che alcune situazioni, delle delezioni di questa regione portavano a un mancato sviluppo degli

spermatozoi, il soggetto era quindi sterile per mancanza degli spermatozoi. Nel 1959 il cromosoma Y è il

pe ò sia ell uo o he el topo si vista u a situazio e di

cromosoma per la sex determination, sex

reversal, inversione sessuale, ovvero degli individui che erano cariotipicamente femmine, in realtà erano

fenotipicamente maschi. Quando si sono analizzati da un punto di vista citogenetico questi individui, si è

visto che uno dei cromosomi X portava un frammento del cromosoma Y, e questo era sufficiente a

determinare lo sviluppo delle gonadi in senso maschile. Attorno alla fine degli anni 80, Lovell-Badge e

Goodfellow hanno mappato il punto di rottura e hanno mappato questa regione che hanno chiamato TDF,

testis determining factor, si sono accorti quindi che

quegli individui, cariotipicamente femmine e

fenotipicamente maschi, avevano una traslocazione

dell i te o a io o to o di una porzione di esso nel

cromosoma X, questo era sufficiente a farli diventare

fenotipicamente maschi. La storia va dal 1959 al 1990

quando, sempre analizzando queste situazioni di sex

reversal, il punto di rottura e di traslocazione è stato

individuato con maggior dettaglio, fino ad individuare,

tramite una serie di mappature sempre più nello

specifico, che il fattore determinante è il SRY, Sex

determining Region of the Y, che si trova solo in una regione di 35 Kb, ed è solo questo a determinare un

sex reversal. Queste 35 Kb codificano per un fattore di trascrizioni formato da 223 aminoacidi ma per

essere sicuri che fosse questo un gruppo di ricercatori inglesi guidato da Koopman (che erano già in grado

di prelevare gli ovociti, prelevare gli spermatozoi, metterli in vitro, far avvenire una fecondazione in vitro, e

pe poi t asfe i li ell ute o

coltivare gli embrioni fino allo stadio giusto, di una topolina, che viene chiamata

pseudo-gravida) hanno portato avanti una fecondazione in vitro, e siccome molti ovociti vengono fecondati

da spermatozoi, ci si aspetta che gli embrioni siano maschi e femmine a seconda del corredo cromosomico,

ma in più hanno fatto un trasferimento del gene

SRY, hanno fatto un transgene su questi

embrioni e hanno quindi creato degli embrioni

che cromosomicamente erano XX, ma

L attesa

transgenici per SRY. era che una volta

transfettato questo

gene di 35 chilobasi

in un embrione XX,

se uest e io e si fosse sviluppato come maschio significava che questo

e a il ge e dete i a te il sesso, al e o ei a ife i. Ha o fatto uest espe i e to e hanno

pubblicato, il 9 maggio 1991, il loro lavoro su Nature, con la foto di due topini, uno cromosomicamente XY e

un altro col il gene SRY, e si può notare che fenotipicamente questi due topolini sono identici, per averne la

prova si può osservare lo spazio ano genitale, che nei maschi è più esteso rispetto alle femmine. Per avere

una prova più sicura si possono far arrabbiare i due topini, è risaputo infatti che i topi maschi non mostrano

i testi oli a li t atte go o ell addo e, a el o e to i ui ve go o fatti a a ia e li es o o fuo i, i

e t a i i topoli i ha o us ito i testi oli. U ulti a p ova a livello

questo caso appunto molecolare,

infatti si fa un Southern Blot, e si usa una sonda per mettere

in evidenza la presenza del gene SRY. Questa è la prova

determinante che SRY è il gene determinante nei mammiferi.

Il lavoro mandato a Nature, da Koopman, non fu inizialmente

accettato, perché gli chiesero di avere una dimostrazione del

fatto che questo topino fosse realmente maschio. Pensano

inizialmente di farlo accoppiare con le topoline, ma non

avendo avuto risultati decidono di prelevare il testicolo e

fa e u istologia, ed e e ge he el o f o to t a i due

maschi, a differenza del testicolo del maschio XY, non vi

erano spermatozoi nei tubuli seminiferi di cui è composto il

testicolo, il maschio è quindi sterile perché non vi è spermatogenesi. Si capì così che SRY è il gene della

determinazione gonadica del sesso, ovvero della trasformazione della gonade indifferenziata in testicolo,

a poi h a a l Y, la spermatogenesi non può

avvenire. La gonade indifferenziata è costituita

sostanzialmente da due tipi cellulari, le cellule

germinali e le cellule somatiche. Lo stadio di

lasto isti lo stadio el uale si a ida l e io e

sulla pa te e vi ale dell ute o, si app ofo da

ell epitelio e a a o he si approfonda la

regione della massa cellulare interna è solo quella, porta al differenziamento

dell e io e ve o e proprio, mentre le cellule del trofectoderma, ovvero

uelle he defi is o o l i volu o, o e t a o a fa pa te dell e io e a

sono degli annessi embrionali, quindi man mano che si annida questa regione

andrà in contro a quella che si definisce la trasformazione che porterà alla

formazione del nuovo individuo. Tutte le cellule somatiche deriveranno da

so o p ese ti all i izio della

uno solo di queste due strutture laminari che

e io l

gastrulazione epiblasto. Le cellule germinali non si originano

epi lasto a ve go o o igi ate

dall tramite dei segnali che derivano

dall e tode a ext ae io ale po ta o al u e ellule dell epi lasto

prossimale a seguire un destino differenziativo diverso. Questi segnali

cominciano a influenzare queste cellule, le quali migrano fuori dal corpo

dell e io e, va o a posizio a si fuo i dal o po e io ale, nel

mesoderma extraembrionale, dove cominciano a moltiplicarsi. Il segnale che

a a l espressione

diventa sempre più viola, nella figura accanto, di un gene chiamato che è uno dei

stella

geni che vengono espressi in queste quattro/

cinque cellule che vengono chiamate Primordial

Germ Cells, ovvero le cellule primordiali

segui e l e ig azio e

germinali. Si può, inoltre,

pe h si po ta o all este o del o po

dell e io e, si localizzano come a formare un

bottone vicino ad una struttura chiamata

Lantoide, di preciso vicino la gemma della

Lantoide, nella parte extra embrionale, tutto

questo avviene in 24 ore nel topo. I segnali che

ve go o dall e tode a ext ae io ali so o i po ta ti, l u i o ad oggi studiato dato da u a ole ola

Wnt4, secreto da queste cellule, che si legano a dei recettori di queste cellule portando alla formazione di

una cascata fosforilativa che porta questi due elementi SMAT1-5 e SMAT1-4, fattori di trascrizione, ad

attivare alcuni geni che determinano il destino differenziativo di queste cellule, che vengono quindi

specificate in termini di cellule germinali. Nella regione della

La toide a i fo za e il seg ale u alt a ole ole, ovve o

Wnt2. Nel momento in cui le cellule rispondono al segnale di Wnt4

il primo evento è un evento di polarizzazione, le cellule cambiano

fo a, uesta pola izzazio e l eve to o fologi o he i di a he

queste cellule sono pronte per la migrazione. Cominciano la

ig azio e, si po ta o ui di al di fuo i del o po dell e io e,

anche se ancora oggi non si sa come la polarizzazione avvenga a

livello molecolare. Il primo evento è quindi la migrazione

ell e dode a ext aembrionale, poi nei primi 7 giorni e mezzo fino a 10 giorni e mezzo dalla

fecondazione, dopo essersi moltiplicate cominciano di nuovo a migrare attraverso la struttura evidenziata

dalla uale si ge e e à l i testi o, e dopo ave att ave sato il ese te e do sale, si divido o

in arancione,

in due porzioni, una va a destra e una a sinistra, e queste regioni diverranno le future creste genitali dalle

quali si origineranno le gonadi. La regione che si affaccia al celoma viene chiamata cresta genitale, ma tutta

pe h da uesta egio e si ge e a tutto l appa ato es eto e.

la regione viene chiamata urogenitale,

Quando arrivano nelle creste genitali cominciano a proliferare e a moltiplicarsi, qui siamo a livello di una

di ellule, e a livello ge itale se e fo a o ilio i. Nell epitelio elo ati o a iva o le

decina o trentina

cellule, e anche lo stesso epitelio comincia ad inspessirsi,

sempre attraverso il fenomeno di duplicazione cellulare. Le

cellule germinali e somatiche si duplicano e vanno a costituire

mano a mano che i

la struttura del cordone sessuale primitivo,

cordoni crescono si approfondano sempre di più nella regione

mesodermica, nella quale si va organizzando il Mesonefro e

anche due strutture, evidenziata in rosso e in azzurro, che si

chiamano Dottomesonefrico o dotto di Wolff e dotto

Paramesonefrico o dotto di Muller. Questi due dotti sono

i po ta ti pe h da og u o dei due de ive à tutto l appa ato

genitale interno o maschile o femminile, da quello di Wolff

quello maschile, da quello di Muller quello femminile.

Dopodiché si formano anche i glomeruli renali. Tutta questa

serie di eventi è regolata da una serie di geni, non si conoscono però le relazioni reciproche tra geni e quali

sono i pathway genici che determinano la realizzazione di un evento differenziativo. Al momento si sono

essi i elazio e po hi ge i, u gene target SF1 regolato da GATA4 che agisce su di esso ma anche su

o o o o all attivazio e di uest ulti o a s ate a e u a as ata

MX9, e MX2 che agisce su SF1. Tutti

molecolare di eventi non nota che porta alla trasformazione di questa regione, differenziandola verso la

go ade p i itiva. L eve to diffe e ziativo po ta a fo a e uesta egio e differenziata che si chiama

gonade primitiva, nella quale sono espressi molto marcatamente due geni, Fgf9 e Wnt4 se si marca, con un

l esp essio e di uesti ge i, si può ota e o e uesta sia olto sepa ata l u a

ibridazione in situ,

dall alt a. Questo bilanciamento quantitativo di queste due regioni, mantiene la gonade indifferenziata. Se

un evento esterno, che può essere la temperatura, o qualsiasi altra cosa, o nel caso dei mammiferi SRY si

l esp essio e di

esprime, SRY ha un azione su un altro gene che può essere Sox9, il quale iperattiva FGF9,

cosicché da un punto di vista quantitativo il prodotto di Fgf9 diventa rilevante rispetto Wnt4, inoltre

quantitativamente va a bloccare Wnt4. A questo punto la bilancia si squilibra verso il differenziamento del

sesso maschile, se non vi è questo segnale, nello specifico manca SRY, non vi è un up-regolazione di Fgf9,

perché non viene attivato Sox9 e il risultato è che avrà un predominio Wnt4 e a questo punto la bilancia

pende verso il differenziamento di sesso femminile.

MECCANISMI DI DETERMINAZIONE DEL SESSO 22-10-14

Abbiamo visto come le cellule germinali primordiali migrano, arrivano a livello

in seguito si ha l’organizzazione dei cordoni

delle creste genitali, poi proliferano;

primari, secondari, e a questo punto lo sviluppo in senso maschile o femminile a

seconda della condizione cromosomica (genica). Arriviamo ad una condizione in

cui c’è l’abbozzo della gonade, sono cresciute le cellule germinali e le cellule

somatiche. Dal punto di vista molecolare, tra i tanti geni che si esprimono nella

regione, quelli che sono interessanti ai fini della determinazione del sesso, che

finchè c’è questo

sono e si trovano in un equilibrio quantitativo;

Fgf9 Wnt4,

equilibrio la gonade è indifferenziata, non è né testicolo né ovario, diventerà

rispettivamente un testicolo o un ovario a seconda dello stimolo che determinerà la

variazione quantitativa di questi due geni. Questo stimolo può essere di vario tipo,

anche ambientale (stiamo parlando di mammiferi uomo e topo), lo stimolo porta

all’espressione del gene che abbiamo visto essere indispensabile per la

determinazione del sesso maschile che è Sry si esprime, va a stimolare

Sry. l’espressione di un gene

che si chiama il

Sox9,

quale entra insieme a

in un loop regolativo positivo che porta ad aumentare

Fgf9

di molto la proteina rispetto alla proteina si

Fgf9 Wnt4,

quell’equilibrio quantitativo tra i due geni a

rompe così

favore di Fgf9, ed è questo spostamento quantitativo che

innesca lo sviluppo della regione bipotente verso la

formazione di un testicolo. Se invece questo stimolo non

c’è, e quindi non si esprime, ha un livello

Sry Wnt4

quantitativo maggiore, viene quindi bloccato il loop di attivazione e il risultato è che quella gonade

Sox9-Fgf9

bipotente diventerà un ovario. Vediamo come avviene tutto ciò.

PATHWAY MASCHILE

Sappiamo che Sry è un gene fondamentale per la determinazione del sesso, ma a

monte di questo gene ad oggi si sa che agisce una cascata molecolare che porta

all’up-regolazione del gene Sry, il quale si esprime solo per un brevissimo periodo

di tempo durante la vita fetale nella gonade bipotente (nel topo poche ore), ma non

nelle cellule germinali bensì nelle cellule somatiche, in quelle cellule somatiche

dette che quindi si differenzieranno in cellule del

cellule precursori del Sertoli

cellule che stanno all’interno dei tubuli seminiferi che

Sertoli, ovvero quelle

supportano il differenziamento del gamete maschile. Ci sono quindi tanti segnali

(rappresentati nell’immagine a destra), vi è ad esempio una

che confluiscono su Sry

via regolata dal prodotto del gene che coordina il fatto che Sry sia

WT1(+KTS)

espresso all’interno delle cellule precursori del Sertoli, in un modo che viene

chiamato che è una via di regolazione interna alla cellula, non

cell autonomous

deriva da segnali provenienti dall’esterno. Ci sono altre 3 vie di attivazione del

gene Sry, una molto iniziale è la cascata di fosforilazioni da GADD45 è una cascata di attivazione molto precoce, al

quale vi è la proteina GATA4 (insieme a FOG2) che è quella che agisce direttamente sull’up-regolazione

termine della

di Sry, questa è la prima cascata che si attiva nei primi momenti dell’espressione del gene a determinare il sesso

dell’espressione). Un’altra via di attivazione è quella Ir-Irr-Igf1r

(innesco che è

responsabile del mantenimento dell’espressione di Sry (mantenimento

dell’espressione) per il periodo in cui Sry deve essere espresso che però è molto

limitato. La via di GATA4 insieme a FOG2 è molto importante perché oltre ad

nell’up-regolazione

attivare direttamente Sry è coinvolto di Sox9 (che è il vero gene

sta all’origine di

che regola il differenziamento sessuale in senso maschile), Sox9

una cascata di eventi che sono fondamentali perché portano al differenziamento

definitivo delle cellule del Sertoli, ma anche all’espressione del gene AMH il quale

prodotto genico è importante a determinare lo sviluppo in senso maschile di tutta la

regione urogenitale, non solo ma questo gene ad oggi si è visto essere importante

anche a determinare il differenziamento di un’altra componente somatica del

che nel

testicolo a partire da precursori indifferenziati che sono le cellule del Leydig

testicolo differenziato si trovano all’esterno dei tubuli seminiferi e sono responsabili

della secrezione dell’ormone testosterone, inoltre questo complesso è fondamentale

anche perché agisce nella down-regolazione di Wnt4. Quindi up-regola Sox9 che a sua volta entra in un loop positivo

con Fgf9 ma nello stesso tempo down-regola Wnt4.

SRY

Questo gene è un fattore di trascrizione, ha un binding domain, nelle specie in cui è stato

descritto è evolutivamente conservato, in particolare per la regione di riconoscimento sulla

doppia elica del DNA, si lega in una regione e il suo legame determina una curvatura della

doppia elica permettendo alla regione in cui si è legato una diversa possibilità per il binding

di altri fattori di trascrizione. La trascrizione di Sry avviene in un brevissimo lasso di tempo

durante la vita fetale nelle cellule del Sertoli, ed è regolato sia nel tempo che nello spazio.

dell’RNA, dal momento dell’attivazione del gene,

Innanzitutto si è visto che l’espressione ha un picco dopo tre ore dall’attivazione, dopo 6

ore comincia già a decrescere, e nel giro di 12 ore

dall’attivazione il gene è di nuovo down-regolato,

per pochissimo tempo all’interno

quindi è attivo

dei precursori delle cellule del Sertoli, e nello

spazio. La gonade indifferenziata è stata

schematizzata come una sorta di foglietto

cellulare, SRY non viene espresso contemporaneamente in tutte le

cellule di quel foglietto, ma l’espressione inizia in un punto, nella

regione centrale, e si diffonde verso le regioni più distali

mRNA di

(immagine a sinistra, ibridazione in situ diretta sull’

Sry); con un massimo di 12 ore, (da 11 giorni dalla fecondazione fino a 11 giorni e mezzo)

scompare. Se vi è un ritardo, per qualsiasi motivazione, dell’espressione

dopodiché il segnale

di Sry (anche di poche ore) la regione della gonade indifferenziata va incontro a uno sviluppo

molto particolare, cioè invece di svilupparsi un testicolo si sviluppa una struttura, una gonade

fetale all’interno della quale si distinguono due regioni: in una si sviluppano i tubuli

seminiferi e in un’altra si sviluppano dei follicoli, quindi vi è una composizione mista di

regioni che daranno origine a strutture testicolari e delle regioni che daranno origine a

delle strutture ovariche, si sviluppa cioè quello che viene chiamato un ovotestis

(immagine a sinistra: O= strutture ovariche, T= strutture testicolari). Solo un ritardo

nell’espressione di Sry di poche ore determina che in alcune regioni, dove non viene

espresso Sry, si sviluppano strutture ovariche, e in quelle regioni in cui i livelli

quantitativi vengono raggiunti si svilupperanno dei tubuli seminiferi; è evidente che

questo soggetto sarà sterile.

SOX9

Sappiamo che Sox9 è il vero gene chiave per il differenziamento in senso maschile. Sox9 è espresso molto poco nella

gonade indifferenziata, nel giro di poco meno di 24 ore il suo livello di espressione si alza moltissimo, viene cioè

fortemente up-regolato, questa up-regolazione dipende sostanzialmente

dall’attivazione di una regione che sta a monte di SOX9, che è un

di SOX9 e si chiama a TESCO si legano fattori di

enancher TESCO;

trascrizione detti SF1 e inizia l’up-

regolazione di SOX9. Nel momento in

cui Sry viene espresso, Sry stesso si lega

a TESCO e determina un’ulteriore up-

regolazione. Il prodotto di Sox9 è a sua

volta un fattore di trascrizione che

prende il posto di Sry che viene

dislocato, e a questo punto si instaura un

loop positivo in cui Sox9 up-regola

positivamente se stesso, e qui avviene il

massimo dell’up-regolazione del gene. Sox9 è a sua volta un up-regolatore di Fgf9, ed

ecco che si innesca il loop. Una volta innescato questo loop il prodotto quantitativo di

Fgf9 comincia ad avere il predominio su Wnt4, si perde il bilancio tra Fgf9 e Wnt4 a

favore di Fgf9 e come risultato la gonade indifferenziata si svilupperà in un testicolo.

PATHWAY FEMMINILE

Sono state descritte due vie indipendenti l’una dall’altra, a monte di queste due vie ci sono

due geni: FOXL2 e RSPO1.

Prima via: RSPO1 (R-spondin 1)

RSPO1 è un attivatore di Wnt4, che insieme vanno ad attivare -catenina e via con un

pathway differenziativo in senso femminile. In assenza dell’up-regolazione di Fgf9, Wnt4

quindi da un lato c’è

non è down-regolato, una mancata down-regolazione di Wnt4 e

dall’altro l’attivazione da parte di RSPO1. Prima si riteneva che Wnt4 fosse a monte di

tutta la cascata degli eventi, fino a quando si ottennero i risultati di un lavoro fatto qui a

Pavia dal gruppo della Prof.ssa Camerino. Nel laboratorio in questione arrivarono i dati su

una famiglia di 5 fratelli, di cui uno fertile e tutti gli altri sterili. Quattro di questi fratelli,

quelli sterili, avevano anche dei problemi di tipo dermatologico. Dall’analisi cromosomica risulta che il fratello fertile

era un XY mentre i quattro sterili erano XX. A questo punto si è andata a valutare la presenza o meno di Sry e si è

visto che Sry non c’era. Cosa vuol dire? Da modelli animali di sono andati ad analizzare un gruppo di

sex reversal

geni che sapevano essere associati al sex reversal, tra questi geni c’era RSPO1; nel topo RSPO1 quando è inattivo o è

mutato dà origine al testicolo. Dopo una serie di analisi si è andati a sequenziare RSPO1 e si è visto che era mutato nei

quattro fratelli sterili XX. Hanno pubblicato il lavoro su Nature Genetics

(2006) e sono andati a verificare nel modello animale la validità della

teoria secondo cui RSPO1 è un gene fondamentale per la determinazione

a destra

del sesso in senso femminile. (Nell’immagine vediamo

un’ibridazione in situ diretta su mRNA di RSPO1, marcato in azzurro,

confronto tra maschio e femmina). Laddove una porzione di ovario

mostrasse una risposta positiva per RSPO1 questo si sviluppava come

ovario, laddove non vi era la risposta per RSPO1 questo sviluppava un

testicolo; in definitiva possiamo dire che RSPO1 è un gene estremamente

importante per il differenziamento in senso ovarico, quando non è attivo si attivazione verso l’ovario era stata

I soggetti esaminati avevano RSPO1 mutato quindi la via di

sviluppa un testicolo.

interrotta e questa gonade indifferenziata è diventata un testicolo. (Naturalmente erano sterili perché mancava il

cromosoma Y).

Seconda via: FOXL2

FOXL2 si lega nella regione promotrice di SOX9

impedendone l’attivazione, reprime la funzione di

SOX9 interrompendo il ciclo. Le cellule somatiche

nelle quali questo avviene invece che diventare cellule quelle cellule che racchiudono all’interno del follicolo

del Sertoli si differenziano in ovvero

cellule della granulosa

l’oocita, sono quelle a diretto contatto con l’oocita.

ovarico

Tutti questi geni descritti sono importanti per lo sviluppo della gonade in un ovario, e questo è stato dimostrato con

delezioni nei topi, per cui topi knock-out per RSPO1, Wnt4 o FOXL2, pur essendo XX sviluppano tessuto testicolare.

DAX1

Un altro gene importante per la determinazione del sesso femminile è un gene localizzato sul cromosoma X,

DAX1,

quando è presente in una sola copia e il cariotipo è XY il soggetto si

sviluppa come maschio normale. Analogamente nel caso XX, uno delle

due X è inattivo e si sviluppa l’ovario. Se per qualunque motivo il gene

viene duplicato, cioè si hanno due copie di

DAX1, ecco che il soggetto XY va

incontro a quindi

disgenesi gonadica,

sviluppa tessuto ovarico e il fenotipo sarà

femminile. Da questi studi emerge che

anche DAX1 è un gene importante per il pathway femminile. Come funziona questo

gene? Si ritiene che DAX1 vada a interferire con l’attivazione del gene Sry, con

l’attivazione di Sox9 e con l’attivazione di GATA4, vale a dire quei 3 geni che sono

fondamentali per attivare il pathway maschile; DAX1 ha quindi una funzione di

repressione del pathway di differenziamento maschile.

Siamo ancora a livello di cellule indifferenziate. Nel differenziamento, la determinazione di un testicolo o di un ovario

avviene ad opera di quelli che saranno i prodotti genici delle cellule somatiche, quindi avviene prima un

differenziamento somatico, al quale segue il differenziamento delle cellule germinali in oogoni o spermatogoni. Nelle

cellule in cui si esprimono Sox9 e Fgf9 avverrà un tipo di differenziamento che porterà quelle cellule a diventare

cellule del Sertoli, viceversa in quelle stesse cellule, nel momento in cui sia OFF la via regolativa maschile e sia ON

quella femminile, quelle stesse cellule diverranno cellule della Granulosa.

Sostanzialmente nella gonade indifferenziata possiamo distinguere tre tipologie di cellule:

-cellule germinali;

-precursori delle cellule di supporto (sempre a diretto contatto con le cellule germinali);

(produrranno ormoni).

-cellule a funzione steroidogenica

Dato uno stimolo, le cellule germinali proseguiranno con due vie completamente diverse: o rimarranno ferme in un

contesto fin quando potranno riprendere il ciclo dalla pubertà (caso maschile) o diverranno meiotiche (caso

femminile). Le cellule di supporto daranno origine alle cellule del Sertoli (caso maschile) o alle cellule della

Granulosa (caso femminile), e infine le cellule steroidogeniche saranno le cellule del Leydig all’esterno dei tubuli

seminiferi (caso maschile) o le cellule della teca che rivestiranno il follicolo (caso femminile).

DIFFERENZIAMENTO DELLA GONADE IN TESTICOLI E OVAIE (sesso gonadico)

CASO MASCHILE: Quando le cellule precursori cominciano a

differenziarsi, contestualmente si ha un rimodellamento di tutta la

regione indifferenziata della gonade. Le cellule germinali si

indirizzeranno verso la via maschile, diventeranno dei pro-

spermatogoni; la seconda tipologia di cellule diventerà cellule del

Leyding e poi si differenzierà una terza tipologia di cellule che sono

cellule con caratteristiche di tipo mioide (cellule muscolari) le quali

formeranno insieme alle

cellule germinali e alle

cellule somatiche i

dai quali si svilupperanno i

cordoni sessuali, tubuli seminiferi.

CASO FEMMINILE: Le cellule della pre-granulosa diventeranno cellule

della granulosa, cominceranno a circondare le cellule germinali

(singolarmente) e quindi a isolare ogni cellula germinale l’una dall’altra;

quindi mentre la spermatogenesi è un processo differenziativo in cui tante cellule germinali maturano in modo

coordinato all’interno dei tubuli seminiferi, invece il gamete femminile sta isolato e solitario all’interno di strutture

che prendono il nome di Ogni follicolo matura indipendentemente dagli altri. Le cellule germinali a

FOLLICOLI.

loro volta dopo essere andati incontro a cicli di amplificazione entrano in meiosi, (mentre nel testicolo gli

spermatogoni sono fermi, si arrestano ad un certo punto del ciclo cellulare) e lì si fermano. L’altra tipologia di cellule

somatiche si sviluppano in che sono quelle più esterne al follicolo, lo delimitano.

cellule della Teca SESSO FENOTIPICO

Una volta che si è stabilito il sesso gonadico si va a determinare il sesso fenotipico.

Nel determinare il sesso fenotipico sarà fondamentale l’influenza degli ormoni. Una

volta prodotte le strutture embrionali gonadiche che abbiamo visto essere presenti nella

regione urogenitale, è fondamentale che queste due strutture (testicolo e ovario) diano

origine all’apparato genitale interno. Mentre si sviluppano le gonadi, sia maschili che

femminili, ci sono due regioni chiamate: -dotto mesonefrico (o in

dotto di Wolff,

azzurro nell’immagine a destra) e -dotto paramesonefrico (o dotto di

in rosso) i quali prenderanno due vie che li porteranno a due

Muller,

destini completamente diversi:

-Condizione maschile: se le cellule interstiziali saranno diventate cellule del Leydig ci sarà produzione di

testosterone, nel frattempo le cellule del Sertoli a loro volta produrranno un ormone che viene chiamato ormone anti-

quindi mentre si sviluppa il testicolo avremo due ormoni che agiranno rispettivamente sul dotto mesonefrico

Muller, (il testosterone) e sul dotto paramesonefrico (l’ormone anti-Muller).

Di nuovo vediamo l’intervento degli stessi geni Sox9, SF1, WT1,che

si legano nella regione del promotore di AMH (antiMuller)

rappresentati nell’immagine a sinistra, up-regolandolo. La presenza

dell’ormone antimulleriano induce una regressione del dotto

paramesonefrico, (questo dotto è dotato dei recettori per l’ormone

antimuller e la risposta a questo legame è la regressione e la morte

cellulare), il testosterone invece andrà a stimolare la proliferazione

delle cellule e il

differenziamento del dotto di

Wolff il quale darà origine alle

varie regioni genitali interne: la

poi abbiamo

regione più prossimale al testicolo darà origine all’epididimo, i vas

vescichette seminali, dotto eiaculatore; sono tutte strutture che hanno

deferens,

funzione di dotti, attraverso i quali gli spermatozoi passeranno per uscire verso

l’esterno. Dal tubercolo urogenitale (regione più distale) si svilupperanno la

prostata, il pene e lo scroto. Per il differenziamento delle vie genitali interne

derivanti dal dotto di Wolff nel maschio il responsabile è il testosterone. Lo

sviluppo dei genitali esterni e della prostata è determinato dal

diidrotestosterone (derivato dal testosterone). Questi due ormoni determinano

lo sviluppo di tutto l’apparato genitale maschile (ovvero del fenotipo

maschile, che è determinato a sua volta dal sesso gonadico).

nel caso della presenza dell’ovario, andrà incontro a

-Condizione femminile:

degenerazione il dotto di Wolff , mentre il dotto di Muller si differenzierà in

modo che la regione più prossimale all’ovario darà origine all’ovidotto, le

regioni più distali diventeranno le tube (eventi morfogenetici importanti), poi

e prima parte della vagina; quindi tutto ciò che sta all’interno. Dal

l’utero

tubercolo urogenitale (parte finale) nel caso femminile si svilupperanno la

vagina e le piccole e grandi labbra.

Tutto questo appena descritto avviene in condizioni normali, ci sono però anche situazioni in

Condizioni patologiche

cui qualcosa viene deregolato, può essere qualcosa che sta a monte della determinazione gonadica e quindi porta ad

esempio la formazione di un ma ci sono anche delle situazioni patologiche importanti che non sono tanto

ovotestis,

legate allo sviluppo di un testicolo o di un ovario ma piuttosto a ciò che è fenotipo. Ad esempio una patologia ben

descritta, che è stata trovata con una frequenza altissima in alcune isole della regione caraibica, è quella che determina

una completa insensibilità agli androgeni (Complete Il soggetto affetto è fenotipicamente

androgen insensitivity).

femmina, però è sterile. All’analisi cariotipica è un XY e ha Sry, quindi avrebbe dovuto essere un maschio fertile, ha

funzionanti perché producono testosterone, tuttavia il soggetto è fenotipicamente femmina. Cos’è

infatti testicoli

successo in questo soggetto? Alcune mutazioni hanno indotto un cambiamento del recettore degli androgeni, i quali

vengono regolarmente prodotti ma i loro recettori non sono in grado di legare il testosterone, il risultato è che lo

sviluppo in senso maschile viene bloccato. Non essendoci il differenziamento dell’apparato genitale in senso maschile,

venendo comunque prodotti degli estrogeni, succede che nessuno dei due dotti viene stimolato a differenziarsi, ma

quei pochi ormoni sessuali femminili che vengono prodotti sono sufficienti a determinare il differenziamento

fenotipico in senso femminile.

SVILUPPO DELLA GONADE FEMMINILE: FOLLICOLOGENESI

Si riferisce alla fase post-pubertà e alla serie di eventi che portano alla produzione di un gamete maturo in grado di

terminare la meiosi, essere in grado di essere fecondato, e una volta fecondato dare origine a un nuovo individuo:

questi sono i tre momenti chiave che definiscono la allo sviluppo embrionale del gamete femminile.

competenza

OOGENESI

Processo di formazione dei gameti femminili a partire da cellule diploidi della linea germinale femminile, avviene

negli ovari, è un evento molto dispendioso dal punto di vista energetico e molto poco produttivo perché da ogni

singola cellula germinale in meiosi deriva solo una singola cellula germinale e altri prodotti che non servono che sono

i globuli polari che vengono quindi scartati; anche da un punto di vista della produzione del gamete in sé a ogni ciclo

viene prodotta una sola cellula uovo, al massimo due, inoltre la produzione della cellula

uovo non è continua ma avviene (nella nostra specie) circa ogni 28 giorni. Abbiamo già

visto che le cellule germinali migrano nelle regioni delle creste genitali, questo avviene

a 7 giorni dalla fecondazione nel topo, (terza settimana nell’uomo). Mentre le cellule

germinali continuano a riprodursi (quando arrivano nelle creste genitali sono una

vanno incontro a un’elevatissima attività di tipo

decina per poi diventare milioni)

mitotico, accompagnata anche dall’attività mitotica delle cellule somatiche. Vi è una

prima ondata di cordoni sessuali, primari, che si affondano nella regione mesonefrica e

degenerano, questa prima ondata ha un significato di tipo induttivo su una seconda

ondata di cordoni sessuali, e sarà da questi cordoni sessuali che si svilupperanno i

follicoli. Mentre tutto ciò avviene nella gonade, a livello di dotto mesonefrico e

paramesonefrico abbiamo che il mesonefrico degenera e il paramesonefrico comincia a

differenziarsi (questo avviene nella vita fetale).

A 21 giorni abbiamo la situazione in cui le cellule germinali

primordiali sono andate incontro ad amplificazione, ad un certo punto

relativamente in modo sincrono gli oogoni smettono di duplicarsi e

entrano tutti in meiosi. Preleptotene, leptotene, zigotene, pachitene (in cui c’è il crossing over),

diplotene o stadio dictiato e qui si bloccano. Siamo a 18.5 giorni dalla fecondazione (nel topo, 6-7

di gravidanza nell’uomo). C’è una grande proliferazione cellulare, tant’è che a circa 5 mesi dalla

mese

fecondazione nell’ovario della nostra specie si trovano circa 7 milioni di oogoni. Questi entrano in

evento di rimodellamento dell’ovario con

meiosi e poi cominciano a degenerare, vi è proprio un

perdita massiccia di cellule germinali, tant’è che alla nascita sono poco meno di 1 milione o anche

nuovo c’è un rimodellamento dell’ovario con ulteriore perdita

meno. Dalla nascita fino alla pubertà di

di cellule germinali che si riducono fino a 200-300 mila. Questi 200-300 mila oogoni (per ovario) sono tutto il

potenziale riproduttivo della femmina della nostra specie. È evidente che questo potenziale è più che sufficiente

perché abbiamo in tutto circa 600 mila oogoni, ma se pensiamo che a ogni ciclo mestruale ne viene ovulato uno

massimo due, vuol dire che vengono ovulati al massimo circa 24 oogoni all’anno, per tutto il periodo fertile della

donna vengono ovulati al massimo centinaia di oogoni, quindi quelle 600 mila sono in teoria più che sufficienti a

garantire la capacità riproduttiva del soggetto, se non chè dal momento della pubertà in poi, ad ogni ciclo di

reclutamento dei follicoli, non viene reclutato solo un follicolo (che maturerà e verrà ovulato) ma tanti follicoli

vengono reclutati e solo uno di questi arriverà a produrre un oocita che verrà ovulato, quindi ad ogni ciclo di

reclutamento moltissimi follicoli moriranno, tant’è che se si fa una sezione di ovario ad una donna in menopausa a

circa55 anni, si trovano pochissimi oociti o neanche uno, proprio per questo processo di reclutamento e degenerazione

di tanti follicoli per ogni ciclo. (Questi eventi che portano a una riduzione massiccia di oociti non è un’esclusiva della

nostra specie ma riguarda tutti i mammiferi, è qualcosa di fisiologico). Nella nostra specie il rapporto tra numero di

oogoni prodotti e numero di oociti alla nascita determina una perdita cellulare del 90%.

Ad ogni ciclo mestruale nei Primati viene ovulato un oocita (o più di uno, a seconda della specie). Il ciclo mestruale

nei primati si compone di tre diversi cicli:

(situazione di modificazione dell’oocita e del follicolo che porta un follicolo che è stato

-ciclo ovarico successivamente ovulare l’oocita);

precedentemente reclutato, a terminare la sua maturazione, per poi

(serie di modificazioni a carico dell’utero e che permette all’utero l’impianto della blastocisti, quindi un

-ciclo uterino

aumento dello spessore e maggiore vascolarizzazione dell’endometrio);

(modificazione dell’ambiente delle vie genitali, vagina utero e tube, che ha come risultato quello di

-ciclo cervicale

generare l’ambiente migliore possibile per facilitare il passaggio dello spermatozoo per arrivare nel luogo in cui

l’oocita verrà fecondato).

FOLLICOLOGENESI

La maturazione dell’oocita è contestuale alla maturazione del follicolo, tant’è che il processo differenziativo si chiama

e vede un aumento importantissimo delle dimensioni dell’oocita e del follicolo, la maggior parte degli

follicologenesi,

si trovano nell’ovario alla nascita sono tutti molto piccoli circa 10 micron di diametro(diametro di una

oociti che

cellula somatica media), gli oociti e i follicoli che vengono reclutati vanno incontro ad un aumento delle dimensioni

fino ad arrivare ad un diametro di circa 100 micron nella nostra specie, questo aumento delle dimensioni è legato ad

un aumento del contenuto citoplasmatico, infatti durante questa crescita a determinare l’aumento del volume del

organuli, ecc… una grande riorganizzazione

citoplasma si ha un grande accumulo di molecole , mRNA, proteine,

citoplasmatica che viene anche definita maturazione del citoplasma , ovvero quel contesto citoplasmatico che

permetterà all’embrione nelle sue primissime fasi di esistenza di andare incontro ai primi momenti della sua stessa

esistenza. Cioè all’interno del citoplasma dell’oocita si accumulano una serie di molecole che sono quelle che

indirizzeranno la vita dell’embrione per un certo periodo di tempo che dipende dalla specie. Quindi si produce durante

la follicologenesi una grossa cellula, la quale durante lo sviluppo embrionale verrà suddivisa a formare tutto

l’embrione fino al termine della segmentazione, quindi durante la segmentazione da una grossa cellula di 100 micron

di diametro torneremo a delle cellule molto piccole con 6-7 micron di diametro, si avrà una suddivisione del

citoplasma a ogni divisione cellulare.

cioè la competenza alla ripresa meiotica, si ha al termine della follicologenesi nel

[Primo livello di competenza:

momento in cui l’oocita viene ovulato, termina la prima divisione meiotica, quindi avremo l’oocita e una piccola

cellula che è il primo globulo polare.]

ISTOLOGIA DELL’OVARIO

È importante conoscere l’istologia dell’ovario perché seguendo l’istologia

si possono capire diverse cose, ad esempio si può valutare il potenziale

riproduttivo del soggetto, ci possono essere tanti follicoli primari o

pochissimi; possiamo sapere anche se un dato ovario ha ovulato o no,

in cui l’oocita viene

perché ogni follicolo che matura, nel momento

ovulato, il follicolo si rompe e viene ovulato l’oocita con tutto un gruppo

di cellule follicolari che vengono chiamate cellule del cumulo ooforo, il

resto del follicolo rimane all’interno dell’ovario e forma una sorta di

che può essere visualizzata, guardando quindi quell’ovario si

cicatrice

capisce se è avvenuta o meno un’ovulazione. Il follicolo dopo l’ovulazione può

andare incontro a due destini, a seconda se l’oocita verrà fecondato o meno:

l’oocita non viene fecondato follicolo degenera nell’ovario (lo vedremo);

-se il

l’oocita viene fecondato

-se il follicolo non va incontro a degenerazione ma

rimane attivo, perché le relazioni tra oocita e follicolo sono così strette che

per cui se è

rimangono fino a quando si definisce il destino finale dell’oocita,

fecondato l’embrione produrrà dei segnali che arrivano alle cellule del follicolo

per impedirgli di andare incontro a degenerazione ma di attivarsi e trasformarsi in

quell’ormone

un organo endocrino in grado di produrre progesterone, ossia

fondamentale per il proseguimento della gravidanza.

In ogni momento della maturazione del follicolo durante la follicologenesi,

una certa percentuale dei follicoli che vengono reclutati va incontro ad

atresia, quindi vi è perdita di follicoli in ogni momento della maturazione, sia

quando i follicoli sono piccoli quando cominciano a crescere, che durante

tutta la maturazione; anche nello stadio maturo quando il follicolo diventa

follicolo antrale una percentuale viene persa (il 77% nel topo), ecco perché a

ogni ciclo ne viene ovulato uno nella nostra specie ma tanti vengono persi,

perché l’atresia, ovvero la perdita di follicoli, è un evento fisiologico.

Nella maturazione si parte da oociti piccoli chiamati primordiali, circondati da due o tre

cellule follicolari: questi sono i (immagine a destra), a un certo punto

follicoli primordiali

arrivano dei segnali e alcuni di questi oociti escono da una sorta di quiescenza e cominciano a

maturare, e vengono chiamati vengono secrete le molecole che andranno a

early growing,

formare il citoplasma nella sua composizione definitiva, e inizia un’incredibile attività

mitotica delle cellule follicolari, che iniziano ad aumentare di numero. Da questo stadio in poi

le

tutta questa maturazione è controllata dagli ormoni ovvero è una fase ormone-dipendente,

cellule aumentano di numero e a un certo punto si formano delle strutture con cavità, le cavità

poi si fondono per formare un antro, l’antro contribuisce a determinare la forma finale del

follicolo, che è una struttura incredibilmente grande (nella nostra specie raggiungono 3-4 cm) che sarà costituito

sostanzialmente da :

-cellule organizzate nella regione esterna a delimitare un antro;

nella quale si individua l’oocita e un gruppo di cellule del cumulo.

-regione terminale del differenziamento e a questo punto l’oocita insieme alle cellule del cumulo è pronto

Questo è il momento

per essere espulso dal follicolo, entrare nelle tube e poi essere fecondato.

ASPETTI MORFOLOGICI

Bisogna sempre avere presente l’architettura del tessuto o dell’organo dal quale si preleva la

cellula che ci interessa, perché ognuno di questi elementi è integrato funzionalmente a tutto

il resto, è solo quando tutte le componenti dell’organo dialogano tra di loro in modo

cellule si possono correttamente differenziare. Quindi anche se l’istologia

armonioso che le

può sembrare un ambito obsoleto, se si perde di vista come il tessuto è organizzato non si

riuscirà mai a ottenere risultati veramente importanti, soprattutto se parliamo di

arrivando fino all’ingegneria tissutale. Vediamo quindi come nel

differenziamento cellulare,

tempo cambia l’istologia dell’ovario: alla nascita l’ovario è come rappresentato in figura a

destra, le cellule un po’ più grandi sono gli oociti e quelle piccole attorno sono cellule

appiattite con citoplasma grande che circondano l’oocita e sono le cellule follicolari. Come vediamo nell’immagine in

basso a destra è rappresentata una sezione di ovario, si possono distinguere

due regioni: la regione più esterna viene chiamata corticale, in cui ci sono

le cellule germinali, la regione più interna viene chiamata midollare e qui

non ci sono cellule germinali ma vasi sanguigni, è molto vascolarizzata.

L’immagine a sinistra rappresenta un follicolo

primario, è fermo alla profase I dello stadio di

diptiotene, e sono presenti alla nascita. Già ad

una settimana cambia la morfologia dell’ovario (

nell’immagine in basso a sinistra è rappresentata

una sezione di ovario di una topolina a una

settimana), già ad una settimana insieme a oociti e follicoli primordiali ci sono i follicoli

primari in cui si può intravedere l’oocita più grande, poi abbiamo gli oociti secondari

con follicoli secondari (immagine a destra in basso); a partire dalla quarta settimana

e per il resto della vita la topolina può produrre anche 17

topi alla volta.

La struttura rosa che si intravede nei follicoli è la zona

uno dei rivestimenti dell’uovo. Nei

pellucida che è

mammiferi i rivestimenti dell’uovo sono 3 :

-la membrana plasmatica;

– la zona pellucida (struttura glicoproteica); [tra questi due strati vi è un piccolo spazio virtuale che si evidenzia in alcune circostanze,

che si chiama spazio perivitellino.]

–terza struttura di rivestimento sono le cellule follicolari stesse.

Poi a seconda delle specie ci possono essere altri rivestimenti, si pensi al guscio dell’uovo degli uccelli (in cui lo

sviluppo dell’uovo avviene all’esterno del corpo materno).

Il follicolo primario inizia a evidenziarsi alla pubertà, cioè nel momento in cui si verifica una

serie di cambiamenti che sono sostanzialmente determinati dalla produzione di ormoni. Il

follicolo primario matura in follicolo secondario, avviene ad un certo punto il reclutamento

di questi follicoli grazie alla regolazione di una cascata ormonale di segnali che viene indotta

a livello ipotalamico. Comincia un’altissima attività di trascrizione del DNA che termina nel

momento in cui siamo vicini alla fase terminale della maturazione dell’oocita. Quindi

comincia questa grande sintesi di RNA (al momento del follicolo secondario) e termina a

livello di follicolo antrale, cioè quando si è formata la cavità antrale.

ZONA PELLUCIDA

Matrice extracellulare che si evidenzia molto precocemente durante la follicologenesi e

accompagna l’oocita fino al momento dell’ovulazione e oltre. Quindi sarà presente la zona

pellucida non solo nella fecondazione ma anche la successiva segmentazione avverrà all’interno

della zona pellucida. Accompagnerà l’embrione fino al momento dell’impianto, tant’è che

l’impianto è possibile solo nel momento in cui l’embrione stesso sguscia dalla zona pellucida

per riconoscere una serie di recettori presenti sulla superficie dell’utero materno, e qui si

a circondare l’embrione fino al momento dell’impianto

impianta. Lo scopo della zona pellucida

è quello di proteggere l’embrione impedendo che questo possa impiantarsi in zone non permissive, perché la

fecondazione avviene in regioni molto alte delle vie genitali, nell’ovidotto o nella parte alta delle tube, dopodiché

l’embrione mentre avviene la segmentazione inizia a scendere nelle vie genitali femminili e nella nostra specie si

impianta nel terzo alto dell’utero, se per caso l’embrione sguscia dalla zona pellucida prima, si impianta e

naturalmente è un problema perché comincia a crescere in una zona non permissiva, quindi bisogna rimuoverlo. La

zona pellucida è costituita da tre proteine che si chiamano ZP1, ZP2 e ZP3, i rapporti quantitativi sono 1/4/4 (nel

topo). Nell’immagine (sopra) si vede che la zona pellucida è formata da fasci di proteine che si alternano ZP3-ZP2, la

ZP1 ha la funzione di connettere questi fasci e quindi stabilizza la struttura. Ognuna di queste 3 proteine svolge un

ruolo diverso:

-ZP1 ha un ruolo strutturale;

-ZP2 e ZP3 sono importanti perché sono deputati al riconoscimento dello spermatozoo e alla stabilizzazione del

legame dello stesso con la zona pellucida e quindi a permettere allo spermatozoo di oltrepassare la zona pellucida,

e infine fondersi con la membrana dell’oocita. Nell’insieme la zona pellucida è

entrare nello spazio perivitellino

importante perché costituisce una barriera che lo spermatozoo deve penetrare, ma una barriera selettiva, nel senso che

una volta che lo spermatozoo è penetrato all’interno della

riconosce lo spermatozoo ( legame specie-specifico) ma

zona pellucida e raggiunge l’uovo, impedisce agli altri spermatozoi di fare lo stesso percorso, ovvero blocca la

deve fecondare l’oocita;

polispermia, proprio perché un solo spermatozoo se per caso un secondo spermatozoo entra,

il risultato è che l’embrione non si sviluppa perché diventa triploide. In particolare è la proteina ZP3 della zona

pellucida che riconosce lo spermatozoo inducendo una reazione detta acrosomiale che è quella che permette la

liberazione di una certa quantità di enzima dall’acrosoma dello spermatozoo, quindi la penetrazione attraverso di essa.

Nel momento in cui avviene questa reazione acrosomiale si perdono i contatti tra la zona pellucida e i recettori sullo

spermatozoo, il risultato è che lo spermatozoo potrebbe scollarsi, e quindi non penetrare, per evitare ciò interviene la

ZP2 che stabilizza il legame con lo spermatozoo permettendone il passaggio. Ci sono tre geni codificati nel topo che

vengono espressi precocemente durante la follicologenesi, queste 3 proteine hanno un dominio di 260 a.a.

evolutivamente conservato, quindi questo conferma la grande importanza del ruolo svolto da queste proteine nella

di crescita dell’oocita che vede il

fecondazione. Vi è un massimo nei livelli di trascrizione di ZP3 nel momento

passaggio da growing oocite al momento in cui acquisisce la massima dimensione.

nucleo dell’oocita si chiama germinal vescicle (GV), vescicola germinale, la chiamiamo GV fino al momento in

[Il

cui prima dell’ovulazione, questa vescicola va incontro a una serie di modificazioni per la preparazione alla divisione,

si condensa il DNA e si formano i cromosomi, questo particolare momento viene chiamato GVBD (germinal vescicle

break down).]

Se ZP3 è assente non si forma nemmeno la zona pellucida e chiaramente ci sono problemi di fertilità, se invece è

assente la ZP2 comincia a formarsi la zona pellucida ma la sua maturazione non avviene, se ZP1 è assente la zona

pellucida si forma ugualmente, e tutto sommato una parte degli oociti sono fertili.

Man mano che le cellule follicolari aumentano di numero queste assumono una morfologia

diversa, ad esempio le cellule che sono più vicine all’oocita riescono a mandare delle

con il citoplasma dell’oocita e

proiezioni (attraverso la zona pellucida) e giungono a contatto

viceversa, alcune proiezioni dell’oocita giungono a contatto con le cellule che stanno adese

proiezioni sia in un senso che nell’altro garantiscono il passaggio

alla zona pellucida. Queste alla maturazione del follicolo stesso, tant’è che se noi

di molecole che sono fondamentali

prendiamo questa struttura e riusciamo ad eliminare l’oocita, le cellule follicolari non

crescono, e non si forma il follicolo. Viceversa se togliamo da un certo stadio di sviluppo in

follicolari e si fa crescere solo l’oocita, allora se l’oocita lo si fa maturare

poi le cellule negli

ultimi momenti dello sviluppo si riesce ad ottenere un oocita competente allo sviluppo, ma

l’oocita non matura,

se queste cellule le togliamo in momenti più precoci, quindi sono

importanti queste strette associazioni. “della

Mentre si formano gli strati di cellule, che chiameremo granulosa” quelli più vicini

all’oocita e “della teca” quelli più esterni, questi due strati di cellule svolgono funzioni

diverse: quelle della granulosa hanno una funzione anche di tipo trofico nei confronti

dell’oocita mentre quelle esterne hanno una funzione di tipo steroidogenico, queste cellule

sintetizzano il testosterone a partire dai precursori, il testosterone viene poi convertito in estradiolo dalle cellule della

granulosa, non da quelle vicine all’oocita ma da quelle della granulosa murale che circondano l’antro e si trovano

nello spazio più esterno non direttamente a contatto con l’oocita. Il processo differenziativo continua, abbiamo l’antro

che si va formando, si forma il follicolo antrale o follicolo di GRAFF, è un follicolo pronto ad espellere il proprio

oocita con il cumulo ooforo. Nel momento in cui questo viene espulso rimane il corpo luteo, se contiamo i corpi lutei

possiamo sapere quanti oociti sono stati ovulati. Oppure si possono sapere se si hanno delle perdite prezigotiche, ad es.

se noi contiamo il numero di corpi lutei sulla superficie dell’ovario e poi andiamo a contare il numero degli impianti

nell’utero, e vediamo che non coincidono, sappiamo che in qualche momento, cioè prima della fecondazione o prima

dell’impianto, degli embrioni sono andati persi, e questo può essere molto utile per indirizzare la ricerca nel caso di

determinate patologie. I follicoli vengono classificati in piccoli, medi e grandi e questa classificazione dipende dal

del follicolo e dal numero delle cellule follicolari.

diametro dell’oocita,

24/10/2014

Ancora oggi si utilizza la classificazione di Peters e Pedersen(1970) per definire gli stadi di maturazione del

follicolo e dell'oocita. La classificazione si basa sostanzialmente sul diametro dell'oocita,del follicolo e sulla

quantificazione degli strati delle cellule follicolari (del numero delle cellule follicolari).Sono tanti i geni che

regolano il passaggio da cellula primordiale fino allo stadio di sviluppo del follicolo, e solo per alcuni è nota

la relazione tra di loro(network) mentre per molti invece non si conosce il network che ruota attorno ad ogni

singolo gene. Questo è stato definito sulla base di studi fatti su modelli di topi knochout ,in cui si spiega

come l'assenza di un determinato gene sia importante affinchè la follicologenesi venga interrotta in qualche

momento.OCT4 e NANOG sono geni importanti nella oogenesi e follicologenesi. Inoltre sono fra i geni

estremamente importanti nel mantenere la staminalità delle cellule embrionali staminali.

ANALISI MORFOLOGICA DI UN FOLLICOLO MATURO-Siamo in metafase in cui l'oocita maturo sta

per essere ovulato. Ci sono le cellule della granulosa e della teca e tra uno strato e l'altro delle cellule della

teca c'è una matrice che definisce i confini tra i diversi strati che compongono la regione esterna del

follicolo.L'analisi morfologica è il primo parametro che viene studiato in modo da verificare se il follicolo, è

un follicolo che è stato maturato correttamente. Questo tipo di analisi morfologica è importante soprattutto

nel momento in cui si vuole coltivare il follicolo in vitro. Ci sono molti studi mirati a definire quali sono le

condizioni di coltura ideale per la maturazione del follicolo a vari stadi. Ad esempio risulta più semplice

determinare la maturazione finale a partire dallo stadio di oocita,mentre risulta molto difficile se si parte da

follicoli e oociti molto piccoli. Questi studi sono importanti per una necessità di tipo clinico come ad

esempio(infertilità primaria:coppie che dopo un anno di rapporti non protetti non hanno figli).Può essere

dovuto all'assunzione di chemioterapici esempio per il tumore all'ovario, in quanto determinano la morte di

follicoli e degli oociti.Per cui un modo per preservare e far maturare i follicoli di una donna sottoposta a

chemioterapia è la maturazione dei follicoli in vitro. Non è una via che garantisce la fertilità del soggetto,ma

è almeno una via che si può esplorare per tentare di mettere in condizione di avere figli una persona colpita

da tumore. Al termine della maturazione il follicolo si presenta in questo

modo:si vede l'oocita con la zona pellucida che lo circonda,le cellule del cumulus ooforo quelle granulose

che ne delimitano la cavità e più esternamente ci sono le cellule della teca. Le cellule della teca costituiscono

una teca interna ed esterna mentre attorno ci sono i vasi sanguigni. A questo punto,l'oocita e le cellule del

cumulo sono pronte a lasciare il follicolo entrare nella porzione alta delle tube uterine ed essere

eventualmente fecondato. Tutto questo avviene durante l'ovulazione. L'ovulazione è un evento che all'interno

del gruppo dei mammiferi viene determinato con modalità diverse. Per esempio in alcune specie come nei

conigli, l'ovulazione viene indotta solo con la copulazione. Oppure l'ovulazione è determinata dalla

modulazione dei livelli ormonali definita(estro)che è caratteristica della nostra specie. Quando il follicolo è

pronto,si genera un varco nella parete del follicolo stesso e l'oocita insieme alle cellule del cumulo viene

espulso all'esterno. La porzione maggiore del follicolo resta all'interno dell'ovario, si sviluppa il corpo luteo

che diventa un corpo albicans nel momento in cui l'oocita non viene fecondato. Come risultato rimane un

piccola cicatrice sulla superficie dell'ovario costituita da tessuto di tipo atresico.

In questa immagine si vedono le varie tappe

dell'ovulazione:man mano che il follicolo matura, si evidenzia sempre di più sulla superficie dell'ovario.

Questa evidenza è molto utile ad esempio ai fini del pick up degli oociti. Perchè quando il paziente si

sottopone a trattamenti per ottenere dei gameti,invece di attendere una normale ovulazione e prelevare gli

oociti all'interno delle tube, si preferisce prelevare gli occiti dalla superficie dell'ovario. Grazie al

rigonfiamento dell'ovario è possibile distinguere i follicoli maturi da quelli non maturi e l'operatore con un

ago punge la superficie del follicolo e aspira gli oociti con le cellule follicolari. Prima di effettuare il sistema

del pick up,la paziente viene iperstimolata somministrandole una rilevante dose di ormoni.

Immagine(non l'ho trovata)

Serie di immagini effettuate utilizzando una sonda in modo da evidenziare la superficie dell'ovario. Si può

osservare la zona in cui l'oocita insieme alle cellule follicolari lasciano la superficie dell'ovario. La sonda

entra in un determinato punto della superficie dell'ovario e preleva l'oocita con le cellule follicolari. Se

questo avviene naturalmente, la superficie si rompe a causa dell'elevata pressione interna del follicolo che

spinge fuori l'oocita e le cellule follicolari. Ora l'oocita e le cellule follicolari entrano nelle fimbrie che sono

strutture appartenenti alla specie umana scende e attende la fecondazione.

Immagine alla MO mostra il momento in cui l'oocita viene espulso dalla superficie dell'ovario.

Come prodotto finale poiché è stata completata la prima divisione meiotica si osserva l'oocita e il primo

globulo polare,la zona pellucida le cellule del cumulus ooforo che sono circa 2000-2500.Le cellule del

cumulo sono cellule terminalmente differenziate, che al momento dell'ovulazione vanno incontro ad un

processo di espansione del cumulo. Fin tanto che rimangono nell'ovario le cellule del cumulo sono unite tra

loro a costituire le cellule epiteliali delle giunzioni strette. Al momento dell'ovulazione queste giunzioni si

staccano e tra una cellula e l'altra viene deposta una matrice di acido ialuronico molto idratante garantendo

un espansione in termini di volume delle cellule del cumulo. Le cellule del cumulo se presenti nell'ovario

vanno incontro a molti cicli replicativi. Nel momento in cui lasciano l'ovario diventano cellule quiescenti che

nel giro di 24 -48 si distaccano completamente dall'oocita e vanno incontro a degenerazione. La relazione tra

oocita e cellule follicolari è molto importante perchè l'assenza di una o dell'altra componente non permette la

maturazione né dell'una e né dell'altra componente. Uno tra gli aspetti che è regolato dalla connessione tra

cellule della granulosa del cumulo ooforo e oocita,è il mantenimento del blocco della meiosi. Il blocco della

meiosi viene mantenuto fin tanto che le cellule del cumulo presentano elevati livelli di cAMP all'interno

dell'oocita. Sotto stimolo esterno le cellule più esterne (della granulosa murale),esprimono al termine della

maturazione del follicolo i recettori per l'LH .I recettori legano l'LH attivando una cascata di eventi tali per

cui si manifesta un blocco del passaggio di cAMP tra le cellule follicolari e l'oocita. Questo determina la

diminuizione dei livelli di cAMP che è il segnale scatenante la ripresa della meiosi. Nel momento in cui

avviene la prima divisione meiotica si ha l'estrusione del primo globulo polare. Il primo globulo polare

prima della prima divisione meiotica non è visibile,e sta localizzato tra la zona pellucida e l'oocita. Esistono

molti parametri morfologici utilizzati per definire la bontà dell'oocita. Sono dei criteri utilizzati in tutte le

cliniche di fecondazione assistita e tra i tanti criteri c'è anche la dimensione dello spazio perivitellino.

Quando c'è la presenza di due globuli polari vuol dire che è avvenuta la prima e seconda divisione meiotica.

Inoltre,questo sarà un oocita che anche se fecondato non porterà ad un embrione perchè la seconda divisione

meiotica è avvenuta troppo precocemente. La seconda divisione meiotica sia nell'uomo che nel topo,avviene

nel momento in cui lo spermatozoo penetra nell'oocita perchè è lui che attiva il metabolismo dell'oocita

inducendo la seconda divisione meiotica.

REGOLAZIONE ENDOCRINA DELL'OVARIO

L'asse è ipotalamo-ipofisi-gonadi,e vale sia per la spermatogenesi che per l'oogenesi. L'ipotalamo secerna un

ormone GnRH che agendo sull'ipofisi secerna tre ormoni LH FSH e prolattina. L'H agisce sulle cellule della

teca e interstiziali poiché tali cellule hanno recettori per l'LH. Le cellule presenti nel follicolo rispondono ad

ormoni diversi e diventano loro stesse produttori di ormoni. Infatti per questa ragione il follicolo viene

considerato un mini organo endocrino. Sotto stimolo ormonale,le cellule più esterne sintetizzano il

testosterone a partire dal progesterone. Mentre le cellule più interne captano il testosterone e lo convertono in

estrogeni. Ci sono sostanzialmente due momenti con due tempistiche diverse che

portano all'ovulazione. Il passaggio da follicolo primordiale(piccolo) a follicolo maturo è un evento che ha

una durata di 60giorni.I 28 giorni del ciclo,corrispondono al periodo di tempo dal momento in cui il follicolo

in crescita(follicolo di grande dimensione) viene reclutato e termina la fase di maturazione diventando

follicolo antrale. Ad ogni ciclo mestruale sono i follicoli che hanno già risposto ad una prima ondata di

reclutamento che terminano la maturazione diventando follicoli Graaff. Tutto il periodo da follicolo piccolo a

follicolo di Graaff è di 60 giorni.

IL FOLLICOLO COME MINI ORGANO ENDOCRINO

Il follicolo ha delle funzioni endocrine sia prima che dopo l'ovulazione. Prima dell'ovulazione perchè

produce gli estrogeni,e dopo l'ovulazione perchè produce anche progesterone. La durata della produzione di

progesterone dipende dal fatto che l'oocita venga fecondato o meno.

Nove ore prima dell'ovulazione si ha un aumento notevole di

FSH e LH che portano al compimento della maturazione. Successivamente si ha la prima divisione meiotica,

e infine l'espulsione del cumulo ooforo e dell'oocita dal follicolo. Avvenuta l'ovulazione il corpo luteo

secerna il progesterone. Ma se l'oocita non viene fecondato nel giro di 14-15 giorni, l'oocita andrà incontro a

degenerazione. Il risultato è che se la fecondazione non avviene, si ha non solo la regressione del corpo luteo

che diventa corpo albicans,ma si ha anche una modificazione della superficie dell'utero la quale inizia a

sfaldarsi causando la mestruazione. La mestruazione nella nostra specie è lo sfaldamento della mucosa

uterina. Se invece la fecondazione avviene,intervengono due segnali ormonali. Le cellule del trofoblasto che

sono esterne alla balastocisti iniziano a produrre l'hCG mentre l'ipofisi rilascia la prolattina. Questi due

ormoni agiscono sul corpo luteo attivandolo e stimolando così la produzione per circa 4-5 mesi di

progesterone durante la gravidanza.

Nei primati il ciclo di maturazione dell'oocita accompagnato a modificazioni sia uterine che cervicali viene

ciclo mestruale. ciclo ovarico

definito Il è la fase terminale del differenziamento e della maturazione

ciclo uterino

dell'oocita e del follicolo,il consiste nella modificazione dell'utero per accogliere la blastocisti

ciclo cervicale

e infine il consiste in una serie di modificazioni dell' ambiente delle vie genitali femminili

per permettere il passaggio degli spermatozoi. FSH e LH, sono sostanzialmente gli ormoni che determinano

la maturazione quando raggiungono il picco a 9 ore prima dell'ovulazione e inoltre determinano l'ovulazione

inseguito al successivo crollo delle concentrazioni di LH e FSH insieme alla diminuizione dei livelli di

estrogeni prodotti dalle cellule del follicolo stesso. L'oocita nel momento in cui viene ovulato, presenta al di

sotto della membrana plasmatica una serie di granuli. Si tratta di vescicole definite granuli corticali che sono

importanti per bloccare la polispermia nel momento in cui uno spermatozoo penetra nell'oocita.

Negli oociti dei mammiferi la trascrizione genica è essenziale per la

maturazione del citoplasma. La maturazione dell'oocita è complessa e può avvenire anche ad opera di altri

tipi cellulari. Nel caso dei mammiferi avviene ad opera delle cellule follicolari mentre in altre specie come

negli insetti può avvenire anche ad opera di altri organi come il fegato. Il fegato negli insetti,produce delle

molecole che vengono convogliate all'interno dell'oocita. E' stata stimata la quantità di RNA negli oociti

primordiali rispetto a quelli maturi e si è visto che in quelli maturi vi è un accumulo di 300 volte rispetto alla

quantità di RNA presente negli oociti primordiali. L'RNA negli oociti maturi può essere diviso in 0.3-0.5ng

e distribuito come 60-65% di rRNA,20-25% di tRNA e 10-15% di mRNA. Anche se la percentuale di mRNA

nell'oocita è meno rilevante rispetto agli altri RNA,la quantità di mRNA è talmente elevata da permettere di

fare una RTPCR su singola cellula. Insieme ai vari svantaggi di lavorare con le cellule germinali femminili

rispetto a quelli maschili,quando si effettuano studi su questi tipi di cellule se si lavora con i topi c'è la

possibilità di produrre circa 15 cellule germinali femminili per volta. Il vantaggio della dimensione è che

possiamo studiare ogni singola cellula e capire se ogni singola cellula è competente o meno allo sviluppo

embrionale. Lo si può fare con molteplici saggi compreso quello di andare a studiare l'espressione del gene

di nostro interesse. Analogamente alla quantità di RNA, la quantità di proteina

prodotta sarà elevata. L'immagine si riferisce alla produzione oraria in termini di picogrammi. Questa

quantità scende nel momento in cui l'oocita matura diventando metabolicamente silente.

Immagine relativa alle diverse fasi di maturazione nel topo.

Insieme ad una maturazione citoplasmatica avviene una maturazione nucleare. La maturazione nucleare

prevede la metilazione linea germinale specifica a carico della cromatina dell'oocita(imprinting), la

trascrizione di geni importanti nel controllo delle prime fasi dello sviluppo embrionale chiamati maternal

effect genes e infine una modificazione della cromatina che serve a classificare gli oociti sulla base della

conformazione della cromatina.

Immagine - classificazione degli oociti in base all'organizzazione cromatinica.

SN e NSN definiscono due tipologie di organizzazione della cromatina.

SN sta per surrounded nucleulus e vuol dire che il nucleolo è circondato da un anello di eterocromatina.

NSN sta per not surrounded nucleulus e vuol dire che l'anello di cromatina non c'è,ma l'eterocromatina è

diffusa sottoforma di spot all'interno di tutto il volume nucleare. La differenza tra SN e NSN, è utile per

seguire la maturazione degli oociti all'interno dell'ovario, ma soprattutto ci permette di definire solo sulla

base della morfologia della cromatina, quali sono gli oociti competenti e non competenti allo sviluppo

embrionale al termine della maturazione dell'oocita. Ad esempio comparando i due tipi di oocita si può fare

una serie di studi mirati a chiarire quali siano i daterminanti molecolari della competenza allo sviluppo

embrionale. Gli oociti NSN se fecondati si fermano allo stadio di due cellule;mentre gli oociti SN in vitro

arrivano allo stadio di blastocisti(competenti allo sviluppo embrionale)perchè se inseriti in una topolina

pseudogravida si ottengono dei piccoli. Al termine della follicologenesi,non tutti gli oociti hanno completato

lo sviluppo(meiosi) e questo dipende dal gruppo del phylum. Infatti,anche nella specie dei mammiferi ci

sono delle differenze. Ad esempio ci sono degli oociti che vengono fecondati già quando sono allo stadio di

vescicola germinale che è lo stadio in cui non è avvenuta nemmeno la prima divisione meiotica. Questo si

manifesta soprattutto all'interno degli invertebrati,e sono due eccezioni nei mammiferi il cane e la volpe.

Esempio (molluschi ,vermi,insetti, stella di mare etc..) presentano allo stadio di vescicola germinale in cui

è avvenuta la prima metafase;(tutti i mammiferi tranne cane e volpe,anfibi ,pesci etc..) hanno oociti fermi

alla seconda metafase. Il riccio di mare invece,presenta oociti in cui è completa sia la prima che la seconda

divisione meiotica. Strategia applicabile sono nella ricerca:

Immagine di SN e NSN l'antro e i follicoli maturi. è possibile

fare un pick up all'interno di questi follicoli prima della meiosi e colorare l'oocita con un fluorocromo che

diventa fuorescente se eccitato con luce UV. Questa metodologia non è applicabile agli oociti umani poiché

la luce UV risulta essere dannosa per gli oociti umani. Riferendoci alla differenza tra SN e NSN;il 3342 è un

fluorocromo che lega preferenzialmente le basi A T. Nel topo l'eterocromatina è ricca in basi AT per cui non

solo ci consente di distinguere una diversa organizzazione nucleare ma anche dove è distribuita

l'eterocromatina.

Descrizione di tutti i passaggi tra la prima e seconda divisione meiotica.

Nello Xenopus la prima divisione meiotica è controllata dal progesterone che innesca la via metabolica con

conseguente completamento della prima divisione meiotica. Il blocco alla seconda divisione meiotica

avviene invece ad opera del fattore citostatico. Nel caso sia dello Xenopus e del mammifero il blocco alla

seconda divisione meiotica viene tolto nel momento in cui lo spermatozoo penetra all'interno del citoplasma

dell'oocita. La penetrazione dello spermatozoo nell'oocita determina un aumento dei livelli di calcio che

appare come un'onda(ondata di calcio) che si propaga dal punto

in cui è avvenuto il contatto tra spermatozoo e oocita al lato

opposto. Il calcio attiva tutto il metabolismo dell'oocita e sarà

responsabile del completamento della seconda divisione

meiotica in quanto determina la degradazione del fattore

citostatico.

Cosa troviamo all'interno del citoplasma dell'oocita?

La qualità e la quantità di materiale presente nel citoplasma dipende dalla specie. Ad esempio gli oociti dei

mammiferi hanno pochissimo citoplasma. Il citoplasma(di 2,4,8 al massimo 16 cellule) sostiene per una

periodo di tempo breve lo sviluppo embrionale perchè successivamente viene sostenuto dalla madre. Ci sono

delle specie in cui tutto lo sviluppo embrionale avviene all'esterno della madre. In queste specie, durante la

follicologenesi deve essere prodotta una quantità di materiale sufficiente per garantire lo sviluppo

dell'embrione. In tutte le tipologie degli oociti troviamo l'RNA nelle sue diverse componenti (rRNA ,tRNA e

mRNA), e molecole definite fattori morfogenetici. I fattori morfogenetici sono una categoria estremamente

eterogenea di molecole. Inoltre nel citoplasma degli oociti troviamo tuorlo e proteine.

I determinanti morfogenetici.

Il termine di fattori morfogenetici è riferito ad un'attività della molecola(funzione svolta dalla molecola) non

a molecole in termini chimici. Un fattore morfogenetico può essere una proteina o un RNA. I fattori

morfogenetici così chiamati,sono dei determinanti dello sviluppo embrionale. In particolare sono

determinanti che definiscono a seconda del momento dello sviluppo le varie tappe dello sviluppo. Per

esempio i determinanti morfogenetici a livello della gastrulazione determinano gli assi corporei(regione

anteriore e regione posteriore dell'embrione e la regione dorsale dalla ventrale).Un determinante

morfogenetico in Drosophila è quell1o dello sviluppo della testa rispetto al testo,e alle ali. E' possibile

dividere l'embrione di Drosophila in tanti spicchi,e da ogni spicchio in base ai determinanti morfogenetici ai

livelli e alle loro interazioni, si può dedurre da ogni singola porzione dell'embrione quale sarà la regione

corporea che si svilupperà a termine.

Da cosa è composto il tuorlo? Il tuorlo è importante per sostenere lo sviluppo embrionale. E'

costituito da lipidi carboidrati e proteine. La quantità di tuorlo

varia a seconda della specie. Le uova vengono classificati in

isolecitiche(con poco tuorlo uniformemente

distribuito),mesolecitiche(tuorlo un po' più abbondante

distribuito non in modo uniforme ma generalmente nel polo vegetativo dell'uovo),centrolectiche( il tuorlo

sta nella zona centrale dell'uovo) e infine telolecitiche(il tuorlo comprende tutto il volume dell'uovo).Una

quantità di tuorlo abbondante rispetto alla quantità di tuorlo presente nelle uova dei mammiferi che sono con

pochissimo tuorlo,permette di definire una polarità della cellula in cui si distingue un polo animale da un

polo vegetativo. All'interno del citoplasma degli oociti di Xenopus si osserva

una stratificazione di molecole. Per esempio i ribosomi e i mitocondri sono situati nella regione mediale,la

parte pesante del tuorlo si trova al polo vegetativo e la restante parte del citoplasma nel polo animale. Quindi

possiamo definire una polarità della cellula che ci permette di distinguere delle regioni. Ad esempio in

Drosophila possiamo predire quali saranno le regioni dai quali si svilupperanno le varie parti del corpo.

A livello della blastula(embrione precoce al termine della segmentazione) e dell'oocita sono presenti dei

territori presuntivi(polarità), dai quali si generano determinate cellule che in momenti successivi dello

sviluppo embrionale daranno origine a regioni del feto poi dell'embrione e infine dell'individuo adulto.

A seconda della specie cambia anche il momento in cui l'uovo viene deposto. A seconda della specie la

deposizione dell'uovo viene definita eterosintetica o autosintetica.

Autosintetica: è l'oocita stesso a produrre all'interno della cellula i determinanti del tuorlo. Eterosintetica:

quando ci sono altre cellule come quelle follicolari o altri organi(come il fegato) a contribuire nella

produzione dei determinanti del tuorlo.

Immagine in cui viene descritta la morfologia dell'uovo di Drosophila

E' un uovo centrolecitico. L'uovo risulta essere allungato,ci sono due appendici ed una regione chiamata

micropilo che si estende dalla superficie dell'uovo. Il micropilo è l'unico punto attraverso il quale può

penetrare lo spermatozoo per fecondare l'oocita. Mentre nel caso dei mammiferi lo spermatozoo può

penetrare più o meno su tutta la superficie dell'oocita tranne che nella regione follicolare . Anche solo sulla

base della morfologia è possibile stabilire la regione anteriore e posteriore dell'embrione. Se si analizza la

composizione di mRNA si osserva che nella regione anteriore c'è una tipologia di mRNA che è assente nella

regione posteriore e viceversa. Mentre nel caso dei mammiferi abbiamo delle cellule germinali che sono

determinate ad essere germinali nei primissimi momenti dello sviluppo embrionale,in Drosophila la

determinazione della cellula germinale rispetto alla linea somatica avviene molto più tardi(negli stadi

terminali della maturazione del gamete).Si parte da cellule di natura staminale che andando incontro ad una

serie di divisioni mitotiche formano una struttura con 16 cellule e il tutto è regolato da un equilibrio di

relazione tra le 16 cellule che si formano; solo due di queste cellule hanno la probabilità di diventare oocita

e ciò dipende dalle differenze quantitative di determinate molecole. Le altre 15 cellule diventano cellule

nutrici con funzione di supporto trofico dell'unica cellula che diventerà in realtà oocita.

Studi di ricerca di biologia dello sviluppo del gamete femminile per vari scopi quali:

1)Comprensione degli eventi molecolari che permettono il passaggio da cellula immatura a matura con la

capacità nel dare origine ad un nuovo individuo.2)Applicazione in ambito clinico(es.fecondazione assistita)

sia nella nostre specie ma anche nelle specie di interesse veterinario e in zootecnia.3)Capire cos'è che

determina un oocita competente allo sviluppo embrionale rispetto ad un oocita non competente allo sviluppo

embrionale. Lo si fà trovando dei marcatori che in modo molto semplice ci dicono se l'oocita è competente o

non competente allo sviluppo. 27 Ottobre 2014

Seminario Martina Belli

Marcatori della competenza allo sviluppo dell’oocita

La scorsa volta è stato concluso l’argomento sulla follicologenesi. Sono state trattate le tappe fondamentali che portano alla

produzione di un follicolo maturo che abbia acquisito la capacità di andare incontro alla prima divisione meiotica, di essere fecondato

e sostenere lo sviluppo embrionale. Questo seminario e il prossimo approfondiranno questo argomento, cioè la ricerca nell’ambito

della maturazione del gamete femminile. La professoressa Vigoni terrà il secondo seminario e insieme alla dottoressa Belli, ha studiato

il complesso oocita-cellula follicolare, oocita- cumulo ooforo, con l’obiettivo di raggiungere la competenza allo sviluppo.

Presentazione del lavoro di dottorato della dottoressa Martina Belli: Si tratta di un lavoro che ha avuto la

durata di 4anni. La discussione verte sulla ricerca di marcatori della competenza allo sviluppo dell’oocita. Il

modello di riferimento è il modello murino e tutti gli esperimenti trattati sono stati fatti sul topo.

Per inserire questo lavoro all’interno di un ambito che doveva soddisfare il dottorato fatto dalla dott. Belli, si

parlerà di Engineering the ovarian follicle, cioè di ingegnerizzare il follicolo ovarico nel tentativo di ricreare in

vitro un sistema che riesca a funzionare allo stesso modo in cui

funziona l’ovario all’interno del corpo della donna. Il tentativo di

ingegnerizzare gli organi è una questione che sta avendo grande

sviluppo in tutto il mondo, non solo per l’ovario, ma soprattutto

per organi con importanza maggiore come valvole cardiache

artificiali o derivate da altri sistemi, da altri modelli animali; noto

è anche il tentativo di decellularizzare un organo e mantenere la

sua struttura per poi ripopolarlo in vitro cercando di correggere

alcuni difetti oppure ricostituire l’organo stesso. Sono stati fatti

tanti lavori su altri organi. Ciò che è stato fatto riguardo l’ovario è

ancora poco, ma si ci sta già muovendo in questa direzione e l’

obiettivo è ancora lontano da raggiungere perché tanti sono

ancora gli aspetti che vanno studiati approfonditamente. Tre di questi aspetti sono segnati nell’immagine in

alto:

-Aspetti dell’ambiente della maturazione del follicolo. Bisogna studiare ciò che avviene in vivo per poi

riprodurlo in vitro.

-Aspetti molecolari e morfologici della maturazione del follicolo stesso.

-Marcatori della competenza allo sviluppo dell’oocita. Oltre ad avere creato un ambiente idoneo, bisogna poi

valutare se ciò che cresce all’interno è paragonabile a ciò che è prodotto naturalmente. Per cui per ogni

momento di maturazione del follicolo ovarico all’interno di un organo artificiale, è importante monitorare la

crescita dei follicoli ovarici considerando dei marcatori che valutino passo per passo la qualità del follicolo che

si sta coltivando. Su questa ultima parte verte

la ricerca raccontata in questo seminario.

Il follicolo ovarico si trova all’interno dell’ovaio

e ad oggi è possibile coltivarlo in vari modi. Il

più diffuso da anni è quello di coltivare il

follicolo estratto dall’ovario su una piastra petri

di due dimensioni. Si parla di due dimensioni

perché nel momento in cui il follicolo viene

poggiato su una superficie piatta di plastica,

questo si appiattisce, si allarga aderendo alla

plastica della petri e poi perde quella sua

tridimensionalità specifica che ha all’interno 1

dell’ovaio diventando più una struttura tridimensionale. E’ una tipologia di coltura che ha portato a tantissimi

risultati positivi per quanto riguarda la maturazione dei gameti all’interno del follicolo, ottenimento di

cuccioli, ecc.. Tuttavia, proprio perché è un sistema di coltura che non permette la riproduzione di ciò che in

natura avviene, cioè l’ottenimento della sua struttura tridimensionale, negli ultimi 10 anni circa, si sta

sostituendo con altri metodi di coltura che prevedono invece il mantenimento della struttura tridimensionale

del follicolo ovarico. Ci si riferisce in questo caso alla coltura in scaffold o in gel e matrici dove vengono inseriti

i follicoli ovarici. Questi vengono isolati dall’ovario e circondati da questa matrice di biomateriali o inseriti in

particolari gel sempre di biomateriali e questi riescono a mantenere la loro struttura tridimensionale proprio

perché è come se fossero sospesi all’interno di questa matrice elastica che permette comunque i movimenti e

la crescita del follicolo evitando l’appiattimento detto prima. In fine, un gruppo in particolare, è riuscito a

tentare di ricreare l’organo stesso in vitro basandosi su una coltura di follicoli che sono stati inseriti all’interno

di uno scaffold, cioè una struttura ricreata artificialmente

probabilmente con una stampante 3D. All’interno sono stati fatti

crescere dei follicoli (che nell’immagine a colori a sinistra si vedono in

verde) e anche la componente somatica di cellule follicolari presenti

all’interno dell’ovaio. E’ importante infatti che la maggior parte delle

componenti cellulari presenti all’interno dell’ovario, vengano fatte

crescere contemporaneamente all’interno della stessa struttura. Si possono notare le cellule follicolari che

hanno proliferato attorno ai follicoli che sono stati inseriti in questo scaffold. Addirittura sono riusciti a far

maturare alcuni di questi follicoli in questo ovario. Quindi, sebbene sia un percorso piuttosto lungo, alcuni

sono riusciti a ricreare non un vero e proprio ovario per intero, però una struttura che potrebbe avvicinarsi,

non solo come struttura, ma anche come funzione, perché la cosa più importante è quella di ricreare la

funzionalità ovarica. Argomenti di questo seminario:

OOCITA E FOLLICOLOGENESI: Sono stati isolati dall’ovaio di una topolina degli oociti, murini, antrali. Questi

sono stati liberati dalla componente somatica che li circonda, ovvero dallo strato di cellule follicolari che

solitamente sta intorno ad essi. Questa unità funzionale viene tolta, perché si ci concentra solo sullo studio del

gamete femminile. Quindi per questo studio, quotidianamente bisogna isolare l'oocita e pulirlo dalle cellule

follicolari con un semplice gesto meccanico, con una pipetta tirata a mano e utilizzata con il controllo della

bocca per cercare di pulire gli oociti dalla componente somatica. A questo stadio è molto facile farlo, per stadi

precedenti a questo diventa molto più difficile perché le cellule somatiche sono strettamente adese al

gamete.

L’oocita è la cellula germinale femminile che si trova nell’ovaio, e forma una struttura molto importante che si

chiama follicolo ovarico. E’ una cellula caratteristica che si discosta da tutte le cellule somatiche che troviamo

nel nostro corpo perché ha caratteristiche peculiari quali: la grande quantità di citoplasma al suo interno,

soprattutto per sostenere i primi momenti dello sviluppo dell’embrione una volta che viene fecondata. Inoltre

ha una zona pellucida, che è una membrana lipoproteica (in più rispetto alla semplice membrana cellulare che

2

tutte le cellule presentano) ed è molto

importante sia per la protezione di questa

cellula molto delicata e poi per altre

funzione come ad esempio nel momento

della fecondazione.

Il nucleo dell’oocita è chiamato vescicola

germinale e si presenta con una

morfologia caratteristica fino al momento

in cui l’oocita riprende la meiosi. In basso

si può vedere una sezione istologica di

ovario sempre di topo, nella quale si

possono individuare tutti gli stadi della

follicologenesi. Si parte dallo stadio

primordiale in cui un oocita primordiale è

circondato da un singolo strato di cellule

follicolari appiattite. Questo primo stadio

di sviluppo del follicolo all’interno

dell’ovaio seguirà una crescita ed uno sviluppo non solo del gamete stesso. Il gamete dovrà acquisire una

certa struttura ed accumulare una serie di proteine, di RNA

e dovrà crescere in volume; ma non sarà solo una crescita

ed una acquisizione di competenza da parte del gamete,

sarà anche una strutturazione delle cellule follicolari che lo

circondano, perché anch’esse dovranno acquisire delle

proprietà a livello di produzione di certi ormoni che aiutano

il follicolo stesso durante la maturazione. Quindi si può

vedere come si complica la struttura del follicolo stesso

rispetto ai primi stadi. In fine lo stadio antrale è quello un

po’ più complesso e più maturo che si trova all’interno

dell’ovario e si può notare come l’oocita (che ormai ha

raggiunto la sua massima dimensione in diametro), rimane

circondato da uno stretto strato di cellule follicolari che

prendono il nome di “cellule del cumulo” ed è circondato

da un antro (una cavità) ricco di fluido follicolare che ad un

certo punto durante l’ovulazione si aprirà, scoppierà e permetterà al follicolo con le cellule del cumulo intorno

di venire ovulato. In un ingrandimento dello stadio antrale si può vedere che le cellule del cumulo sono

strettamente adese e connesse con il gamete e questo è un aspetto importantissimo poiché costantemente

fra le due componenti, somatica e germinale, avviene una comunicazione bidirezionale che da una parte

permette la corretta maturazione dell’oocita e dall’altra permette il corretto sviluppo della struttura del

cumulo. Questa è l’unità funzionale che si riesce a prelevare dall’ovario delle topoline. Può essere utilizzato

come unità intera (unita) e quindi può essere coltivata in laboratorio con questo aspetto e quindi senza

andare a dividere le due componenti, oppure si possono dividere meccanicamente (metodo utilizzato anche

dalla dott.ssa Belli) la componente somatica dalla componente germinale, e le analisi (come quelle per andare

a cercare marcatori della competenza allo sviluppo) possono essere fatte contemporaneamente sulle due

componenti cellulari. La lezione di oggi approfondirà la ricerca dei marcatori della competenza dello sviluppo

sull’oocita, il prossimo seminario approfondirà le analisi che possono essere condotte sulla componente

somatica. 3

PERCHE’ COLTIVARE IN VITRO? : Solitamente alla base di molte tipologie di ricerca c’è un problema medico ed

in questo caso il problema medico è l’infertilità. L’infertilità di per sé è una patologia abbastanza comune

perché riguarda circa il 15% delle coppie nel mondo. Oltre a questo 15% vi è poi una categoria di donne (da

bambine a donne che hanno già superato la loro età fertile), che sono circa 1milione negli Stati Uniti e

100.000 in Italia o in Inghilterra, che vengono sottoposte a trattamenti molto aggressivi contro il cancro, come

chemio e radioterapia, magari non in modo specifico diretti contro il cancro al sistema riproduttivo femminile,

ma contro il cancro in generale. In seguito a queste terapie, circa 1/3 di queste donne (100.000 negli Stati

Uniti e 30.000 in Italia), sviluppano un precoce decadimento della funzione ovarica. Proprio perché molte di

queste donne sono ancora in età fertile, potrebbero volere intraprendere delle gravidanze finite queste

terapie. Nel momento in cui però la loro funzione ovarica risulta essere danneggiata, la gravidanza può non

essere possibile. E’ proprio in previsione di questa possibilità, è molto importante riuscire a mettere a punto

un sistema, che possa coltivare in vitro quei gameti che prima della terapia vengono estratti dall’ovaio di

queste pazienti , e conservati fino ad un momento più idoneo per intraprendere una gravidanza. Si possono

prelevare gli oociti ad un punto di maturazione variabile: follicoli primordiali o primari, oppure il gamete allo

stadio più maturo, quindi stadio antrale, che viene fatto maturare in vitro e che può essere conservato in

questo preciso momento. Nel momento in cui però vengono isolati dalla paziente degli stadi abbastanza

precoci di sviluppo del follicolo, serve un sistema che da questo stadio precoce permetta in vitro di farlo

arrivare fino alla forma matura ed è qui che si sta cercando di lavorare per ricreare l’organo artificiale.

Sarebbe molto importante perché riuscendo a ricostruire tutto questo percorso, le pazienti potrebbero avere

più possibilità perché se si isolano gameti allo stadio maturativo finale, i numeri sono leggermente più basi;

mentre prelevando stadi più precoci, si potrebbero prelevare più gameti e quindi avere più possibilità magari

anche per più di una gravidanza. Sono due gli aspetti principali su cui bisogna continuare ad indagare: da una

parte sui materiali che andranno a costruire la struttura su cui si potrà coltivare in vitro i gameti e quindi tutta

quella ricerca che riguarda i biomateriali e come far crescere l’ovario all’interno di questi biomateriali

(argomento trattato nel seminario successivo); dall’altra parte, ricerca dei marcatori della qualità dell’oocita

che permettono di seguire in ogni momento della maturazione in vitro, la qualità della cellula che sto facendo

maturare e crescere e quindi capire dall’inizio alla fine se quella che si sta osservando e facendo crescere, è

una cellula paragonabile a quella che naturalmente matura all’interno dell’ovaio. Questa è una cosa molto

importante perché se alla fine si dovesse capire che la cellula a qualche problema (ad esempio non esprime gli

stessi geni e proteine che un oocita normale dovrebbe esprimere), significa che durante il processo

maturativo in vitro, è successo qualcosa che non ha permesso alla cellula di maturare nel modo giusto.

Bisogna essere sicuri di ciò che si utilizza per dare origine ad un eventuale embrione. E’ in quest’ottica che si

inserisce il lavoro di dottorato della dott.ssa Belli.

MARCATORI MOLECOLARI DELLA COMPETENZA DELLO SVILUPPO DELL’OOCITA: In una prima parte si parlerà

dei marcatori molecolari della competenza allo sviluppo, ossia la ricerca che indaga su cosa l’oocita

molecolarmente produce e quindi come si caratterizza molecolarmente. Lo sviluppo applicativo, di cui prima

si parlava prima, è molto lontano da raggiungere, ma durante tutto il percorso si scoprono cose importanti

anche per un ambito di ricerca di base, quindi volta a cercare di capire come funziona l’ovario, come si

caratterizza il gamete. Quindi c’è sempre questo duplice scopo: ricerca in ambito più applicativo e soprattutto

ricerca nel campo della biologia dello sviluppo.

Guardando gli oociti murini allo stadio antrale isolati dall’ovario, sembrerebbero ad occhio nudo senza tante

differenze fra loro. All’interno dell’ovario (in questo caso di topo), esistono però due tipi di oociti. Questi sono

riconoscibili se si colorano con un particolare fluorocromo che si chiama Hoechst 3342. Gli oociti si colorano

immergendoli all’interno di una soluzione, un mezzo di coltura, nella quale è stato disciolto ad una particolare

concentrazione il fluorocromo; gli oociti rimangono incubati al suo interno per un tot di minuti al buio. Poi si

riesce a visualizzare il fluorocromo che si è inserito in particolari regioni del DNA, esponendo gli oociti alla luce

4

UV. Questo fluorocromo è una sostanza vitale per l’oocita se viene utilizzato entro un range di concentrazioni

(troppo concentrato sarebbe mortale per gli oociti, se invece viene utilizzata la giusta concentrazione, il

fluorocromo permette di colorare e di distinguere fra le due categorie di oociti, asciandoli in vita).

Colorati gli oociti,

guardandoli con luce UV

per osservare la cromatina,

si riescono a vedere

2conformazioni diverse

all’interno del nucleo. Nel

momento in cui si riesce a

vedere un anello di

eterocromatina che si

dispone attorno al

nucleolo dell’oocita

(nell’immagine a destra

quello tratteggiato in

bianco è il nucleo) e poi

pochi spot dispersi

all’interno del nucleo, si è

davanti ad un oocita che

viene definito “Surrounded

Nucleolus”, proprio per la forma che ci circonda il nucleolo dell’eterocromatina e si abbrevia con SN. Se invece

non si vede quel tipico anello e siamo davanti ad una conformazione che vede degli spot molto forti di

eterocromatina all’interno del nucleo, immersi in una nuvola di cromatina un po’ più lassa che si trova

all’interno di tutta l’area nucleare, siamo davanti alla struttura definita “Non Surrounded Nucleolus” che si

abbrevierà come NSN. Sono due strutture che caratteristiche che si ritrovano sempre all’interno dell’ovaio di

topo. Questa non è l’unica e principale differenza che contraddistingue queste due categorie di oociti! Infatti

la differenza più importante, è quella che se si fa la fecondazione in vitro e quindi si mettono in contatto con

gli spermatozoi in laboratorio, gli NSN verranno fecondati, ma si fermeranno allo stadio di due cellule durante

lo sviluppo sempre in vitro pre-impianto dell’embrione (ossia raggiungono lo stadio di due cellule e poi non

riescono ad andare oltre). Gli oociti SN, invece, se fecondati in vitro, riescono a proseguire anche oltre lo

stadio di due cellule di sviluppo pre-impianto e danno origine alla blastocisti. Per questa grande differenza di

capacità di portare a termine lo sviluppo embrionale pre-impianto in vitro, gli oociti NSN vengono detti non

competenti allo sviluppo (perché si interrompono allo stadio di due cellule), mentre gli oociti SN, poiché

riescono ad arrivare allo stadio di blastocisti, vengono definiti competenti allo sviluppo. Gli NSN avranno

sicuramente qualcosa di diverso rispetto agli SN che impedisce loro di funzionare da gamete competente che

darà origine ad un individuo successivamente.

Sono state individuate altre strutture della cromatina che non rispecchiano proprio la presenza di un anello o

degli spot, ma vi sono delle strutture intermedie ben caratterizzate anche in altre specie e legate sempre alla

competenza allo sviluppo dell’oocita. Fra queste specie ci sono anche l’uomo, il bovino, il ratto, scimmia e

maiale, specie che vengono analizzate in laboratorio, ma anche specie di grande interesse sia medico (per

quello che riguarda l’uomo), che veterinario (il bovino infatti è un modello molto utilizzato soprattutto per le

applicazioni che in campo veterinario e zootecnico ha).

La pluripotenza è la capacità che alcune cellule hanno di differenziarsi nei tre foglietti embrionali. Questo

concetto è importante perché nel momento in cui si analizza l’oocita, una cosa che suscita particolare

interesse, è il fatto che dall’unione dell’oocita e dello spermatozoo, si ottiene prima uno zigote e poi un

5

embrione. Alcune cellule dell’embrione hanno questa caratteristica di pluripotenza: ossia hanno la capacità di

dare origine a tutti e tre i foglietti embrionali che si formeranno successivamente. La pluripotenza è una

capacità che loro hanno intrinseca e che deve per forza venire dalle cellule che lo formano, ossia o dall’oocita

o dallo spermatozoo, che unendosi daranno origine allo zigote e poi all’embrione stesso. E’ importante

indagare sulle basi di questa pluripotenza, da dove arriva. E’ molto interessante perché probabilmente

qualcosa della pluripotenza è racchiuso nell’oocita, qualche informazione che apparterrà alle cellule

pluripotenti dell’embrione, precedentemente sarà appartenuto all’oocita stesso (quindi verrà dato

all’embrione dall’oocita). Una cosa molto interessante è un gene, coinvolto nel controllo della replicazione

delle proteine, questo gene è Oct4.

Oct4 è un fattore di trascrizione implicato nel mantenimento della pluripotenza ed è espresso in alcune cellule

come: le Primordial Germ Cells, spermatogoni, oogoni, cellule della massa cellulare interna e cellule

embrionali staminali. Questo gene è ancora più interessante perché oltre a regolare la pluripotenza nelle

cellule embrionali staminali, è stato visto essere operativo all’interno delle cellule uovo. Per cui nella ricerca

del nesso di cui si parlava prima, probabilmente Oct4 può dare qualche informazione su cosa della

pluripotenza che troviamo all’interno dell’embrione, deriva dall’oocita stesso. L’espressione di Oct4 risulta

essere presente anche negli oociti, tuttavia non in tutti. Dal momento in cui i follicoli vengono reclutati per la

maturazione, l’espressione di Oct4 risulta essere presente negli oociti competenti allo sviluppo, quindi negli

SN, ed è down-regolato negli oociti non competenti allo sviluppo NSN. Questa diversa espressione è

mantenuta fino allo stadio di metafase2, quindi ad oocita

completamente maturo. Le cose appena descritte, sono

rappresentate nel pannello ad immunofluorescenza riportato in

basso a sinistra. Vi sono oociti a partire da piccolo diametro (10-

20µm circa fino al più grande che si trova nell’ovaio (71-80 µm di

)

diametro). Troviamo l’oocita maturato (che ha ripreso meiosi ed

espulso globulo polare) derivati da oociti NSN e da oociti SN. Nella

striscia centrale troviamo l’espressione della proteina Oct4. La

cosa caratteristica è che a partire dallo stadio di 41-50 µm, ossia

dallo stadio in cui i follicoli vengono reclutati per la maturazione,

l’espressione di Oct4 risulta essere down-regolata negli oociti non

competenti e invece risulta essere ancora presente negli oociti

competenti. Il fatto che non si vedano nel pannello oociti SN ai

primi stadi di sviluppo del follicolo all’interno dell’ovaio (spazio

bianco), è perché in questi primissimi stadi non è possibile

6

individuare la conformazione SN della cromatina all’interno del nucleo. Per cui nei primissimi stadi di sviluppo,

l’oocita all’interno del follicolo, presenta esclusivamente la conformazione NSN. A partire invece dallo stadio

di 41-50 µm di diametro, riusciamo ad individuare in percentuali diverse, entrambe le conformazioni della

cromatina. Tutti gli oociti partono NSN e poi pian pianino alcuni cambiano la loro conformazione della

cromatina in SN. Oct4 che è sia da una parte probabilmente implicato nel conferimento della pluripotenza

all’embrione che dall’altra probabilmente implicato nel conferire la competenza allo sviluppo dell’oocita,

probabilmente non agisce da solo, perché è un compito abbastanza grande per un singolo gene.

Probabilmente Oct4 agisce in concomitanza con tanti altri geni e lui è il principale attore protagonista e riesce

in qualche modo a regolare o ad agire insieme a tanti altri geni. Ed è da qui che nata l’ipotesi della presenza di

un Transcriptional Network che agisce insieme al gene Oct4. Per indagare sulla presenza effettiva di questo

Transcriptional Network, il laboratorio della dott.ssa Belli prima del suo arrivo, era andato a confrontare il

trascrittoma di oociti competenti e non competenti allo sviluppo, per vedere se all’interno di queste due

categorie Oct4 agisse da solo o insieme ad altri geni. Qui comincia il grande lavoro di collaborazione con

ingegneri bioinformatici soprattutto dell’università di Pavia, ma queste collaborazioni si sono estese anche ad

altri laboratori nel mondo. Per indagare sul network in

questione sono state utilizzate sia tecniche prettamente

biologiche (come PCR ed immunofluorescenza), sia strumenti

bioinformatici per andare ad analizzare la grande mole di dati

emersi da studi di microarrays. L’output del microarray del

trascrittoma di un dato tipo cellulare, presenta un’infinità di

dati perché vengono analizzati un numero enorme di geni.

Questi dati devono essere studiati e analizzati e quindi è

necessario individuare dei metodi che guidino verso

l’interpretazione di cose analizzabili anche dalla mente

umana. Le analisi eseguite sono state: analisi di espressione genica, analisi di enrichment GO e generazione di

Network che andassero a vedere come i geni interagiscono fra loro. Schema per riportare alla mente come

possono funziona i microarrays:

Guardando l’immagine, possiamo considerare che i Sample1 siano i nostri oociti non competenti e i Sample2

siano invece quelli competenti. Dopo avere raccolto un gran numero di oociti per poter effettuare queste

analisi, è stato estratto l’RNA dai due campioni ed è stata fatta analisi del trascrittoma, ossia solo dei geni che

vengono espressi da questi due tipi di oociti. L’RNA, trasformato successivamente in cDNA, è stato dapprima

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colorato e poi fatto ibridare su delle probes di DNA in modo da farlo appaiare, almeno le sequenze geniche

che si trovano all’interno delle cellule. Quando queste vengono colpite da una laser, emettono un segnale

grazie al precedente passaggio di colorazione e quindi si riesce ad individuare quali geni vengono espressi o

non espressi dalle due categorie di cellule. Viene mostrato il chip relativo agli SN e quello relativo agli NSN; se

questi vengono sovrapposti, posso vedere quali sono i geni espressi solamente da una popolazione che avrà

colore verde o solamente dall’altra che avrà colore rosso. I geni espressi da entrambe, avrà una colorazione

intermedia data dalla sovrapposizione dei due colori e in questo caso sarà giallo. Si riesce anche a capire in

che quantità questi geni vengono espressi. L’output di analisi di microarrays è un enorme file Excell, in cui

vengono indicate tutte le sequenza geniche presenti all’interno del chip e le informazioni che ottengo sono

dalle più semplici, come l’individuazione del gene che si sta analizzato e la comprensione con un’indicazione

statistica, se effettivamente il gene di interesse è più o meno espresso (quindi up o down regolato) rispetto al

campione di riferimento che si prende in considerazione. Quindi avendo due campioni a disposizione, uno so

tiene come campione di riferimento su cui si calcola l’up o la down regolazione dei geni di interesse rispetto

all’altro campione. Alcune informazioni possono essere facilmente estrapolate da questi files, per altre

informazioni, è necessario chiedere aiuto a bioinformatici che con tools particolari, riescono ad indirizzare la

ricerca in un modo più mirato e meno dispersivo. Il passo successivo è stato quello di analizzare e andare a

trovare dei processi biologici a cui potessero appartenere i genie e i dati ritenuti interessanti e per interessanti

si intende: up o down regolati rispetto ala campione di riferimento. Quindi ad esempio: 40.000geni e

sequenze sono stati analizzati e solo

380 su 40.000 sono risultati

diversamente espressi in un

campione rispetto a quello di

riferimento. In particolare l’analisi

permette di vedere quali sono up e

quali sono down regolati. In questo

caso il campione di riferimento è

stato la metafase due di controllo,

ossia l’oocita ovulato naturalmente

dalla topolina, per cui per natura si sa

essere competente e l’analisi invece è

stata fatta sulla metafase due

derivata dall’oocita non competente,

quindi la metafase2 NSN. Si è visto

come i geni up e down regolati

fossero espressi diversamente negli

oociti non competenti rispetto al

controllo. I geni diversamente

espressi sono stati sotto-categorizzati all’interno di target individuati in processi biologici e all’interno di essi,

considerando il metabolismo ad esempio, si può vedere quali sono gli up- e i down- regolati e capire se un

certo numero di geni può avere effettivamente un ruolo importante all’interno del processo biologico poiché

espressi negli oociti competenti ed invece down regolati in quelli non competenti. E’ tutto un tentativo di

rendere più analizzabile una serie di dati numerosi e difficili da interpretare contemporaneamente. Un altro è

esempio è quello di ricreare dei Network di geni che lavorassero insieme all’interno dei processi biologici

individuati, perché ad esempio all’interno di un processo possono essere individuati 5 geni, ma non tutti

interagiscono. Nella rappresentazione che segue, in un processo biologico ci sono ad esempio 7pallini che

indicano 7geni diversi che interagiscono fra loro, ma possiamo vedere anche che in qualche caso non tutti

sono collegati da una linea e ciò indica che non tutti interagiscono fra loro oppure possono interagire tutti fra

loro. Questo ci da un’idea di come e quanto sia complesso un Network canalizzato e quali potrebbero essere

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le interazioni fra i geni che lo compongono. Questi sono tutti esempi di

analisi che possono essere fatte, che permettono da un ampio numero di

geni, di arrivare ad un numero di geni più abbordabile da essere

considerato e studiato più nel dettaglio. Infatti lo staff della dott.ssa Belli,

è arrivato ad una trentina di geni, che sono regolati dal gene Oct4. Ed è

da qui che è iniziato il lavoro della dott.ssa Belli.

Sono stati studiati questi 30geni, studiando la letteratura e cercando di

capire se potessero essere coinvolti in aspetti quali la follicologenesi,

l’oogenesi, nel gamete, nell’embrione, cercando di correlare questi geni a

parole chiave che facessero parte della ricerca in questione, arrivando

alla fine ad individuare 5 geni interessanti che sono cerchiati

nell’immagine a

destra. Su questi

geni sono state fatte delle analisi più dettagliate di

espressione genica e proteica. Sono stati analizzati

ovviamente insieme al protagonista Oct4 e ad altri due

geni oociti specifici quali Nobox e Bmp15 (noto per avere

una funzione molto importante all’interno del gamete e

durante la follicologenesi). Da qui inizia il capitolo

sull’analisi dei Marcatori molecolari della competenza

allo sviluppo dell’oocita.

Riuscire a dividere la componente somatica da quella

germinale, è possibile farlo in modo meccanico molto semplice, allo stadio antrale del follicolo. Per questa

analisi invece è stato necessario farlo a partire dallo stadio più primordiale e via di seguito per tutti gli stadi.

Per tutti questi stadi fino a prima dello stadio antrale, è stato applicato un complesso protocollo di

disgregazione delle due componenti, perché meccanicamente (con la pipetta descritta precedentemente), è

impossibile farlo perché le dimensioni sono veramente troppo strette fra loro. E’ stato usato un protocollo che

unisce l’azione meccanica all’utilizzo di enzimi, quali ad esempio la collagenasi, per disgregare queste

giunzioni fra oocita e cellule follicolari. Di seguito vi è la tabella con il protocollo utilizzato:

E’ un protocollo sperimentale molto lungo, perché per ottenere i campioni da utilizzare con PCR real time e

con immunofluorescenza, sono stati impiegati più di sei mesi. Questo perché gli oociti sono cellule molto

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delicate e difficili da recuperare, soprattutto perché per ogni esperimento, i numeri sono veramente esigui.

Niente di tutto ciò è paragonabile al lavoro con cellule in coltura. Per isolare tutte le categorie di oociti

necessarie, è stato necessario molto tempo. Sono stati raccolti un tot di oociti per classe di diametro (visibili in

tabella) e a partire dalla classe 41-50, troviamo le due categorie di oociti competenti e non competenti. Per

cui la raccolta è stata ulteriormente suddivisa in oociti competenti e non competenti (che sono stati tenuti

separati per indagare se la presenza di questi geni cambiasse non solo durante la follicologenesi ma anche

all’interno delle due categorie di oociti). Una parte è stata raccolta per analisi con PCR real time (per un’analisi

di espressione genica) ed una parte è stata raccolta per analisi di espressione proteica con

immunofluorescenza. Viene riportata una tabella con i risultati dell’analisi di espressione genica:

In nero si vede l’espressione negli oociti non competenti allo sviluppo, in bianco l’espressione genica degli

oociti competenti allo sviluppo e in grigio c’è il controllo che è sempre l’espressione genica negli oociti ovulati

(che per definizione sono competenti allo sviluppo perché si presuppone che quello che una topolina ovuli, sia

quello che ha tutte le capacità di essere fecondato e dare origine ad un nuovo individuo). Nel nostro modello

gli oociti SN dovrebbero ripercorre le caratteristiche degli oociti ovulati del nostro controllo, mentre gli oociti

NSN del nostro modello dovrebbero avere qualcosa in meno rispetto agli oociti competenti e quindi essere

più immaturi o comunque diversi. Ed effettivamente

questo è ciò che emerge anche nell’analisi di questi

8 geni che sono stati individuati come interessanti.

Per 4 di questi 8 geni si sono individuate delle

differenze significative per quanto riguarda

l’espressione durante la follicologenesi (dalla classe

più piccola fino alla classe più grande e alle metafasi

2) fra gli oociti competenti e non competenti.

Nell’immagine a sinistra le freccine (verdi) indicano

le differenze statisticamente significative.

Solitamente gli SN sono quelli che più si comportano

come il controllo ovulato. Dove sono state

individuate delle differenze significative, per questi 4

particolari geni, si è cecato di vedere se anche a

livello di espressione proteica, questa differenza

fosse mantenuta perché poi è la proteina quella che

effettivamente svolge la funzione. Quindi partendo

dal gene Nobox, si indaga sulla funzione della

rispettiva proteina. La stessa analisi è stata fatta

anche per gli altri tre geni, ma Nobox ha mostrato i risultati più interessanti.

Nobox è un fattore di trascrizione come Oct4, ed ha un ruolo molto importante durante la follicologenesi. I

topi che non esprimono Nobox (knock-out per Nobox) presentano una precoce interruzione della

follicologenesi. All’interno dell’ovaio si vedono spesso follicoli vuoti, oociti degenerati e lo sviluppo del

follicolo non va oltre lo stadio primordiale. Inoltre sempre in questi topi, molti geni fra i quali Oct4, risultano

essere down regolati; proprio perché si è visto che Oct4 era uno di questi geni, è stata studiata la possibilità

che Nobox avesse un ruolo regolatorio sull’espressione di Oct4. Infatti è stato visto che Nobox ha un’elevata

affinità di legame per il promotore del gene Oct4 e ciò indica un’azione congiunta di questi due geni. La cosa

che non era ancora stata studiata fino a quel momento, era l’espressione di Nobox durante la follicologenesi.

10

E’ mostrato un pannello di immunofluorescenza in cui gli oociti competenti e non competenti, mostrano

l’espressione del fattore di trascrizione Nobox all’interno del

nucleo. A partire in questo caso dalla classe 61-70, gli oociti non

competenti continuano a mantenere alta l’espressione di Nobox

all’interno del nucleo, mentre gli oociti competenti, down

regolano l’espressione di Nobox fino a non essere quasi

completamente rilevabile a livello di metafase 2.

Questi descritti sono i comportamenti più frequenti, ma non sono

da eliminare certe considerazioni su segnali individuati meno

frequentemente. In biologia non è tutto bianco e nero, ma ci sono

certe sfumature che possono risultare interessanti se indagate.

Ad esempio è stata vista una diversa espressione (rispetto al

pannello a destra) degli oociti competenti e non competenti che

si può ritrovare nella classe41-50; oppure a livello della classe 61-

70 sono state individuate delle figure particolarmente

interessanti che si vanno a caratterizzare come oociti intermedi

fra gli oociti competenti e non competenti. Questi oociti

intermedi, hanno una struttura intermedia, non solo nella

cromatina (che sembra formare un anello come gli SN, ma in

realtà l’anello è formato da spot come gli NSN e non è neanche

del tutto completo), ma anche l’espressione di Nobox, è

intermedia fra la piena espressione degli oociti non competenti e

la quasi assenza di espressione degli oociti competenti. Quindi è

probabilmente una classe di oociti indipendente dagli SN e dagli NSN. Potrebbe anche essere una fase di

passaggio che NSN acquisiscono prima di diventare SN; questo rimane un capitolo da indagare. E’ stato anche

notato che negli SN, Nobox andava ad inserirsi con maggior segnale laddove la cromatina dell’anello era un

po’ più scarsa. Anche questo fenomeno non è stato indagato, ma essendo Nobox un fattore di trascrizione,

sicuramente ha un significato importante da qui potrebbe benissimo partire un altro filone di ricerca. Per

avere un’ulteriore conferma, è stato visto che gli oociti in metafase2 ovulati naturalmente dalla topolina,

esprimevano una quantità di proteine Nobox, paragonabile alla metafase2 degli SN, a conferma del fatto che

gli SN dovrebbero essere quelli che poi verranno ovulati dalla topolina. La conclusione è la seguente: Poiché

Nobox ha una netta differenza di espressione fra oociti competenti e non competenti, ci si è chiesto se questa

proteina potesse essere considerata come un marcatore della competenza allo sviluppo, dove per marcatore

si intende qualcosa che riesce in modo preciso ad individuare la buona o cattiva qualità del gamete preso in

considerazione. Dato che Nobox è espresso esclusivamente dagli oociti non competenti allo sviluppo, Nobox

si è rivelato essere un marcatore della non competenza allo sviluppo dell’oocita. Altri marcatori della

competenza erano stati precedentemente individuati in laboratorio come ad esempio Oct4. Un altro

marcatore è Stella. Oct4 e Stella hanno un comportamento opposto rispetto a Nobox perché sono espressi

negli oociti competenti e non espressi negli oociti non competenti. Una volta

individuate delle proteine che hanno comportamenti diversi all’interno delle due

categorie di oociti, si può pensare a diverse applicazioni.

Un conto è caratterizzare gli oociti come competenti o non competenti usando queste

proteine, un altro conto è usare l’architettura funzionale dell’ovario. Questo è un

capitolo ancora aperto ed è stato solo pensato come applicazione, sono solo ipotesi e

non sono ancora stati fatti esperimenti. Possiamo pensare ad un ovario di topo. Se lo

fissiamo ed includiamo in paraffina, è possibile tagliarlo in tante fettine successive

(come nell’immagine a destra) e colorarlo per vedere che tipologia di follicoli ci sono al

suo interno e dove si posizionano parzialmente. Ci sono delle tecnologie adesso, 11

soprattutto per quanto riguarda l’imaging, che permettono di ricostruire delle strutture tridimensionali, a

partire da una serie di immagini bidimensionali che si possono prendere da un organo, un tessuto e anche da

una singola cellula. Ovviamente più le immagini hanno alta risoluzione, più sono vicine spazialmente, più

l’informazione globale che può essere estrapolata da queste immagini, permetterà di ricreare una struttura

tridimensionale, effettivamente pertinente a ciò che si sta guardando. Ipotesi: Queste fettine sequenziali

possono essere colorate con immunofluorescenza su intera sezione (e non su singola cellula) e si usa il DAPI

per individuare i nuclei di follicoli competenti e non competenti. Si potrebbe riuscire ad individuare con i

marcatori già visti, i due tipi di oociti; ad esempio ipotizziamo che in rosso ci sia Oct4 e vada a colorare l’oocita

competente e che in verde Nobox, colori

invece l’oocita non competente. Se si riuscisse

ad avere questa colorazione su ogni fettina,

con queste nuove tecnologie si potrebbe

ricreare l’intero ovario, sapendo dove i follicoli

competenti e non competenti si posizionano al

suo interno. A questo punto si potrebbe capire

se la loro struttura e posizione all’interno

dell’ovario, ha un significato oppure no. La

maggior parte dei follicoli che si trovano

all’interno dell’ovario non verranno ovulati, ma la maggior parte è destinata magari a maturare all’interno

dell’ovario però ad un certo punto a bloccarsi e andare incontro ad atresia e quindi morire all’interno

dell’ovario. Tutte queste dinamiche non sono del tutto conosciute. Non si sa perché non tutti gli oociti

vengano ovulati e perché la maggior parte di loro non darà origine a nulla ed è importante studiarlo anche in

un’ottica di fertilità dell’individuo stesso. Quindi una possibile applicazione dei marcatori visti prima, potrebbe

essere quella di andare ad indagare la funzionalità dell’ovario stesso in quest’ottica. Da una parte questo

potrebbe essere interessante per conoscere ancora meglio la biologia dell’ovario (ricerca di base); dall’altra

parte si potrebbe considerare questa disposizione spaziale in un’ottica più applicativa perché se volessimo

effettivamente costruire in vitro una struttura funzionale come l’ovario, sarebbe molto importante

considerare questo aspetto (ricerca applicata). Riassunto:

Tutte le tecniche viste fino ad ora sono però tecniche invasive per l’oocita! Sia per l’analisi di espressione

genica, che per l’analisi di espressione proteica, la cellula viene comunque distrutta perché si va ad analizzare

cosa succede al suo interno (soprattutto per quanto riguarda l’immunofluorescenza, dove la cellula viene

fissata in un determinato momento e non è più in grado di maturare perché muore). Quindi queste tecniche

non solo eseguibili all’infuori di una realtà di laboratorio e sarebbe impossibile un’applicazione in campo

clinico; il gamete non potrebbe essere usato per essere fecondato e successivamente impiantato nell’utero di

una paziente. Per questo motivo da qui in avanti la dott.ssa Belli ha cambiato leggermente ricerca, cercando

12

di avvicinarsi alla ricerca di marcatori meno invasivi per il gamete e che potessero dunque avere una possibile

applicazione anche in clinica. Questi marcatori si possono definire: marcatori morfologici della competenza

dello sviluppo dell’oocita.

MARCATORI MORFOLOGICI DELLA COMPETENZA MEIOTICA E ALLO SVILUPPO DELL’OOCITA: L’importanza di

un marcatore è quella di essere attendibili e precisi, cioè non devono sbagliare nel fornire informazioni

riguardo al gamete che si sta analizzando e soprattutto non deve essere invasivo per la cellula che si sta

esaminando. Una tecnica che si sta rilevando molto utile a tal proposito è la tecnica del Time-Lapse Imaging,

una tecnica relativamente nuova che si utilizza da una decina di anni. Essa permette di raccogliere immagini di

oociti durante la loro maturazione in vitro, è come se si scattassero fotografie agli oociti mentre esse

maturano all’interno dell’incubatore. In generale la Time-Lapse Imaging e la successiva analisi delle immagini

che riesco ad ottenere, è importante perché permette di osservare in tempo reale le cellule che si stanno

facendo crescere e maturare. Ovviamente questa tecnica non è solo per gli oociti, ma si può applicare ad altri

campi visualizzando altre cellule in coltura. Una volta raccolte le immagini, è possibile analizzarle con

particolari software o algoritmi che permettono di estrapolare dalle immagini, delle caratteristiche che

l’occhio nudo non riesce a percepire. Un’altra possibile applicazione è quella di usare coloranti vitali come

potrebbe esse l’Hoechst che però in realtà vanno a legarsi a certi componenti cellulari (come membrana

nucleare, organelli, mitocondri, citoscheletro) e che danno modo di seguirli durante un certo periodo di

registrazione in modo da capire quali sono le dinamiche che avvengono all’interno della cellula. La dott.ssa

Belli in particolare, si occupa di coltivare gli oociti

antrali dentro un piccolo incubatore all’interno di uno

strumento chiamato Biostation, in cui si può

posizionare la piastrina Petri sopra la quale arriva una

telecamera. La telecamera viene controllata grazie ad

un software del computer collegato alla Biostation e

si può regolare l’inquadratura degli oociti,

l’esposizione alla luce (perché esistono vari filtri) e si

possono vedere con luce trasmessa o luce UV. Si può

decidere cosa osservare all’interno della cellula. Si

possono ad esempio osservare gli oociti a lue

trasmessa, quindi come se si osservassero all’interno di un microscopio, oppure dopo averli colorati con

Hoechst ad esempio, si può visualizzare la loro cromatina e quindi individuare in modo molto preciso la loro

competenza o non competenza allo sviluppo. Le immagini possono anche essere rielaborate in filmati. Il

filmato mostrato è sulla ripresa della meiosi degli oociti in coltura e si vedono dallo stadio della rottura delle

vescicola germinale fino all’espulsione del globulo polare. Alcuni hanno completato in modo corretto la

ripresa della meiosi e altri invece erano in ritardo oppure è successo qualcosa che ha impedito la ripresa del

globulo polare. La stessa cosa si può vedere a livello di struttura della cromatina. Il software utilizzato

permette anche di scegliere il fuoco della cellula scelta; si può anche decidere di prendere più piani focali in

considerazione e quindi imposto un fuoco superiore e un fuoco inferiore e una distanza in termini di

micrometri e un numero di fotografie che si possono prendere a diversi fuochi all’interno del massimo e del

minimo che è sono stati impostati. Per cui si fa uno Zstart della cellula in un determinato momento. Laddove è

stato osservato l’espulsione del globulo polare, è possibile vedere i cromosomi che si dividono in due: una

parte resta nella cellula e l’altra nel globulo polare.

Sono stati osservati con il time-lapse, i cambiamenti della cromatina durante la ripresa della meiosi. Sono stati

osservati dunque i fenomeni che avvengono dal momento in cui gli oociti allo stadio antrale presenti

nell’ovario fermi alla Profase1, riprendono la meiosi, espellono il primo globulo polare e arrivano allo stadio di

Metafase2. 13

Un esempio di ciò che è stato ottenuto si vede in basso. C’è sempre un confronto fra oociti competenti ed

oociti non competenti. E’ stato impostato, come periodo di fotografia, 8minuti di distanza (quindi ogni

8minuti un software automatizzato ha permesso di scattare una fotografia) per un periodo di 2 ore. Questo

perché di solito gli oociti murini hanno un periodo di maturazione che viene considerato di 15ore in vitro.

Dagli studi preliminari eseguiti per impostare questo set di esperimenti, è stato visto che la maggior parte

degli oociti, entro le prime 9 ore di maturazione riescono ad arrivare all’espulsione del globulo polare; per cui

sono state considerate 9 ore di registrazione su 15. Dal momento che ogni 8 minuti si è avuta esposizione a

luci UV, non era possibile riuscire ad esporre ogni 8 minuti per 9 ore gli oociti. Questo perché Hoechst è un

colorante vitale ma comunque dannoso per l’oocita ed inoltre l’esposizione all’UV è una fonte di stress

notevole. Le due cose congiunte fanno si che gli oociti resistano per un massimo di due ore; per questo

motivo le nove ore di registrazione sono state divise in sottoperiodi di due ore. Si vede un esempio in cui è

stato preso un solo oocita per ogni fascia registrata. La cosa interessante emersa da questo confronto è stata

una diversa configurazione della cromatina

nelle due categorie di oociti. Alcune

configurazioni, soprattutto le finali, sono

configurazioni standard, che si ritrovano

precisamente in entrambe le categorie (a

partire dalla formazione della piastra

metafasica in avanti). Soprattutto nella

prima parte invece, oociti SN ed oociti NSN,

mostravano diverse configurazioni della

cromatina; non solo nella presenza o

assenza dell’anello ma anche nel modo di

compattarsi nel momento in cui l’involucro

nucleare veniva a sfaldarsi. Negli SN è

presente questa massa di cromatina molto

compatta che non è mai stata osservata

negli oociti NSN. Inoltre ciò che si ci aspettava di vedere, ovvero la formazione dell’anello negli oociti NSN, in

realtà non è stata mai vista probabilmente perché questo passaggio in vitro gli NSN non riescono a farlo; i vivo

invece si, altrimenti non si spiegherebbe la presenza degli SN all’interno dell’ovaio. Inoltre è stata osservata

una diversa tempistica in cui oociti competenti e non competenti, arrivavano a diversi punti chiave della

ripresa della meiosi. Ci sono delle differenze statistiche proprio a livello delle tempistiche mostrando cioè

come gli oociti NSN fossero sempre un po’ in ritardo rispetto agli SN e quindi un po’ più immaturi anche nella

conclusione della maturazione del gamete stesso, rispetto agli oociti competenti. Date queste differenze sia

strutturali che di tempistica, sono stati individuati dei marcatori della competenza o non competenza allo

sviluppo degli oociti. Sono stati individuati questi differenti aspetti andando ad analizzare frame per frame, ciò

14

che accadeva all’interno della cellula durante la prima, la seconda, la terza.. sono 5 le fasi di due ore che sono

state analizzate. Lo stesso evento magari è presente ma traslato nel tempo negli oociti competenti e non

competenti. Questa diversità è stata mantenuta sempre durante tutto il periodo di maturazione. La cosa che

fino ad adesso è stata comunque utilizzata, è la presenza dell’Hoechst che è un colorante invasivo per la

cellula: sia perché se utilizzato in concentrazioni eccessive danneggia e fa morire la cellula, sia perché per

essere visualizzato richiede l’esposizione della cellula alla luce UV e sicuramente gli oociti estratti da una

paziente non possono essere visualizzati sotto luce UV e poi essere fecondati in vitro. Per cui rimangono

ancora tecniche invasive che non possono essere applicate in ambito clinico. E’ per questo che si è cercato

ancora di più di spostarsi verso un’applicazione clinica e di evitare di colorare gli oociti sia con Hoechst che

con qualsiasi altro colorante che potesse aiutare ad analizzarli. Quindi bisognava trovare altre caratteristiche

che potessero aiutare a distinguere gli oociti competenti da quelli non competenti.

Sempre con la tecnica di Time-Lapse, quella che risulta meno invasiva possibile, sono stati analizzati i

movimenti citoplasmatici e mitocondriali durante la maturazione dell’oocita.

Il Time-Lapse Imaging, è stato utilizzato per tantissime altre tipologie cellulari e tutti i software e algoritmi di

immagini che sono stati sviluppati in seguito all’applicazione di questa tecnica, sono nati addirittura non su

delle cellule. I primi algoritmi di immagini su scala di grigi, sono stati effettuati da degli ingegneri che hanno

preso proprio cataloghi di pezzettini di tessuto e hanno sviluppato un algoritmo in grado di dire che il tessuto

A fosse diverso dal tessuto B. Questo perché andavano a riconoscere la trama. Dai tessuti si è passati al

tessuto vegetale di una foglia, fino ad applicazioni proprio nel campo della biologia dello sviluppo in cui

tecniche di intelligenza artificiale sono state utilizzate per la classificazione sia di oociti che di embrioni. Per

quanto riguarda la classificazione dell’oocita, se si pensa di prendere anziché l’immagine di un tessuto, di

prendere l’immagine di un’ oocita in scala di grigio (che è quello che si ottiene dalla Biostation), se c’è un

algoritmo capace di distinguere due tessuti diversi, ci sarà anche un algoritmo capace di dirci che un oocita è

diverso da un altro. Ciò è utile perché guardando gli oociti ad occhio nudo non si riesce a distinguerli. La

selezione che adesso viene fatta nelle cliniche è

di questo tipo. Un operatore molto esperto che

da anni a solo questo mestiere, riesce a

guardare un’ oocita e a capire se è buono o

meno, ma sebbene l’esperienza si importante,

una selezione precisa non si può solo basare su

questo. Quindi si stanno sviluppando delle

tecniche che affianchino e non scavalchino, la

valutazione dell’operatore. Queste tecniche di

intelligenza artificiale estraggono i “Texture

descriptor”, che indicano la trama diversa delle

immagini che vengono sottoposte, permettendo

in un successivo momento di classificare oociti competenti e non competenti. Esistono tecniche utilizzate

proprio per la classificazione di immagini biomediche. Tutta questa parte è stata sviluppata fin qui in

collaborazione con bioingegneri dell’Università di Pavia. Sono stati sviluppati, anche sulla base di ciò che già

esisteva in natura, sistemi che segmentano l’immagine e quindi individuano ad esempio da un’immagine con

tre oociti, solo l’oocita di interesse che si vuole analizzare. Si effettua la ficture description con algoritmi e poi

è importante un sistema di classificazione che vada ad analizzare certi momenti interessanti e che sia in grado

di predire la competenza alo sviluppo degli oociti sulla base di quello che loro esprimono e che però non si

riesce ad individuare perché troppo intrinseco alla loro struttura.

Un altro esempio di applicazione del Time-Lapse Imaging, è negli embrioni. Si prendono delle immagini a

tempi fissi durante lo sviluppo pre-impianto dell’embrione per vedere se lo sviluppo avviene in modo

opportuno, sia per quanto riguarda la simmetria della divisione dei blastomeri, sia per quanto riguarda la

15

tempistica in cui avviene. In questo modo possono essere visti tutti i momenti e capire se ogni momento è

giusto sia per quanto riguarda la struttura che per quanto riguarda il tempo in cui vi è arrivato. Nel momento

in cui si individuano delle anomalie,

anche se il lent point è uguale, prima

le anomalie intermedie non si

vedevano e si possono così eliminare

gli embrioni che si sono divisi in modo

non del tutto regolare. Metodo di estrazione di caratteristiche dell’immagine dell’oocita utilizzato : Software

Cell_piv. Qui la collaborazione con i bioingegneri si è estesa al di la dell’Università di Pavia. Questo software è

in grado di rilevare spostamenti all’interno

della cellula tra un frame e l’altro (quindi ad

esempio dal tempo 0 al tempo di 8minuti, 16

minuti, se ci sono spostamenti di qualcosa

all’interno della cellula, questo software è in

grado di rilevarli).

Nel caso di questo lavoro, sono stati visti sia i

movimenti che avvengono all’interno del

citoplasma, sia i movimenti mitocondriali

nello specifico. Sono state prese immagini a

luce trasmessa e immagini a fluorescenza ad

una lunghezza d’onda di circa 490micrometri.

Il software in questione gira in MatLab e ha

tre tools diversi: PIV, PROCESS e VIEWER. Gli

output che questi tools forniscono sono: -un

grafico che mostra i movimenti avvenuti all’interno della cellula durante le 9ore di maturazione), -un video

che permette di capire cosa sono effettivamente questi movimenti, -una serie di dati grezzi di Excell che

permettono di analizzarli nel momento in cui vi sono tante cellule e si voglia vedere un comportamento medio

perché non si può analizzare ogni singolo oocita. L’autofluorescenza è stata utilizzata perché è possibile

visualizzare l’attività mitocondriale, solo esponendo gli oociti alla lunghezza d’onda detta prima; in questo

modo si può vedere la localizzazione dei mitocondri senza andare a colorare l’oocita. Cosa molto importante è

che con queste condizioni, pur non colorando l’oocita, si riescono a vedere anche i suoi mitocondri. Se si

colorano gli oociti con un colorante per i mitocondri, in questo caso la tetrametilrodoamina, il segnale che si

ottiene è paragonabile al segnale ottenuto con l’autofluorescenza. Nel grafico in basso si può vedere che la

presenza dei picchi corrisponde alla presenza

di freccine che sono dei vettori che

individuano il movimento effettuato da quel

particolare pixel da un frame all’altro. Dove

c’è il picco le freccine sono più grandi. Nella

scala di valori, più si avvicinano al rosa, più il

movimento è stato ampio sia per movimenti

citoplasmatici che per quelli mitocondriali. E’

un software molto semplice nell’utilizzo ma è

stato piuttosto complicato da creare.

Con i dati di excell è stato possibile

ricostruire un comportamento medio sulla

base delle analisi di un certo numero di oociti

che per i movimenti mitocondriali e i

movimenti citoplasmatici ha dato un certo

16

andamento. Durante le 9 ore di maturazione, si possono vedere grandi differenze nel comportamento delle

due categorie di oociti (guarda grafico). Sia per il movimento dei mitocondri, che per quelli del citoplasma, gli

NSN hanno spostamenti più veloci e più ampi rispetto agli SN (NSN in rosa- i punti più alti; SN in blu- i punti

più bassi). Pur avendo analizzato i punti statisticamente e avendo trovato delle macroregioni di differenza, la

collaborazione con un bioingegnere di Pavia, ha fatto notare come in realtà la caratteristica intrinseca

dell’oocita, sia relativa a tutto il percorso, non si può considerare solo una parte ma tutto il percorso dall’inizio

alla fine. Solo in questo modo si riescono ad individuare oociti competenti dai non competenti. Per trovare un

modo di automatizzare questo processo, il bioingegnere ha aiutato la dott.ssa Belli. Nel momento in cui si

analizza l’oocita per quelle due caratteristiche, se si ha l’andamento nel tempo, un particolare algoritmo può

riconoscerlo e dirci se si tratta di un SN o NSN. E’ stato creato allora un sistema che si chiama “Rete neurale”

che è un insieme di algoritmi che funzionano in questo modo: vengono “allenati” con una serie di indicazioni

note sia all’operatore che alla macchina; fatto ciò, la macchina sarà in grado di analizzare un’ oocita sulla base

di quanto appreso precedentemente, discriminando un SN da un NSN. E’ un sistema che si sta cercando di

sviluppare per automatizzare tutto questo processo e un domani in una clinica, nel momento in cui gli oociti

vengono prelevati da una paziente e messi a maturare, si potranno semplicemente prendere delle immagini

da analizzare prima con Cell_piv e poi con la Rete neurale, aiutando l’operatore nella scelta dell’oocita giusto,

aumentando la garanzia di ottenere un embrione. In questo modo è stato utilizzato un metodo

completamente non invasivo perché sono state fatte semplicemente delle fotografie alle cellule. Anche in

questo caso, analizzando differenze di movimenti citoplasmatici e mitocondriali, si è riusciti ad ottenere

marcatori che distinguessero gli oociti competenti da quelli non competenti. In questo caso i marcatori, se

non del tutto non invasivi, sono quasi non invasivi (perché si espongono le cellule semplicemente alla luce

trasmessa o alla luce fluorescente che è quella che forse da più problemi).

Riassumendo:

Per la ricerca del marcatore possono anche essere considerate le cellule follicolari che circondano l’oocita. In

questo modo non si considera l’oocita, si studia solo la componente somatica che lo circonda e l’oocita resta

nell’incubatore senza essere neanche fotografato. Nel prossimo seminario si parlerà se si può parlare di

follicolo competente allo sviluppo e non solo di oocita competente allo sviluppo. 17

Lezione del 29-10-2014

SVILUPPO DEL GAMETE MASCHILE

Il differenziamento della gonade indifferenziata è determinato

dall’espressione di SRY e dalla cascata molecolare che comporta la

sua attivazione grazie all’iniziale differenziamento delle cellule del

sertoli; ciò porta allo sviluppo dei cordoni sessuali che contengono

delle cellule germinali e le cellule del sertoli; esternamente a tali

cordoni compaiono le cellule del leyding che producono testosterone

e inducono il differenziamento della gonade in testicolo e del dotto

di Woolf nei derivati di cui abbiamo parlato.

sertoli producono l’ormone antimulleriano portando

Le cellule del

alla degenerazione del dotto di muller. della gonade che si va

Le cellule che si trovano all’interno

differenziando sono cellule staminali e sono dette

sono cellule che vanno incontro ad una notevole

prospermatogoni:

attività mitotica, ma ad un certo punto si arrestano ed entrano in una

fase di quiescenza equivalente ad uno stadio G0 (come lo stadio G0

che si trova nelle cellule somatiche) mentre, dopo la fase di

moltiplicazione cellulare le cellule germinali femminili entrano in

meiosi.

EMBRIONE-FETO

Nel feto si hanno gli embrioni

primitivi detti essi

pro-spermatogoni:

aumentano di numero, poi terminano

fino allo stadio pretuberale, quando

attraverso una serie di stimoli ormonali

viene indotta la maturazione delle

cellule germinali.

I prospermatogoni vanno incontro nuovamente a delle duplicazioni divenendo

spermatogoni As.

Gli si ritrovano durante la vita adulta ad uno stadio differenziativo più

spermatogoni As spermatogoni che all’interno del testicolo costituiscono le cellule

avanzato, sono però gli

staminali e andranno incontro ad una serie di divisioni, e quindi di moltiplicazioni nel

loro numero prima di entrare in meiosi.

Tali spermatogoni dal punto di vista morfologico possono essere classificati in vari

modi:

- spermatogoni A ,

- spermatogoni intermedi,

- tali spermatogoni in seguito ad una divisione diventeranno

spermatogoni B:

- tali spermatociti si divideranno due volte in

spermatociti:

- poi si hanno gli

spermatociti di I ordine e spermatociti di II ordine,

- cellule post-meiotiche che porteranno, grazie ad un processo di spermiogenesi o

spermatidi:

spermioistogenesi, alla formazione degli spermatozoi veri e propri con la caratteristica forma specie-specifica

degli spermatozoi.

Gli spermatozoi che escono dal testicolo non sono maturi, ma vanno incontro ad un processo di maturazione delle vie

genitali maschili, ma una volta eiaculati tali spermatozoi non saranno ancora in grado di fecondare gli oociti, ma nelle

specie a fecondazione interna ,come la nostra specie, attraversando le vie genitali femminili andranno incontro ad un

l’oocita e quindi saranno le vere

fenomeno detto di proprio perché verranno resi capaci di fecondare

capacitazione,

cellule in grado di fecondare.

I cordoni sessuali sono costituiti da una componente somatica rappresentata dalle e da una

cellule del sertoli

componente germinale rappresentata dagli da cui si formeranno i tubuli seminiferi che

spermatogoni primitivi

ritroveremo nel testicolo adulto. 1

GAMETOGENESI

La gametogenesi è il processo che porta alla formazione di una cellula

aploide a partire da una cellula diploide, in grado di avere la capacità

fecondante o di essere fecondata e dare origine ad un nuovo individuo.

Rete Nella spermatogenesi si generano gli spermatozoi e tutto ciò avviene

testis all’interno dei testicoli (gonadi).

M.albu La spermatogenesi è un processo molto efficace in termini di produzione

ginea di cellule, infatti quotidianamente, dalla pubertà fino alla morte

dell’individuo, anche se nell’uomo comunque si osserva una diminuzione

tubuli. della capacità riproduttiva, tuttavia gli spermatozoi sono prodotti fino alla

Semini morte dell’individuo stesso, i testicoli non vanno mai incontro ad atresia

semi così come avviene nell’ovario.

All’incirca un maschio della nostra specie ad ogni eiaculazione eiacula un

numero come 200 milioni di spermatozoi, anche se negli ultimi anni tale

numero si è abbassato, per cui oggi viene considerata comunque normale

testis una eiaculazione che arriva fino a 100 milioni di spermatozoi, numeri al

di sotto dei 100 milioni saranno una quantità di cellule non sufficienti a

fecondare.

Se si confronta c la gametogenesi maschile

e femminile si nota che ci sono delle

differenze fondamentali che si evidenziano

fin dalla vita fetale con la separazione di

due popolazioni:

1) una popolazione rappresentata dai

prospermatogoni che mantengono il loro carattere staminale e

l’altra

2) popolazione rappresentata dall’ ingresso in meiosi.

Dopo la nascita e con la pubertà il processo di formazione del gamete

femminile è detto mentre il processo di formazione del gamete

follicologenesi,

maschile è detto ma il prodotto finale differisce non solo

spermatogenesi,

ma anche quantitativamente, tant’è che

morfologicamente nella femmina da una

singola cellula che si trova in meiosi si originerà una sola cellula con la capacità

riproduttiva ; nel caso del maschio, invece, da una cellula in meiosi otterremo 4

spermatozoi maturi.

La differenza fondamentale in termini quantitativi sarà legata soprattutto al numero di mitosi che gli spermatogoni

faranno prima di entrare in meiosi; quindi la grande capacità riproduttiva nella spermatogenesi è legata alla presenza di

qualche decina di migliaia di spermatogoni , ed inoltre ogni singolo spermatogonio prima di entrare in meiosi va

incontro a tantissimi cicli mitotici, proprio per questo si producono un numero molto alto di cellule germinali.

Si hanno 4 cellule tutte con la stessa capacità fecondante ed una sola cellula uovo.

: in meiosi i cromosomi omologhi si appaiano attraverso una struttura proteica detta

Meiosi complesso sinaptinemale,

una volta avvenuto ciò si ha il crossing over, si forma la piastra metafisica e nella prima divisione meiotica si ha una

riduzione del numero cromosomico da 2n ad n , si ha una separazione degli omologhi e nella seconda divisione

meiotica si ha una separazione dei cromatidi fratelli.

La spermatogenesi avviene nel testicolo.

Efferents ducts Il testicolo :

Vas deferens - è delimitato da una struttura detta o

tunica albuginea membrana

si insinua all’interno

, ma la membrana albuginea del testicolo

albuginea all’interno di tali setti

stesso dividendolo in setti e si trovano delle

ed è all’interno di tali

- strutture tubulari detti tubuli seminiferi,

epididimo tubuli che avviene la maturazione del gamete maschile.

I tubuli seminiferi sono tanti, sono distribuiti in modo casuale, possono

avere dei decorsi paralleli fra loro o possono anastomizzarsi producendo

- la rete che è la regione dove vengono convogliati gli spermatozoi

testis

maturi prodotti all’interno del tubulo seminifero;

- dalla rete testis si dipartono i che si collegano

dotti efferenti

all’epididimo, anch’esso

- costituito da una serie di dotti e può essere

testa, corpo e coda dell’epididimo, la coda si

diviso in tre porzioni :

continua con il dotto deferente o vas deferens. 2

Dalla testa alla coda dell’epididimo, se si fa una sezione trasversale si vede che il numero di dotti presente diminuisce

e diventa sempre più grande in diametro man mano che si passa dalla testa alla coda fino a convogliarsi in un unico

dotto che è il vas deferens.

Tutto questo è un sistema di afflusso degli spermatozoi ed è finalizzato a convogliare gli spermatozoi dal testicolo al

dotto eiaculatore per essere eventualmente eiaculati.

Il dotto deferente non presenta solo la funzione di realizzare la fuoriuscita degli spermatozoi, ma è molto importante

per determinare la maturazione finale degli spermatozoi che vengono rilasciati dai tubuli seminiferi.

Camillo Golgi 1843-1926

Esperimento: Camillo Golgi ha prelevato il testicolo da un animale da laboratorio, per esempio un topo, ed è stato

immerso in un fissativo, per esempio nel liquido di buen che mantiene bene la morfologia delle cellule; dopo aver

fissato il testicolo si disidrata e si include in un blocco di paraffina e si affetta

mediante un microtomo.

Se le sezioni sono trasversali ci si trova di fronte ad una sezione con tanti tubuli

seminiferi; la maggior parte dei tubuli

sono sezionati in modo trasversale.

A maggiore ingrandimento: si osserva

un unico tubulo seminifero che

un’organizzazione ordinata

presenta

con delle cellule rivolte verso

l’esterno, cellule più chiare, e le code

degli spermatozoi. In tale figura è

possibile osservare una sezione di

tubulo seminifero in cui l’epitelio

seminifero presenta degli spermatozoi maturi che probabilmente saranno

Cellule mioidi rilasciati all’interno del tubulo stesso. Esaminando questa sezione si nota

che le cellule che stanno attorno sono organizzati per strati concentrici e si

quindi all’interno di ogni

osserva la sincronia di maturazione di ogni strato; strato concentrico di cellule, tutte le

cellule si trovano allo stesso punto di maturazione. A maggiore ingrandimento si osserva che il tubulo seminifero è

formato da: (cellule basali somatiche) che svolgono varie funzioni, tra cui quella di imprimere con una

cellule mioidi

contrazione un movimento peristaltico al tubulo seminifero che permette agli spermatozoi che sono rilasciati nel lume

del tubulo di lasciare il tubulo, perché gli spermatozoi maturi testicolari presentano un flagello immobile, quindi non

possono lasciare il tubulo seminifero, ma ciò avviene ad opera di tali cellule che stanno attorno al tubulo che

imprimendo il movimento peristaltico portano le cellule fuori. alla base dell’epitelio,

Partendo dalla regione basale si riescono a distinguere delle cellule staminali che si trovano

quindi in tale regione si troveranno sempre gli spostandoci verso il lume troveremo delle

spermatogoni; cellule

, nella zona centrale dell’epitelio

spostandoci ancora verso il lume troveremo delle

meiotiche (spermatociti), cellule

post-meiotiche (spermatidi).

1) Quindi gli si dividono diventando

spermatogoni

2) spermatociti,

3) gli spermatociti si dividono diventando ,

spermatidi

4) gli spermatidi maturano, vanno incontro a spermioistogenesi attraverso una serie di step per dare origine agli

spermatozoi maturi.

Fra tali cellule si trovano le che presentano un citoplasma molto grande; tali cellule sono connesse

cellule del sertoli

fra loro e formano l’impalcatura del tubulo seminifero, crescono all’interno di tale

maturano e

le cellule germinali

impalcatura. 3

Ogni gruppo di cellule rappresenta la derivazione di una singola cellula di partenza; quindi è possibile tracciare la

storia di ogni singolo spermatogonio e capire qual è il gruppo di cellule a cui darà origine.

Le singole cellule che originano tutte da un unico progenitore costituiscono una sorta di sincizio, perché sono

collegate tra loro da ponti citoplasmatici (non è un unico citoplasma con tanto nucleo, ma la natura sinciziale viene

fatto che esistono dei ponti citoplasmatici che collegano una cellula con l’altra)

dato in questo caso dal e ciò permette a

tali cellule di essere in costante comunicazione fra di loro. Osservando l’istologia dei tubuli seminiferi si può

affermare che ogni sezione del tubulo seminifero differisce

da quella adiacente per il livello di maturazione dello

spermatozoo; se si va a verificare quali cellule sono presenti

a partire dallo stadio basale fino al lume del tubulo si

possono trovare delle diverse associazioni cellulari, quindi

ogni singolo tubulo è costituito da un epitelio seminifero

con delle specifiche associazioni cellulari che possono

essere associate ad una certo momento della maturazione

dello spermatidio a diventare spermatozoo.

In tale figura (11B) è possibile osservare la cellula del sertoli. trovare alla base dell’epitelio

Il della cellula del sertoli a seconda dello stadio delle associazioni cellulari si può

nucleo o verso l’interno; è possibile riconoscere tale

nucleo perché è grande, pallido e presenta due spot

eterocromatici attorno al nucleolo.

E’ difficile, invece, individuare il citoplasma della

cellula del sertoli,(11A) perché le cellule sono

molto grandi, il citoplasma non delimita una forma

tondeggiante (come nella maggior parte delle

cellule), ma è tutto interdigitato e all’interno delle

interdigitazioni si trovano le cellule germinali che

si ancorano nelle interdigitazioni del citoplasma

del sertoli .

In Studi di microscopia elettronica si è visto che

non solo il citoplasma delle cellule del sertoli

avvolge le cellule germinali, ma ci sono delle regioni in cui si affrontano due cellule del sertoli e si formano delle

giunzioni serrate che dividono l’epitelio seminifero in due zone:

- dove si troveranno sempre gli spermatogoni

una zona basale o compartimento basale

- dove si troveranno sempre le cellule meiotiche e post-meiotiche (quindi tutte le altre

una zona abdluminale

cellule germinali). STORIA DELLA CELLULA GERMINALE

Durante la vita fetale la cellula germinale effettua una serie di cicli mitotici:

1) PRE SPERMATOGENESI

Troviamo i prospermatogoni M T1 e T2,

2) EARLY SPERMATOGENESI

Nell’ultima divisione si troveranno gli spermatogoni As differenzianti che daranno origine alla popolazione di

spermatogoni che troveremo dalla pubertà in poi.

3) SPERMATOGENESI

- Spermatogoni

- spermatociti

- spermatidi

- spermatozoi.

Gli spermatogoni localizzati nel compartimento basale non sono tutti uguali, ma si possono anche distinguere

sulla base morfologica dove vengono suddivisi in due o tre categorie a seconda della specie. 4

Nel topo sono state descritte tre

categorie di spermatogoni (figura C):

- gli spermatogoni A,

- e

spermatogoni intermedi

- e dalla divisione

spermatogoni B

degli spermatogoni B si

origineranno gli spermatociti.

Nell’uomo, invece, sono assenti gli

spermatogoni intermedi, sono presenti

solo gli spermatogoni A e B. Partendo dalla cellula staminale per arrivare da

spermatogonio A a spermatogonio B gli spermatogoni

fanno tanti cicli di duplicazione facendo sì che a partire

dallo spermatogonio a si originano 256 spermatidi

(figura 10.5) e quindi 256 spermatozoi; se si moltiplica

tale numero per decine di migliaia di spermatogoni

presenti nel testicolo si giustifica la quantità di

spermatozoi che sono prodotti quotidianamente; quindi

la produzione di spermatozoi non è tanto legata alla

cellula meiotica da 1 cellula a 4 cellule, ma piuttosto è

legata alla moltiplicazione degli spermatogoni.

Storia della spermatogenesi

È presente una cellula staminale iniziale la quale si divide.

La cellula staminale vera può andare incontro ad una mitosi bivalente; nel caso degli spermatogoni la mitosi

bivalente porta alla produzione di due cellule che non sono equivalenti tra loro, ma bensì una cellula figlia avrà le

genitrice, cioè sarà di nuovo una cellula staminale, mentre l’altra

stesse caratteristiche di una cellula cellula entra

nel compartimento moltiplicativo andando incontro ad una serie di mitosi fino a diventare spermatogonio B,

spermatocita primario, spermatocita secondario, spermatidio, spermatozoo.

Si ha quindi una cellula staminale vera che si divide con mitosi bivalente e produce due cellule funzionalmente

diverse.

Tale storia è stata raccontata da Huckins e Oakberg.

GERARCHIA SPERMATOGONIALE Recentemente è

stato visto che in

realtà gli

spermatogoni

sono più plastici

rispetto a quanto

e

Huckins

Oakberg

avevano pensato inizialmente. Per esempio nel caso dei roditori alcuni lavori hanno messo in evidenza che ci sono

tante divisioni cellulari fino a formare una cellula di tipo A/16 ed è proprio tale cellula che entra nel compartimento

differenziante, (il compartimento indifferenziato è costituito da tutti gli spermatogoni che definiamo sulla base

morfologica di tipo A, quando questi si dividono diventano intermedi e poi B, gli intermedi ed i B si chiamano già

spermatogoni differenzianti), ma si è visto anche che in determinate condizioni gli spermatogoni che appartengono al

compartimento indifferenziato possono entrare nel differenziante anche prima di aver terminato tutti i cicli di

divisione, quindi possono arrivare a diventare A/16 (vuol dire che ci sono 16 spermatogoni connessi tra loro da ponti

citoplasmatici, poi la 16° cellula si divide e diventa A1 A2 A3 A4, intermedia e B ) ma in alcune situazioni anche lo

sprmatogonio detto A/8 cioè prima della divisione, entra nel compartimento differenziante; ciò determina una

plasticità di risposta all’ambiente, quindi in alcune situazioni gli spermatogoni che sono nel compartimento

indifferenziato possono entrare prima nel compartimento differenziante, ciò succede nei roditori ma non è ancora

chiaro se lo stesso processo avviene nei primati. 5

La cellula staminale non si comporta sempre allo stesso

modo in termini di divisione cellulare e di tipologia di

ciò dipende molto dal momento

cellula a cui da origine;

di sviluppo dell’individuo.

Nella le cellule staminali vanno

fase prima della nascita

incontro ad una mitosi simmetrica e non bivalente, perché

stanno ancora colonizzando le gonadi ,quindi danno

origine a cellule uguali alle cellule progenitrici.

Nell’adulto, quando tutto funziona correttamente, la cellula staminale originale va incontro ad una mitosi

asimmetrica, quindi ad una mitosi bivalente dando origine a due cellule:

una cellula uguale a se stessa ed

-

- una cellula che entra nel compartimento differenziante; ciò è quanto avviene fisiologicamente; ma se per caso

per un qualche motivo vi è un danneggiamento della spermatogenesi con perdita cellulare, c’è

nella vita adulta

un’alterazione del normale processo spermatogenetico con deplezione cellulare.

all’ambiente, ad esempio, riacquisendo le caratteristiche

Gli spermatogoni rispondono che avevano nella fase

fetale; cioè poniamo che l’insulto porti alla degenerazione di molti spermatogoni, quindi la popolazione

spermatogoniale si abbassa, le cellule spermatogoniali staminali che rimangono nel tubulo seminifero sono in

dall’ambiente

grado di captare segnali e quindi cominciare a dividersi dando origine a delle cellule staminali

uguali a loro stesse per ripopolare il compartimento staminale; oppure se le cellule che vengono danneggiate sono

principalmente delle cellule non staminali ma in fasi successive del differenziamento, una cellula staminale può

andare incontro nuovamente ad una divisione simmetrica producendo degli spermatogoni che entrano nel

compartimento differenziante, perché la richiesta è quella di ricominciare a produrre spermatozoi, quindi invece di

dare origine a due cellule diverse danno origine a due cellule uguali che entrano nel compartimento differenziante;

questa è una risposta ad un cambiamento del microambiente testicolare che può essere dovuto a qualsiasi evento di

tipo traumatico sulla spermatogenesi (es farmaco , veleno).

Ciò da l’idea che la popolazione delle cellule staminali è molto plastica; dà una risposta all’ambiente determinata

dall’ambiente stesso cambiando la modalità di divisione e quindi la tipologia di cellule a cui da origine.

SPERTATOGENIC STEM CELL MODEL

Dal punto di vista morfologico si riconoscono diversi tipi di spermatogoni.

Si ha meno informazioni per quanto riguarda l’espressione genica degli

spermatogoni, ad esempio si sa che dalla cellula staminale affinchè gli

spermatogoni si trovino nel compartimento differenziante esprimono alcuni

geni ad esempio il gene Kit; vi sono altri geni , invece, che sono espressi

differenzialmente in quella che riteniamo sia la cellula staminale rispetto a

quelle che derivano da questa cellula staminale.

È stato anche visto che in realtà, è vero che le cellule man mano che si

dividono perdono sempre di più la loro staminalità, ma è anche vero che fin

quanto rimangono nel compartimento (figura D) ed esprimono il gene Kit le

cellule rappresentate in verde che sono più differenziate rispetto alla cellula

originale possono riacquisire la caratteristica della cellula staminale originaria

(viola); quindi ad ogni ciclo di divisione perdono le caratteristiche molecolari

che definiscono un destino destinato al differenziamento, ma è anche vero che

queste cellule almeno nei primi passaggi di divisione e sotto determinati

stimoli possono comunque riadattare la loro natura e tornare ad essere delle

vere cellule staminali e ciò è un’altra indicazione della plasticità delle cellule

staminali. cellule rispondono all’ambiente con un tipo di mitosi che può dare

Quindi tali

origine a due cellule diverse o a due cellule uguali, ma anche quando il

numero di divisioni inizia ad essere notevole, fino ad un certo momento, da un

punto di vista molecolare ancora tali cellule non si possono caratterizzare

molto bene.

In figura sono indicati solo pochi geni (Kit, neurogenina 3, nanos2 Gfra1) ed

intanto che tali geni continuano ad essere espressi anche se con rapporti

quantitativi diversi si sa che queste cellule possono tornare indietro e rientrare nel compartimento staminale vero e

proprio riacquisendo così la loro natura di cellule staminali. 6

rosso È stato visto che gli spermatogoni che si originano ad ogni ciclo di divisione

hanno un tempo di vita medio di poco più di due

settimane; e le cellule staminali possono rimpiazzarsi; per

esempio le cellule rappresentate in figura (in rosso) che

derivano dalla cellula primigenia è anche possibile che

esaurita la capacità di divisione della prima cellula, perché

ad esempio la cellula staminale è andata incontro ad una

divisione simmetrica che ha fatto entrare due

spermatogoni nel compartimento staminale, quindi il clone

di cellule rappresentato in figura in rosso pian piano viene

ad esaurirsi ed è rimpiazzato da una cellula che da

origine, attaraverso la divisione simmetrica, a due cellule

con la stessa natura di cellule staminali.

Attraverso esperimenti di marcatura è stato visto che le cellule staminali possono

dare origine a tipi cellulari dai quali deriveranno popolazioni di cellule germinali

rimpiazzandosi le une con le altre (figura D).

CELLULE STAMINALI SPERMATOGONIALI

Se esiste una cellula staminale esiste un luogo fisico

nel quale tali cellule si trovano (per esempio negli

epiteli tali cellule si trovano alla base degli epiteli).

Le regioni in cui si trovano le cellule staminali sono

definite nicchie.

Le nicchie sono caratterizzate da dei segnali che

mantengono la staminalità della cellula.

Le nicchie della cellula staminale spermatogoniale

presentano diverse caratteristiche:

- devono localizzarsi nel compartimento basale

- si trovano solitamente vicino a vasi sanguigni,

infatti al di fuori del tubulo seminifero si trovano molti

capillari sanguigni

- è importante la presenza di cellule del sertoli

che producono testosterone, ormone molto importante

per la spermatogenesi.

Nel caso della spermatogenesi è molto difficile

descrivere la nicchia.

Ad oggi le informazioni che si possono ricavare sulle nicchie sono:

1) la membrana basale è costituita da fibronectina, collagene e laminina

2) la laminina è molto importante nel mantenere gli spermatogoni ad uno stato indifferenziato

la laminina si lega direttamente ad un complesso integrinico α6β1 che si trova

3) ad esempio sulla superficie

degli spermatogoni

4) è importante il prodotto di alcuni geni (tali geni non sono prodotti dalle cellule staminali ma sono prodotti sia

dalle cellule mioidi peritubulari sia dalle cellule del sertoli) per mantenere lo stato indifferenziato delle cellule

staminali, mentre il prodotto di altri geni (BMP4, neuregulina1) è importante per determinare il

differenziamento degli spermatogoni.

Non si ha nessuna informazione su quali siano i marcatori

delle cellule staminali, quindi non avendo ancora identificato

dal punto di vista molecolare la vera cellula staminale, oggi

per lo spermatogonio non c’è un marcatore che lo possa

identificare e quindi di conseguenza non è facile nemmeno

identificare qual è la nicchia all’interno della quale la cellula

staminale si trova.

SPERMATOGENESI: DIFFERENZIAZIONE POST-

MEIOTICA

La spermiogensi è il processo che porta alla formazione del

gamete maturo, si parte da una cellula rotonda fino ad arrivare

ad una cellula differenziata (lo spermatozoo) con determinate

caratteristiche: 7

- è una cellula molto piccola (è la cellula nucleata più piccola presente nell’organismo)

- si ha la totale assenza di citoplasma

- è presente il nucleo (rosa)

- la cellula è delimitata dalla membrana plasmatica

è presente l’acrosoma fondamentale per nell’oocita

- la penetrazione dello spermatozoo

- vi è un collo, regione di connessione tra la testa ed il flagello

- un segmento intermedio: qui sono ammassati tutti i mitocondri della cellula formando una struttura a spirale

mitocondriale, è una sorta di centrale energetica della cellula la quale fornisce ATP necessario al movimento

dello spermatozoo

- il flagello

Il passaggio da una cellula rotonda ad una cellula differenziata è un evento abbastanza lungo (solitamente dura 15-

20 giorni) e tale processo è detto spermioistogenesi.

Durante la spermioistogensi è eliminato tutto il citoplasma della cellula, si formano delle strutture specifiche

come la coda, l’acrosoma ed il passaggio da cellula rotonda a cellula matura si può suddividere in vari steps sulla

formazione dell’acrosoma.

base della morfologia della cellula, ma soprattutto sulla base della

1) Fase del Golgi

L’acrosoma deriva dall’apparato del golgi dalla quale si

formano delle vescicole dette granuli proacrosomici o

tali granuli si fondono originando un'unica

proacrosomiali,

vescicola acrosomica.

Dall’organizzazione dell’apparato di golgi fino al momento

della formazione della vescicola sono presenti tre steps.

Mentre si formano i granuli proacrosomici che è un segnale di

polarizzazione della cellula, tutti gli organuli citoplasmatici

iniziano a muoversi ed a posizionarsi nel lato opposto del punto

in cui si forma l’acrosoma, infatti è proprio dal lato opposto

della formazione del proacrosoma che si formerà il flagello.

È possibile visualizzare i tre steps anche su una sezione

colorazione specifica l’acrosoma

istologica colorando mediante

seguendo così su sezioni istologiche tutti i passaggi di trasformazione dell’acrosoma.

2) Fase del cappuccio

Durante la fase del cappuccio la vescicola acrosomica

diventa sempre più grande, inizia a ricoprire la

parte cefalica del nucleo e successivamente si

allunga attorno al nucleo stesso; ciò che rimane

di golgi migra nella regione

dell’apparato

posteriore.

I due centrioli (indicati con PC,DC) iniziano ad

organizzare la crescita del flagello; il citoplasma si sposta ed inizia ad estendersi nella regione anteriore

sulla superficie del nucleo.

Fase dell’acrosoma

3)

Anche qui si hanno diversi steps ( nel topo si arriva a 16 diversi steps di maturazione, nel ratto qualcosa

di più) in cui l’acrosoma raggiunge la propria dimensione e forma finale; nel caso dei roditori e

nell’uomo l’acrosoma riveste i due terzi del nucleo.

Il citoplasma si sposta, inizia ad

l’aspirale

organizzarsi

mitocondriale, il flagello si

allunga e la testa dello

spermatozoo avrà una forma

definitiva legata alla forma

dell’acrosoma, per esempio nel

caso dei roditori la testa ha una

forma ad uncino, mentre nel caso dell’uomo la testa ha una forma

piriforme. 8

Il flagello è costituito da 9 coppie di microtubuli periferici disposti circolarmente attorno a due microtubuli centrali, il

microtubulo A è costituito da 13 protofilamenti di tubulina, mentre il microtubulo B è costituito da 10 protofilamenti;

la dineina associa i microtubuli adiacenti.

Tra il corpuscolo basale ed i flagelli veri e propri è presente una regione nella quale sono assenti i microtubuli centrali

MOVIMENTO FLAGELLARE

Avviene un movimento flagellare a frusta, si ha un movimento casuale.

Se si mettono per esempio gli spermatozoi in un liquido fisiologico essi si muovono in tutte le direzioni,

perché il movimento non è direzionato, (anche se in natura il movimento verrà direzionato).

Nella cellula differenziata si distingue:

- Testa

- Collo

- Flagello

Spermatozoo umano spermatozoo di topo

In tale figura è possibile visualizzare lo spermatozoo umano e lo spermatozoo topo.

MALFORMAZIONI

Al termine della spermatogenesi se si prende dello sperma e si mette su un

vetrino ci si accorge che sono presenti tante forme diverse di spermatozoi,

per esempio si possono trovare spermatozoi a punta di lancia, rotondi, con

teste giganti, si possono anche avere due teste e un unico flagello o una

testa e due flagelli.

È molto importante la morfologia dello spermatozoo.

Uno dei test che si effettua andando in fecondazione assistita è lo

spermiogramma dove si conta il numero degli spermatozoi per ml , ma

soprattutto si valuta la frequenza di spermatozoi malformati, già

fisiologicamente gli spermatozoi sono malformati; sopra una certa soglia si

è di fronte ad un campione di sperma in cui gli spermatozoi hanno una

l’oocita, perché gli spermatozoi alterati

bassissima possibilità di fecondare

non sono in grado di fecondare l’oocita.

Indipendentemente dalla forma, le cellule sono specializzate a veicolare il

genoma maschile, diversamente dalla follicologenesi in cui al termine

dell’oogenesi si ha una cellula molto grande il cui contenuto

dell’embrione per un tempo

citoplasmatico dovrà supportare lo sviluppo

che dipende dalla specie, quindi le cellule spermatiche e cellule uovo

presentano due destini completamente diversi, si ha una funzione di supporto nel caso della cellula femminile e di

veicolazione del genoma nel caso della cellula maschile. 9

In natura si sono evoluti dei sistemi in cui sono presenti degli spermatozoi

esterni e spermatozoi interni; gli spermatozoi interni hanno la capacità di

l’oocita,

fecondare mentre gli spermatozoi esterni fungono solo da vettori

con le loro code a veicolare gli spermatozoi in grado di fecondare.

dove all’interno del

Nei lombrichi vi è una duplice linea spermatogenetica

testicolo sono prodotti spermatozoi con capacità fecondante e spermatozoi

che non sono in grado di fecondare, ma partecipano a formare una struttura

che serve a veicolare gli spermatozoi buoni; infatti se si analizza il

contenuto di dna degli spermatozoi non fecondanti si trovano dei contenuti

cromosomici alterati, è possibile trovare da 1 cromosoma a 10 cromosomi

e ciò è dovuto perchè durante la meiosi i cromosomi sono divisi

casualmente, non c’è più la necessità di controllare l’integrità del genoma, ma la funzione è in questo caso

quella di produrre una cellula con un buon flagello che aiuti le altre cellule spermatiche.

RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINA DURANTE LA SPERMATOGENESI

è l’evento che porta alla formazione

La spermioistogenesi di una cellula avente una forma definitiva a partire

da una cellula indifferenziata rotonda.

Lo spermatozoo presenta una testa molto piccola ed un nucleo piccolo e condensato. La cromatina dello

spermatozoo è molto condensata.

A parità di contenuto in dna lo spermatozoo ha un volume che è un decimo rispetto ad una cellula somatica,

ciò dà l’idea che la cromatina è estremamente condensata; per compattare la cromatina in un volume così

piccolo si ha una modificazione durante la spermioistogenesi, cioè tutti gli istoni sono rimpiazzati con altre

proteine in due steps:

1) sono allontanati gli istoni i quali sono rimpiazzati con proteine di transizione;

2) le proteine di transizione a loro volta sono rimpiazzate dalle protamine.

Lo spermatozoo è l’unica cellula, ad oggi nota, che presenta la cromatina costituita da dna e protamine,

anziché da dna ed istoni; tale transizione avviene durante la fase post meiotica e le protamine rimpiazzano le

proteine di transizione nell’ultimo momento dello sviluppo dello spermatozoo; tale fenomeno avviene in tutte

le spermatogenesi studiate fin adesso.

È un fenomeno evolutivamente conservato, perché ha la funzione di impacchettamento di dna, infatti una serie

di studi che sono stati fatti facendo dei knockout per le proteine di transizione o per le protamine si nota che

nel caso delle proteine di transizione gli spermatozoi prodotti mostrano delle anormalità della cromatina e

della motilità e la prole dei topi knockout è molto ridotta rispetto ai topi normali, quindi gli spermatozoi

prodotti hanno una capacità fecondante inferiore ed i topi sono subfertili; mentre nel caso dei knockout delle

protamine la situazione peggiora ulteriormente perché la mancata sostituzione porta alla formazione di animali

infertili.

Il cambiamento nella composizione molecolare determina un

cambiamento nella struttura della cromatina.

In tale figura è rappresentata la struttura caratteristica della

cromatina della cellula somatica verso quella dello

spermatozoo.

La sostituzione degli istoni con le protamine porta ad una

conformazione totalmente diversa, perché le protamine si

intercalano nel dna formando una struttura comprimibile la

quale si avvolge a formare un anello e tale struttura è

comprimibile perché le protamine sono ricche di gruppi SH

che vanno incontro ad ossidazione formando dei ponti

disolfuro liberando acqua, quindi la disidratazione della

cromatina porta ad ottenere la condensazione della cromatina

al punto tale che la cromatina dello spermatozoo è

completamente silente dal punto di vista trascrizionale. Negli

ultimi momenti della maturazione del gamete maschile non

c’è trascrizione perché la cromatina è talmente compattata da

essere inaccessibile ai fattori di trascrizione.

Quindi le proteine di transizione sono presenti a partire dagli spermatidi

rotondi e poi via via tali proteine sono sostituite formando le protamine.

Nel topo tutti gli istoni sono rimpiazzati dalle protamine, a differenza

dove il 15% delle proteine presenti è ancora

dell’uomo costituito da istoni e

10

trova un’organizzazione mista dove si forma sia “l’anello” che i soliti

si nucleosomi.

L’ipotesi di lavoro sulla quale alcuni gruppi stanno facendo ricerca per capire come mai nell’uomo vi è ancora la

presenza dei nucleosomi è la seguente:

nel caso della sostituzione con le protamine si ha una cromatina condensata e quindi silente dal punto di vista

trascrizionale, a differenza della cromatina legata ad istoni la quale è accessibile e quindi probabilmente

trascrizionalmente attiva o attivabile.

lo spermatozoo entra nell’oocita ed inizia a formarsi il pronucleo, a seconda delle specie, il genoma che è

Quando

trascritto per primo è quello maschile rispetto a quello femminile e per esempio nel topo il genoma è trascritto poche

ore dopo la fecondazione, quindi è vero che durante la formazione del pronucleo le protamine sono eliminate ed è

riacquisita un’organizzazione a nucleosomi, ma potrebbe essere anche vero che il 15% di proteine presenti corrisponda

a quella porzione di dna che viene trascritta immediatamente, quindi potrebbe essere una modalità di regolazione

dell’espressione genica legata ad una differenziale architettura della cromatina che può essere accessibile o non

accessibile. CIO’ CHE AVVIENE DURANTE LA SPERMATOGENESI

- Si parte dalle cellule germinali primordiali,

- avvengono una serie di divisioni: gli spermatogoni

entrano in meiosi formando gli spermatociti e poi spermatidi ; gli

istoni sono presenti in tutta la vita delle cellule germinali tranne

che nella fase post-meiotica in cui sono rimpiazzati dalle

protamine.

Gli eventi importanti sono:

- la meiosi con il crossing over,

- la spermioistogenesi con la perdita di tutto il citoplasma,

alcune fasi in particolare nelle fasi dell’instaurarsi della

- in

spermatogenesi, anche nel caso della cellula germinale maschile

avremo degli eventi apoptotici. Se infatti si prendono dei roditori

appena nati (topo) e si esamina l’apoptosi delle cellule germinali

si avrà un quadro istologico impressionante dal numero di cellule

germinali che stanno morendo nel caso del topo appena nato, man

mano che il topo si avvicina alla maturità sessuale il numero di cellule germinali che muoiono diminuirà

sempre più ed è molto difficile trovare una cellula morta in una spermatogenesi normale.

Perché muoiono le cellule germinali?

Esse sono prodotte in tantissime quantità, ma se tutte rimanessero

nel lume del tubulo esso per le sue dimensioni non sarebbe in grado

di sopportare il gran numero di cellule germinali che si

differenziano. Deve esistere un rapporto tra il numero delle cellule

del sertoli ed il numero di cellule germinali presente nel tubulo

seminifero.

Gli eventi proliferativi che avvengono durante la vita fetale sono

controbilanciati durante l’acquisizione della maturità sessuale con

la morte di molte cellule germinali fino all’ottenimento di un

numero ottimale fra cellule del sertoli e cellule germinali.

nell’epitelio

Sono state quindi viste associazione cellulari ben descrivibili

seminifero ed inoltre è stato visto che a partire dagli spermatidi rotondi,

attraverso lo studio della formazione dell’acrosoma e attraverso vari steps

si ha la formazione dello spermatozoo maturo.

Le associazioni cellulari che si trovano in termine di maturazione delle

cellule germinali e di sviluppo dell’acrosoma hanno portato ai ricercatori a

definire da un punto di vista istologico 12 diversi stadi di maturazione

che si individuano in una sezione di testicolo nei tubuli seminiferi; tali

stadi sono i differenti stadi istologici visualizzabili in figura (a destra).

Per convenzione si può affermare che la spermatogenesi può essere

suddivisa in 12 stadi caratteristici e la maturazione avviene in circa 40

giorni (passaggio da spermatogonio a spermatozoo).

Quindi se si ha la possibilità di prendere un tubulo seminifero , fare una sezione mantenendo vive le cellule e guardare

in 40 giorni si vedono il susseguirsi di tutti gli stadi che formano il ciclo dell’epitelio seminifero.

ciò che succede 11

Esperimento è stato preso un testicolo di

onda del tubulo seminifero:

topo, è stata rimossa la tunica albuginea e con le pizzette si è cercato di

separare i tubuli seminiferi mettendoli in fila ed è stato notato che il tubulo

seminifero del topo è lungo circa 1km; inoltre è stato osservato che

sezionando vari pezzetti per volta del tubulo seminifero e guardando il tipo

di cellule presenti si riesce a ricostruire i vari stadi (stadio 1, 2, 3, ecc)

lungo il tubulo seminifero ed è stato scoperto che è presente la stessa

successione di stadi che si potrà osservare nel tempo in un'unica sezione;

tale fenomeno è stato chiamato onda del tubulo seminifero, quindi l’onda è

nello spazio quello che il ciclo è nel tempo.

Inoltre è stato anche osservato che se si analizzano in una sezione di

testicolo fasci paralleli di tubuli seminiferi e si iniziano a mappare suddividendoli in vari stadi ci si accorge che

osservando i tubuli che sono adiacenti tra loro essi si trovano tutti allo stesso stadio , come se esistesse una

dell’andamento della spermatogenesi non solo lungo il tubulo seminifero,

modalità di coordinazione ma anche tra

tubuli seminiferi adiacenti; infatti è stato visto che se per caso un tubulo cambiava direzione trovandosi vicino ai

tubuli i cui stadi erano diversi rispetto a quella che avrebbe dovuto essere la naturale progressione degli stadi, ad

un certo punto si osservava un’inversione degli stadi del tubulo; tali studi morfologici hanno dato l’avvio ad altri

studi finalizzati a definire quali sono i fattori di regolazione e di coordinazione della spermatogenesi.

Quindi se si va studiare il ciclo dell’epitelio seminifero e l’istologia si nota che tutti i mammiferi presentano

un’organizzazione uguale al topo, cioè sono presenti stadi concentrici di cellule sincrone dal punto di vista della

maturazione.

uomo topo gli studi sull’uomo è stato visto che l’uomo

Quando sono stati fatti

presenta l’organizzazione del tubulo seminifero completamente diverso;

non sono più identificabili i tipi cellulari identificati nel topo ed in

particolare non è più identificabile la disposizione concentrica, ma

piuttosto è stato visto che nella sezione trasversale del tubulo seminifero dell’uomo erano presenti degli spicchi di

somigliare ai vari stadi del topo, ma nell’uomo i vari stadi erano disposti in maniera non

tubulo, che potevano

ordinata.

Per tanti anni è stato ritenuto che ci fosse un’alterazione dell’epitelio

della normale architettura proprio perché in

che nei primati ed in particolare nell’uomo

tutti i mammiferi era stata trovata in questo modo e si è invece visto

ciò non avviene e quindi questa nuova organizzazione era stata valutata come se fosse una perdita di capacità di

regolazione della spermatogenesi, considerando che la nostra specie rispetto per esempio ai roditori è una specie

con capacità riproduttiva infinitamente più bassa, è come se ci fosse una sorta di deregolazione che ha portato ad

una flessione del processo spermatogenetico in peggioramento. 12

STADI DI MATURAZIONE DELL’EPITELIO SEMINIFERO NEI MAMMIFERI

Stadio 2

Stadio 1 Stadio 4

Stadio 3

Stadio 5 Stadio 6 da una descrizione degli stadi in cui l’epitelio

In tempi recenti si è visto che non è così. Si è passati seminifero

veniva descritto attraverso il susseguirsi di sei stadi. I sei stadi sono stati definiti sulla base delle associazioni

cellulari.

I ricercatori hanno ristudiato tutta la spermatogenesi andando a verificare tutti

di maturazione dell’acrosoma

gli steps seguendo le fasi di evoluzione

dell’acrosoma;

nello stadio 1: il golgi inizia ad organizzarsi

nello stadio 2: le vescicole iniziano a fondersi

stadio 3: la vescicola si allunga

stadio 4: la vescicola si allunga sempre di più

stadio 5: la vescicola si allunga ricoprendo la testa dello spermatozoo

stadio 6: si ha la formazione dello spermatozoo maturo.

Tutta la formazione dell’acrosoma è stata suddivisa in 12 steps e tale

suddivisione associando i tipi cellulari presenti nel testicolo ed il grado di

dell’acrosoma ha fatto sì che i sei stadi iniziali diventassero anche nel caso dell’uomo 12.

maturazione

Quindi sulla base delle associazioni cellulari e sulla base della morfologia dell’acrosoma anche la spermatogenesi

umana è descritta in 12 stadi.

In realtà questa suddivisione per cui gli stadi sembravano così lunghi vuol dire che più è lungo uno stadio più è il

tempo di permanenza delle cellule in quello stadio.

I ricercatori hanno pensato che potrebbe essere legato ad una differenza della popolazione clonale di dimensione

delle cellule che derivano da un singolo spermatogonio, non si sa come vengono regolati la maturazione ed il

differenziamento nell’uomo, si può solo ipotizzare che le popolazioni di cellule che derivano dagli spermatogoni

differenziativi siano caratterizzati da un’espansione numerica diversa a seconda dello

nei vari momenti se così è, ma è solo un’ipotesi si giustifica questa de regolazione di stadi

spermatogonio dalla quale derivano; lungo il tubulo seminifero e all’interno del tubulo seminifero nell’uomo.

L’architettura dell’epitelio seminifero garantisce che le cellule germinali,

esclusi gli spermatogoni si trovano in un ambiente il più protetto possibile

per la produzione dell’unica cellula importante che è lo spermatozoo che

darà origine al nuovo individuo, infatti la protezione è data

sostanzialmente dalla presenza delle giunzioni serrate tra le cellule del

sertoli che isolano completamente il compartimento basale dal

compartimento abdluminale; le cellule del sertoli con le loro giunzioni e

con il contesto che si trova nella giunzione basale si chiama barriera

ematotesticolare. 13

Nel nostro corpo esiste solo la barriera ematoencefalica ed ematotesticolare.

isola completamente le cellule germinali in maturazione dall’ambiente esterno, se

La barriera ematotesticolare

per motivi legati a patologie o all’uso di determinati farmaci o alla presenza di molecole nocive la barriera viene

danneggiata e si crea un passaggio di molecole dal compartimento basale al compartimento differenziante con il

danneggiamento delle cellule, quindi tale barriera è talmente importante che definisce nel compartimento

abdluminale l’unica regione alla quale gli anticorpi prodotti dall’organismo non hanno accesso; se la barriera si

interrompe una delle patologie associate è quella di avere una reazione immunitaria self contro le cellule germinali

con il passaggio di anticorpi che non riconoscono come proprie le cellule germinali distruggendo le cellule quindi

dell’integrità di tale barriera è fondamentale per il corretto andamento della spermatogenesi.

il mantenimento 14

DELL’OVOCITA

MARCATORI DELLA COMPETENZA ALLO SVILUPPO

Il progetto trattato in questa lezione, riguarda la competenza allo sviluppo dei follicoli ovarici e in

particolare si suddivide in due parti, una parte riguarda la ricerca di marcatori follicolari e una parte

te o dell’apparato

riguarda la coltura in tre dimensioni. All’i riproduttivo, avviene la follicologenesi, il

p o esso di atu azio e del ga ete fe i ile all’i te o dell’ova io. Questo processo è molto complesso

ili fa il e te ell’ova io. Le

e prosegue per tappe successive di maturazione, distingui caratteristiche

schematico-morfologiche dei follicoli sono facilmente evidenti ad ogni stadio di maturazione, in cui si ha un

a es i e to i pa allelo sia del ga ete dell’oo ita, che è molto piccolo, con un diametro di 70/80 µm, sia

delle ellule folli ola i all’este o atto o all’oo ita, he addi ittu a p olife a o e si

contemporaneamente

differenziano in tre tipi distinti:

etta e te o esse all’oo ita;

 cellule del cumulo, st

 cellule delle granulosa murale, che si trovano alla periferia del follicolo interno; all’este o.

 cellule della teca, che si trovano

Da questa piccolissima struttura, il follicolo primordiale, si forma una grande struttura

tridimensionale molto complessa, follicolo antrale pro-ovulatorio, formata dai quattro tipi di

cellule diverse, il cui antro è ripieno di fluido che la rende una struttura molto complessa e delicata.

ui di fo ata dall’oovo ita

Il complesso cumulo-ovocita è la parte interna del follicolo antrale,

che ha dimensioni di 70/80 µm ed ha più o meno 1500/2000 piccole cellule del cumulo che lo

circondano.

La biologia della riproduzione è fondamentale perché esistono una serie di patologie che

l’infertilità,

riguardano la funzione riproduttiva. In particolare la principale è che riguarda il 15%

delle coppie in età fertile, quindi è una percentuale molto alta, e ad oggi le tecniche di riproduzione

ha o u ’efficienza

medicalmente assistita, disponibili, ancora piuttosto bassa. Si stima più o

meno solo un 30% di esito positivo dei trasferimenti embrionali. A sommarsi a questo 15%, dovuto

principalmente per cause genetiche o fattori ambientali, si aggiunge una percentuale sempre

es e te pu t oppo di pazie ti o ologi he he sviluppa o l’i fe tilità o e side effect delle

terapie a cui sono sottoposte contro il cancro e quindi delle chemio e delle radioterapie. In seguito

a questi trattamenti che sono citotossici e tossici per la funzione riproduttiva, un terzo di queste

pazienti, sviluppano premature ovarian failure, che si manifesta quindi con infertilità e menopausa

precoce. In questo caso, le pazienti prima di sottoporsi a questi trattamenti, hanno a disposizione

una serie di opzioni per cercare di preservare la loro funzione riproduttiva. Tra queste la principale

è la crioconservazione o di porzioni di tessuto ovarico oppure di singoli follicoli immaturi, in questo

aso uesti folli oli, a se o da dell’età della pazie te, posso o esse e e upe ati i futu o e fatti

crescere in vitro per poi essere sottoposti a una fecondazione in vitro. Anche in questo caso la

situazione si complica perché oltre alla difficoltà della procedura di fecondazione in vitro, si somma

una difficoltà forse ancora maggiore, che è tutta la maturazione dei follicoli in vitro, poiché, la

porzione di ovario contiene dei follicoli piccoli che devono essere recuperati e maturati in vitro,

sottoposti a fecondazione in vitro e poi gli embrioni impiantati nella paziente. Anche in questo caso

i sistemi ad oggi utilizzati per la coltura e la maturazione di questi piccoli follicoli hanno ancora

delle rese di maturazione molto basse. In questo contesto le variabili sono tantissime, la principale

è sicuramente la qualità del follicolo e se si parte da un follicolo di buona qualità si è sicuri che

quantomeno il materiale di partenza sia buono e quindi anche tutte le altre variabili che vanno a

sommarsi. In questo progetto di Dottorato si sono posti due domande, visto che le tecniche di

fecondazione assistita hanno un esito molto basso ed è così importante la qualità del follicolo,

come si possono identificare i follicoli che hanno una qualità maggiore, quindi quelli maggiormente

competenti allo sviluppo; inoltre, posto che si possa identificare il follicolo maggiormente

competente, siccome le rese di maturazione sono ancora molto basse e quindi i sistemi di

maturazione in vitro non sono ancora ottimali, come si possono cercare di ottimizzare le

pe la u a dell’i fe tilità igua da la

condizioni, o sviluppare nuovi sistemi. Una delle opzioni

possibilità di derivare oociti o interi follicoli ovarici direttamente da cellule staminali embrionali. La

do a, o l’a i ale fe i a ha tutti i p op i folli oli all’i te o dell’ova io, ui di i

alla nascita,

questo caso sarebbe come una creazione ex novo di follicoli che non sono esistenti. Il primissimo

studio è quello del gruppo di Wheeler, pubblicato su Science circa 10 anni fa, e il risultato

principale è stato quello della derivazione di questi oociti, o strutture simili a dei piccoli follicoli, da

delle cellule staminali embrionali murine. Hanno isolato queste cellule staminali embrionali dalle

blastocisti murine e le hanno differenziate, ottenendo delle piccole strutture che sembravano dei

follicoli. Nessun oocita di questi follicoli è andato oltre il diametro di circa 40 µm, quindi anche se

non hanno ottenuto dei follicoli completamente maturi, questo ha permesso di capire con tutta

una serie di ottimizzazioni che è possibile ottenerli. Sono passati circa dieci anni e nel 2012 è uscito

un altro studio su Science, in cui hanno ottenuto addirittura la produzione di cuccioli. I ricercatori

sono partiti in parallelo con due tipi di cellule, le cellule staminali embrionali, isolate dalla

blastocisti e le IPSC, isolate partendo da cellule della pelle. Hanno coltivato queste cellule in vitro

con tutto un mix di fattori di crescita, hanno ottenuto cellule simili alle cellule germinali primordiali

isolate dall’ova io,

e hanno aggiunto delle cellule somatiche di supporto, uindi cellule della

granulosa, o del cumulo, o follicolari. In seguito, i ricercatori hanno ottenuto delle specie di piccoli

tessuti, porzioni ovariche ricostruite, e le hanno impiantate in topolini immuno-deficienti, da qui,

all’i te o dell’o ga is o, sono cresciuti fino a formare dei follicoli antrali. Così, hanno recuperato

questi follicoli antrali, hanno fatto maturare in vitro gli ovociti fino a metafase II, e una volta averli

fecondati in vitro, hanno ottenuto degli embrioni. Infine, hanno impiantato gli embrioni in delle

topoline pseudo-gravide e ottenuto dei cuccioli. Quindi, alla fine di questo lavoro lunghissimo,

hanno ottenuto delle cellule germinali primordiali non solo competenti ma capaci di dare origine

ad una gravidanza che viene portata a termine, anche se tutta la parte difficile di ricostruzione in

dall’ovo ita pi olissi o fi o al folli olo a t ale

vitro della follicologenesi, pro-ovulatorio, viene

e all’i te o della topoli a.

bypassata perché il tutto avvie Il grande passo in avanti sarebbe

riuscire a ricreare tutto e sostituire questo con una piastra di Petri, infatti è possibile ma ci sono

o t o l’infertilità.

voluti tantissimi anni, e questo sta alla base delle cure futuristiche

Quali sono i follicoli maggiormente competenti allo sviluppo?

Dalla topolina, si isolano gli ovari e dagli ovari, i complessi cumulo-ovocita. Di questi complessi si

l’ovocita

studia stesso e i fattori trascrizionali che regolano la competenza allo sviluppo e quindi

l’oo ita atu i o etta e te.

quali geni vengono accesi e quali vengono spenti, affinché In

parallelo si possono studiare anche tutte le cellule somatiche che lo circondano, che a tutti gli

effetti sono cellule di scarto, quindi si cerca di capire cosa succede in queste cellule che sono

st etta e te o esse all’ovo ita, e si ricavano, in questo modo, informazioni sulla competenza

ualità dell’ovocita

dello sviluppo e sulla che racchiudono. In entrambi i casi le tecniche che

studia e l’esp essio e glo ale di ueste

vengono utilizzate sono le stesse: i Microarrays, se si vuole

ellule, ui di l’i te o t as itto a si ulta ea e te; la RT-PCR quantitativa e classica, se si vuole

studia e l’esp essio e del si golo ge e; l’immunocitochimica studia e l’espressione

se si vuole e la

te o dell’ova io

localizzazione delle proteine. Per questi studi è applicato il modello SN-NSN. All’i

esistono diversi tipi di oociti con una diversa competenza e una diversa organizzazione della

cromatina. Se marchiamo questi oociti con un colorante OCS che si lega alle regioni più ricche di

DNA, possia o studia e l’o ga izzazio e della o ati a. Questo a fianco, è un ingrandimento di

un nucleo, in cui si notano alcuni ovociti che presentano la maggior parte della cromatina

condensata attorno al nucleolo a formare un anellino e sono nominati SN (Surrounded Nucleolus).

L’alt a i agi e, i ve e, mostra un nucleo che ha dei piccoli spot di eterocromatina, ovvero una

lassa all’i te o del u leo. Questi ovo iti

cromatina più sono chiamati NSN (No Surrounded

Nucleolus). Questa differente organizzazione della cromatina si riflette a livello molecolare in tutta

una serie di differenze che poi portano ad una differente competenza allo sviluppo. Quindi se si

fecondano ovociti di tipo NSN si ottengono embrioni che si fermano sempre e quindi sono detti

non competenti allo sviluppo, se si fecondano ovociti di tipo SN, con questo differente tipo di

organizzazione della cromatina, invece, si possono ottenere degli embrioni che vanno avanti

durante tutto lo sviluppo pre-impianto fino allo stadio di blastocisti. Questi ultimi sono quindi

o pete ti allo sviluppo. E’ u odello fo da e tale pe h p ese te i ta tissi i a ife i,

a he ell’uo o, on delle differenze tra specie e specie, infatti, nel caso del topo sono state

identificate due macrocategorie SN.

Come si selezionano i follicoli migliori?

Questa selezione avviene anche nella pratica clinica, quindi quando si fa una fecondazione in vitro,

l’ope ato e visualizza gli oo iti he ha a disposizio e e t a uelli s eglie gli oociti che sembrano

aspetto iglio e pe h l’u i a selezio e he

avere un , può fare, è una selezione di tipo

l’ope ato e disti gue u oo ita o u aspetto o ale

morfologico. Infatti, da uno con un aspetto

a o ale. Se l’ope ato e i o os e l’oo ita o ale, lo seleziona perché sa che ha più possibilità di

l’ovocita

andare avanti nel suo sviluppo una volta fecondato, viceversa, se è anormale, significa che

presenta alcune di queste caratteristiche: granulosità, presenza di vacuoli, una zona pellucida

normale, con un sacco vitellino più grande del normale. Queste caratteristiche sono correlate al

pote ziale di sviluppo dell’e io e, pe h u ovo ita pie o di va uoli non è un ovocita sano,

infatti, una volta fecondato, si ferma nel suo sviluppo. Sicuramente è vero che gravi malformazioni

o p o etto o la ualità dell’ovo ita, a a he ve o he u a selezio e di uesto tipo u a

pe h si asa olto sull’espe ie za, sop attutto dell’ope ato e. Da ui as e

selezione inaccurata, L’ovo ita si può ui di

la necessità di ottenere un metodo di selezione che sia oggettivo.

selezio a e a alizza do l’o ga izzazio e della o ati a, il problema è che in questo modo le

cellule verranno trattate con un colorante potenzialmente molto dannoso e il gamete non può

a alisi ole ola i sull’ovo ita,

essere manipolato in questo senso. Si possono anche fare sapendo

che ci sono determinati geni accesi e spenti, basta analizzarne uno, e si vede se con il gene

l’ovo ita sa à o pete te o se o il ge e o esp esso l’ovo ita o lo sa à, a

espresso anche in

questo caso si comprometterà la cellula. Quello che rimane del follicolo sono le cellule follicolari,

ovvero quelle che stanno attorno, che nella pratica clinica sono cellule di scarto, poiché gli ovociti

vengono denudati. Quindi visto che sono di scarto, e verrebbero buttate via, si possono analizzare.

Quindi per capire quali sono i follicoli più competenti allo sviluppo si cercano dei marcatori

competenti allo sviluppo nella parte somatica del follicolo. Si estraggono gli ovari dalla topolina, si

eo i os opio o u aghetto ste ile all’i te o del ezzo di

punzecchiano sotto uno Ste

isolamento, in questo modo si isolano i singoli complessi cumulo-ovocita. Poi si mette ogni singolo

complesso in una singola goccina di terreno, e manipolando i follicoli con delle Pasteur,

ste ili o il giusto dia et o, legge e te più g a de dell’ovo ita,

micropipette si separano

e a i a e te le due o po e ti, ui di l’ovo ita e le ellule folli ola i, e si creano due piastre

gli ovo iti e ell’alt a,

Petri identiche, in una si mettono le rispettive cellule del cumulo. Si

olo a doli o l’OCS

classificano gli ovociti in SN-NSN, e sulla base di questa classificazione si sono

recuperate tutte le cellule attorno ad ovociti SN, e tutte quelle attorno ad ovociti NSN. Con questo

esperimento fatto con cinque/sei topoline per volta, moltiplicato per n volte, si ottengono queste

due provette contenenti un pool di cellule del cumulo S e cellule del cumulo N, e a questo punto si

analizzano. Quando si analizzano due popolazioni di cellule e non si sa nulla di esse, la prima cosa

he si può fa e u ’a alisi ad a pio spett o di tutto uello he è il trascrittoma, per vedere un pò

in generale quali geni vengono espressi dagli uni e dagli altri, e quindi si utilizzano i Microarrays. Si

estraggono tutti gli mRNA di queste cellule, si retrotrascrivono, e si carica il cip di microRNA. Il

risultato è una lista di 422 geni differenzialmente espressi in cellule del cumulo, attorno ad ovociti

U ’a alisi di Mi oa a s

N, e in cellule attorno ad ovociti S. deve essere seguita da tutta una serie

di analisi bioinformatiche per dare un senso a quello che si ottiene. Di questi 422 geni, 412 erano

down regolati, quindi meno espressi in cellule appartenenti ad ovociti N, non competenti, solo 10

Quest’a alisi

erano più espressi in queste cellule rispetto a cellule attorno ad ovociti competenti.

bioinformatica della Gene Ontology, ha permesso di caratterizzare questi 422 geni in 11 processi

biologici principali. Un 30% di questi geni erano coinvolti nella traduzione del segnale, il 5% era

Nell’istog a a si vede l’a da e to all’i te o

coinvolto nello sviluppo e il 7% nella riproduzione.

di ognuno di questi processi biologici principali dei geni up e down regolati, sono praticamente

quasi tutti down regolati. Per vedere se anche a livello delle proteine ci può essere qualche

relazione e qualche gene che è coinvolto in qualche particolare pathway in relazione ad un altro, si

di ueste a alisi u a

analizzano dei database proteici. L’output network proteica, quindi 142 di

questi 422 geni collaborano in qualche modo tra di loro, da qui si è potuto estrarre un sotto-

network con PTTG1 come gene principale che ha collegato tutti questi altri geni. Si sa che

all’i te o di uesti ge i, differenzialmente espressi, si ha un sotto-network sia di proteine che di

alisi si fe ata

geni che collaborano tra di loro. L’a con dei potenziali dati di partenza, poiché

sulla base dei dati dei Microarrays possono essere fatte analisi più funzionali. In questo caso lo

s opo e a e a e u a ato e, i dipe de te e te dalla sua fu zio e, pe h il a ato e

o ’ la ellula. Pa te do du ue da uesti isultati

una molecola che deve descrivere vengono

analizzate le espressioni di cinque geni follicolo-specifici con una RT-PCR di tipo semiquantitativo.

so o oi volti ell’espa sio e del u ulo, he l’ulti a fase della

Quattro di questi maturazione

per cui le cellule del cumulo cominciano a produrre la matrice di acido ialuronico, altamente

idratata e appiccicosa. La matrice separa le cellule del cumulo dalle altre, rompe le connessioni

st ettissi e he i so o fi dall’inizio della follicologenesi, indebolisce la massa del follicolo,

pe ette l’est usio e del o plesso u ulo-ovocita io du a te l’ovulazio e

dal follicolo e dall’ova

e avviene contemporaneamente al completamento della prima divisione meiotica da parte

dell’ovo ita. oi volti ell’esp essio e del u ulo pe h

Questi geni sono anche HAS è la sintetasi

dell’a ido ialu o i o e ui di la responsabile della sintesi della componente principale di questa

matrice, e altri sono coinvolti nel mantenimento di questa matrice e nella protezione di questa

dall’azio e delle p oteasi. AMH è stato scelto perché è risultato uno di quei dieci geni più espressi

il più diffe e zial e te esp esso da tutta uest’a alisi.

nelle cellule di tipo N, ed Inoltre, AMH è

un marcatore noto in questo campo per essere coinvolto nel reclutamento dei follicoli primordiali

e pe il suo effetto egativo el p o esso di selezione dei follicoli dominanti durante la

follicologenesi. Il risultato di queste analisi rispecchia perfettamente il risultato delle analisi dei

Microarrays, quindi anche in questo caso di questi cinque geni che abbiamo analizzato, AMH è

risultato sempre up regolato, e tutti gli altri quattro sono risultati down regolati, quindi meno

espressi in cellule del cumulo attorno ad ovociti non competenti. In particolare tecniche più

sensibili rispetto al Microarrays, come una Real Time di tipo quantitativo/ semiquantitativo,

di se da u ’a alisi

permettono di focalizzare meglio qual è il reale fold-change di questi geni. Qui

dei Microarrays si ricava un fold-change di circa 2, analizzando più nello specifico un numero di

cellule più ridotto, si vede che il fold-change aumenta, quindi si sa che è espresso quattro volte di

più nelle cellule attorno ad ovociti non competenti. A questo punto, siccome poi in vivo la

data dalla p otei a e o dall’mRNA,

funzionalità è a prescindere dal fatto che si vuole cercare un

u ’a alisi a he al livello della p otei a pe fa api e se poi i vivo vie e

marcatore, si fa

a te uta a he fu zio al e te uesta diffe e za ell’esp essio e, e si vede con una tecnica di

immunofluorescenza che, anche a livello della proteina, AMH è più espressa nelle cellule del

u ulo atto o all’ovo ita o o pete ti. I si goli spot dell’i agi e a fianco, sono singole

cellule follicolari, marcati con il DAPI nelle molecole di DNA, mentre, in verde è raffigurata la

proteina, ovvero il segnale di AMH. Con il MERGE si sovrappongono i due segnali e il segnale

olto più alto, più fluo es e te, ispetto alle ellule dell’ovo ita o pete ti.

complessivo La

ricerca dei marcatori non è ancora finita, dopo aver identificato questi cinque possibili marcatori

della competenza allo sviluppo, si va avanti a cercare delle altre molecole, indipendentemente dai

risultati dei Microarrays, focalizzandosi su due geni particolarmente importanti per la

esi e pe l’ovulazio e, he so o i ge i he odifi a o per

follicologe i recettori ormonali del FSH e

del LH, essendo questi i responsabili in vivo della funzionalità dei due ormoni. Il design

sperimentale è lo stesso, si isolano i complessi cumulo-ovocita, si separano in singole goccine, e

una volta separate le componenti e classificati gli ovociti in SN-NSN, si recuperano le rispettive

i ge i dell’ RNA

cellule attorno al SN e quelle attorno al NSN. Analizzando con una Real Time PCR

e con immunofluorescenza la proteina, si ottiene a livello di mRNA solo il recettore per LH che è

differenzialmente espresso, in particolare più espresso nelle cellule del cumulo attorno ad ovociti

non competenti. Per quanto riguarda il recettore FSH non si notano differenze. Quando poi si

i asi, ui di sia pe il e etto e dell’FSH sia

analizza la proteina si trovano le differenze in entrambi

pe il e etto e dell’LH. Si è trovato un espressione maggiore in cellule attorno ad ovociti non

il e etto e dell’LH

competenti. Quindi anche in questo caso, può andare ad aggiungersi in quella

lista di marcatori possibili identificati in precedenza. Dal punto di vista funzionale, queste cellule

del cumulo attorno agli ovociti non competenti in qualche modo cercano di esprimere ancora più

recettori per cercare di essere più ricettivi nei confronti dello stimolo ormonale, perché essendo

leggermente meno maturi, rispetto ad ovociti NSN, hanno ancora bisogno di rispondere agli stimoli

ormonali. Tutti questi studi sono stati fatti su pool di cellule quindi alla fine di n esperimenti si

ottengono le due provette con le cellule di cumulo, n sta per circa 40 cumuli, si uniscono nella

provetta 40 cumuli di tipo S e 40 cumuli di tipo N, 40 cumuli per 1500 cellule del singolo cumulo.

l’esp essio e dei

Questo, è il minimo indispensabile per poter analizzare, con una Real Time PCR,

geni per una volta. Nel caso dei Microarrays, invece, si deve fare tutta una serie di esperimenti per

pe etto o di ave e u ’idea glo ale di tutto uello he su ede elle

sei mesi, perché queste l’a alisi su all’i i a 600 folli oli di

cellule, però serve una qualità di partenza molto elevata. Si fa

se l’ovo ita o pete te allo sviluppo.

tipo S e 600 follicoli di tipo N, un marcatore deve dire

deve esse e u a ole ola he possa esse e a alizzata all’i te o del si golo u ulo,

Questo così,

nella pratica clinica si prendono le cellule, si mettono nell’incubatore dove maturano i follicoli,

l’ovo ita da pa te

quando questi diventano maturi, si lascia e nel frattempo si analizza

l’esp essio e delle sue ellule el u ulo di u o o più a atori in base al risultato. Tutto questo

fatto sul si golo folli olo. Il passo su essivo api e se vie e a te uta l’esp essio e di

viene

questi marcatori a livello del singolo cumulo. Quindi si isolano i complessi cumulo-ovociti si

mettono in singole goccine di terreno e una parte di questi vengono analizzati subito, vengono

divise in due componenti, marcati e classificati in SN e NSN, e le rispettive cellule del cumulo

vengono raccolte singolarmente. Ogni singolo cumulo viene posto in una singola provetta e poi

p o essate pe fa e u ’a alisi dell’espressione a ato e al o t a io he

vengono di AMH, il

svela dove è espresso negli ovociti meno competenti, quindi di qualità più bassa. Si sa che ovociti

udi atu a o, a da do ovo iti di ualità i fe io e ispetto ad ovo iti he atu a o all’i te o

del loro cumulo, quindi senza perturbare la condizione in cui si trovano in vivo. A questo punto se

si sono identificati i marcatori, che sono ancora presenti nel follicolo antrale, ci si chiede sia se

viene mantenuta una differenza anche al livello del follicolo maturato, sia se si può analizzare

l’esp essio e a he ua do il folli olo espa so e le ellule so o o pleta e te atu e. Vie e

preso una parte di questi follicoli antrali, di questi complessi cumulo-ovocita isolati, si fanno

maturare per ulteriori 15 ore ad atmosfera controllata a 37°C, con il 5% di CO2 e il 90% di Azoto, e

si ottengono dei follicoli maturi. A questo punto si separano le due componenti e si analizza la

o pete za di uesti ovo iti, ovvia e te i uesto aso vie e pe sa l’a hitettu a del u leo,

u ’a alisi a poste io i,

quindi non si può più analizzare SN-NSN, quindi si fa sapendo che ci sono

delle molecole diversamente espresse a livello della metafase II, una è NOBOX. Con una tecnica di

immunofluorescenza, si marca NOBOX e si classificano a posteriori gli ovociti (se è presente

NOBOX in precedenza questo era un ovocita NSN, viceversa, se non è presente NOBOX era un

ovocita di tipo SN). Sempre sulla base di questa classificazione, avviene in maniera analoga la

classificazione di Time-Lapse. In questo sistema si raccolgono nelle singole provette, i singoli cumuli

e viene analizzato AMH, in questo caso, riguardo i dati preliminari, anche a livello del singolo

u ulo a t ale ’ u a diffe e za he vie e a te uta. Vi è sempre una differenza tra ovociti

competenti e non competenti, che in questo caso è variabile, quindi pur facendo poche analisi la

deviazione standard è enorme e sicuramente aumentando il campione può diminuire. In

pa ti ola e la diffi oltà di uest’a alisi stato il settaggio dell’i te a te i a, ’ da o side a e he

l’esp essio e a livello di 40 u uli, adesso da 40 u uli

prima si analizzava si analizza nelle stesse

dovuto setta e tutta la eazio e, l’i te o

condizioni solo un cumulo. In questo caso si è

l’isola e to delle ellule. I più ueste ellule so o ellule

procedimento di estrazione del RNA e

molto povere di RNA, sono molto piccole, e hanno una funzione di cellule nutrici nei riguardi

dell’ovo ita, il uale a uesto pu to ompletamente maturo e non ha più bisogno delle cellule

del cumulo, le quali, avendo concluso la loro missione, non producono più RNA. Però questi

risultati, anche se variabili, indicano che potenzialmente sarà possibile isolare i follicoli e analizzare

l’esp essio e all’i te o delle ellule del u ulo di u ge e, in questo caso AMH. Quindi, stabilire

olto esp esso e l’oo ita o ui di utilizza ile, vi eve sa se

se AMH AMH è poco espresso

possia o utilizza lo all’i te o dell’oo ita. Qui di i uesto aso i u a p ati a di fe o dazio e i

vitro ci si focalizza su oociti che di base sono più competenti allo sviluppo e le rese di fecondazione

la va ia ile i iziale della ualità s a sa dell’oo ita.

in vitro possono aumentare, perché già si scarta

La situazione è più complicata nel caso del follicolo maturo, prima di tutto per la scarsa quantità di

RNA, perché sono entrati in atto una serie di processi di morte cellulare, a cui poi vanno incontro

pe ui a he il po o RNA he ’e a,

queste cellule, inizia ad essere degradato, perché sono cellule

all’oo ita. Il p o le a ell’a alisi dovuto a he al fatto he esisto o a he

che non servono più

delle conformazioni intermedie, oltre alla classificazione che si fa con il modello murino S ed N, che

si vedono al livello della cromatina, questa differenza però si riflette anche nei geni che vengono

accesi e spenti, quindi anche nel caso di un marcatore come NOBOX, che è un marcatore molto

dei seg ali i te edi, il he o pli a l’a alisi e

chiaro, che dà differenze evidenti, si trovano

aumenta la variabilità.

Conclusione prima parte

Si sono identificate le differenze tra SN ed NSN, che sono correlate alla differente organizzazione

della cromatina, perché basate su una classificazione fatta inizialmente tra SN ed NSN. Visto che

defi i e l’i te o

ovociti SN ed NSN sono correlati a una differente competenza allo sviluppo, si può

folli olo. Questo i po ta te pe h l’oo ita o può esse e a alizzato ella p ati a li i a, a a

questo punto si possono analizzare le cellule del follicolo, che sono cellule di scarto, il che ha

permesso di analizzare queste cellule anche sugli uomini, utilizzandole come marcatori. Il problema

è che la classificazione viene fatta a posteriori quindi, si avranno risultati molto variabili.

Come possiamo migliorare le rese di fecondazione in vitro?

In questo caso si parla di Ingegneria tissutale, che tratta della ricostruzione in vitro di un tessuto, e

della coltura di tre dimensioni, coltivare in vitro una cellula vuol dire prendere la cellula dal suo

ga is o e fa la es e e all’este o

contesto in cui cresce in vivo, estrapolarla dall’o

dell’o ga is o, ui di i u o testo del tutto a tifi iale, i eato i la o ato io. La ellula i vivo

un soggetto costantemente bombardato da segnali esterni, i quali sono segnali solubili (fattori di

crescita, ormoni, molecole secrete da cellule nelle vicinanze) e segnali di tipo fisico, quindi segnali

meccanici determinati dalle forze fisiche e dallo stress che agisce sulla cellula (matrice

extracellulare o le cellule vicine). Tutto ciò insieme al contesto strutturale è fondamentale perché

influenza la vitalità e la funzione della cellula. La cellula è in un ambiente in cui vi è una continuità

strutturale e ha una sua forma che viene mantenuta, perché tutti gli elementi della cellula non

Quest’a ie te i

sono liberi nel citoplasma ma sono connessi a degli elementi strutturali.

u o etto he vie e dall’Ingegneria,

equilibrio, ed ha una tensegrità, che che indica un sistema

instabile perché riesce a bilanciare delle forze di tensione e di compressione che vengono

distribuite a tutta la struttura e in questo modo viene mantenuto questo bilancio. Nel momento in

cui uno stimolo arriva in un punto preciso della cellula viene ridistribuito omogeneamente a tutti

P e de do l’ese pio delle ellule

gli elementi e quindi non perturba tutta la cellula. endoteliali in

coltura, se si pongono queste in coltura in un medium statico, dove non è presente la forza di

u a fo a oto da, a ia do l’esp essio e dei suoi ge i,

taglio, essa assumerà viceversa, se

applico la stessa forza di taglio a cui sono sottoposte in vivo, riassumono la loro forma appiattita.

ea e tutto l’a ie te i ui la ellula

Quindi, quando si coltiva una cellula in vitro si deve ri

sottoposta in vivo, perché sottoponendola a degli input diversi, può dare delle informazioni errate

alla cellula su come comportarsi. Questo è particolarmente importante nel caso del microambiente

pe h i folli oli all’i te o dell’ova io es o o ella pa te o ti ale, ui di ella pa te più

ovarico,

sa a dell’ova io, he è una parte molto ricca di matrice extracellulare e soprattutto perché quando

si vuole ricreare la follicologenesi in vitro si deve ricreare un ambiente che sia ottimale per la

crescita e la maturazione dal piccolo follicolo immaturo fino ad ottenere questa grande struttura

isog a i ea e l’a ie te i vit o,

che è il follicolo antrale pro-ovulatorio. Quando bisogna tener

fo ze fisi he degli sti oli. All’i izio il folli olo i atu o

presente delle viene racchiuso in una

a delle fo ze o p essive asse da pa te dell’ambiente

matrice standard ed è sottoposto rigido che

sta attorno. Crescendo, il follicolo aumenterà la forza di compressione che applica sulla matrice e

viceversa, cresceranno le forze contrarie che la matrice esercita sul follicolo. Il follicolo è una

st uttu a t idi e sio ale, e el i ost ui e l’a ie te ova i o isog a e a e di i ost ui e

qualcosa in cui il follicolo cresce mantenendo la sua struttura, e questo è importante perché in vivo

l’oo ita e le ellule del folli olo so o st etta e te o esse dal pu to di vista fisi o fi da ua do

l’oo ita pi olo ed i o dato da u solo st ato di ellule folli ola i. Queste strettissime

connessioni, sono connessioni fisiche perché sono delle gap junction tra tutte le cellule follicolari e

a he o l’ovo ita stesso, a ia o a he le proiezioni trans-zonali, che sono delle proiezioni

i o da ti l’oo ita, he passa o

citoplasmatiche delle cellule del cumulo immediatamente

attraverso la zona pellucida, la membrana e arrivano in contatto diretto con il citoplasma

dell’oo ita, o ui so o i o tatto a he i uesto aso tramite gap junction. Vi è quindi una

all’i te o dell’oo ita a a he t a l’oo ita e le ellule he lo i o da o, e

continuità non solo

questo è fondamentale perché permette uno scambio di piccole molecole, di ioni, di sostanze tra i

l’oo ita e ve so le ellule

due tipi di cellule. Vi è una continua comunicazione bidirezionale, verso

il folli olo o e u ’u i a st uttu a i ui le due o po e ti

del cumulo, questo perché si considera

ese pio l’oo ita espo sa ile del o t ollo del eta olis o e del o t ollo

si compensano. Ad so ati he, ui di l’oo ita a dare

della proliferazione delle cellule i comandi alle cellule

t a ite le giu zio i st ette he ollega o tutte le ellule, vi eve sa, l’oo ita o i

somatiche,

grado di metabolizzare tutto il glucosio, saranno quindi le cellule del cumulo a farlo tramite le gap

i eta oliti del glu osio ve go o t aspo tati dall’oo ita he li utilizze à, e ovvia e te

junction,

sono anche responsabili della mediazione dei segnali esterni, poiché questi ultimi prendono

contatto con le cellule più esterne del follicolo, e poi tramite le gap junction tutto il segnale viene

p opagato e a iva di etta e te all’oo ita. Qui di ua do di oltiva e l’oo ita i vit o,

si cerca si

oltiva e l’i te o folli olo, ui di tutta la st uttu a a te e do e l’a hitettu a

deve

tridimensionale, e dobbiamo quindi impedire che si rompa il follicolo e quindi la comunicazione

Vi tual e te si posso o isola e tutti i tipi di folli oli dell’ova io o dive se

bidirezionale.

procedure, e questi possono essere coltivati in vitro.

Tecniche di coltura più importanti

 Coltura in due dimensioni

 Tecniche canoniche

 Coltura in tre dimensioni

La prima è la tecnica che viene maggiormente utilizzata. Si tratta di una tecnica classica che prevede di

mettere i follicoli in delle singole goccine di terreno di coltura (goccine coperte da uno strato di olio

ed evita l’evapo azio e del te e o),

minerale, che mantiene il pH in questo caso i follicoli sono

sottoposti alla forza di gravità. Già dalle prime ore di coltura il follicolo tende ad appoggiarsi sul fondo

della goccia e a prendere contatto con la Petri su cui poggiano le goccine di terreno, prendendo

contatto si attacca e le cellule proliferano appiccicate alla plastica della Petri. Il follicolo si appiccica e si

appiattisce, ma un follicolo appiattito è un follicolo in cui si è persa la connessione fra le cellule, in cui è

limitato il trasferimento dei nutrienti a tutta una superficie del follicolo, a questo punto è come

coltivare un ovocita nudo. Viceversa le tecniche che prevedono la coltura in tre dimensioni mirano ad

evitare che il follicolo si appiccichi e quindi cercano di mantenere le connessioni cellula-cellula, in

uesti tipi di oltu a il folli olo si espa de i tutte le di ezio i, a tie e l’a hitettu a t idi e sio ale e

le interazioni cellula-cellula e cellula matrice. Tra le tecniche di questo tipo, la più semplice è

caratterizzata da delle goccine invertite. La tecnica è uguale alla precedente, ma si ribalta la Petri, in

questo modo il follicolo non va contro la forza di gravità e quindi non si appiccicherà al supporto, si

a d à a posizio a e sul fo do della go ia, all’i te fa ia te e o-ossigeno e in questo caso sono anche

massimizzati gli scambi gassosi. Ci sono poi delle tecniche che prevedono la coltura in sospensione e

te i he he p evedo o l’utilizzo di u a at i e solida he i a la at i e e t a ellula e olto

altre

i a he ’ ell’ova io. Le oltu e i ovi e to i a o i ve e a a te e e l’a hitettu a del

follicolo, per non farlo appiattire e per mantenerne la struttura tridimensionale. In questo caso però si

inserisce un altro fattore, ovvero lo share stress, la forza di taglio, la forza di frizione del fluido che

agisce sul corpo, quindi in questo caso bisogna muovere il terreno con una violenza tale da evitare che

si attacchi, ma bisogna anche impedire che si stacchino le cellule, perché pur essendo connesso in

maniera molto stretta, muovendo il terreno si possono rompere i follicoli. Sono stati analizzati in questi

casi follicoli marsupiali di criceto e forse anche di ratto, ma in nessuno di questi casi si sono verificati

dei follicoli completamente maturi. I follicoli infatti maturano, si mantengono tridimensionali, ma già al

livello di fo azio e dell’a t o i so o p o le i pe h o si a iva allo stadio di fo azione

dell’a t o. Le oltu e i t e di e sio i p i ipali p evedo o l’uso di u a matrice, ovvero un

biomateriale in cui le cellule vengono fatte crescere, le matrici vengono usate per tantissimi tipi di

ellule, pe h u po’ la ase dell’i geg e ia tissutale, i ea e l’a ie te dove so o state le

quindi

cellule. La matrice, in qualsiasi contesto venga utilizzata, deve avere delle determinate caratteristiche,

ovviamente non deve essere citotossica altrimenti ucciderebbe le cellule in coltura, deve avere una

certa permeabilità, deve quindi permettere un certo scambio di nutrimento, di molecole, e scambi

gassosi, deve avere un certa viscosità ed elasticità, essendo quindi calibrata in base alle cellule da

coltivare, ed una certa durezza e maneggevolezza, per permettere una coltura rapida. Le matrici

utilizzate in laboratorio possono essere differenziate in naturali o sintetiche, in base alla loro origine,

matrici naturali possono essere estratte da vegetali o animali, quindi possono essere trovate

normalmente in natura, ed hanno di buono la loro biocompatibilità, poiché essendo molecole naturali

saranno sicuramente non citotossiche e compatibili con la vitalità della cellula; esse sono inoltre

bioattive perché riescono ad entrare in contatto con le cellule in coltura, soprattutto perché hanno dei

fattori endogeni al loro interno che promuovono delle funzioni cellulari. Hanno una serie di

caratteristiche positive, ma il problema è che la matrice naturale deve essere estratta e può essere

diversa da altre matrici e ciò crea una variabilità infinita. Le matrici sintetiche non sono presenti in

natura, non sono quindi bioattive, non hanno fattori endogeni, e potrebbero addirittura essere

tossiche, però sono standard, ed è possibile quindi calibrarla al meglio.

dell’acido

 Idrogel ialuronico, è una matrice fatta di acido ialuronico. Essa è presente in tutti i

tessuti e viene utilizzata per gli scopi più disparati, dalla cosmesi alla farmacologia, perché viene

utilizzata come matrice in cui vengono incapsulati i principi attivi che poi devono essere veicolati

all’i te o dell’o ga is o; è inoltre di facile polimerizzazione.

 Matrigel, è un insieme di proteine della matrice extracellulare, viene isolato da un sarcoma

u i o, esse do u i sie e di p otei e della at i e e t a ellula e i a u po’ uella he la

funzione della lamina basale in vitro, ha delle proprietà di gelificazione buone, perché si gelifica già

a temperatura ambiente, quindi nella coltura delle cellule si è sicuri che possa rimanere gelificato.

Il problema è che è liquido a 4 gradi, quindi per recuperare le cellule, o si mettono in frigo o

bisogna calibrare la tecnica per recuperare le cellule.

 Agar, crea dei gel che servono per la separazione delle molecole, viene estratto dalle alghe ed è

economico. Il problema è lo stacco della temperatura, poiché per fare un gel di Agar bisogna farlo

bollire, a temperatura ambiente inizia a polimerizzare e lo fa molto lentamente, affinché non si

creino dei grumi o delle bozze, e quindi gli sbalzi di temperatura sono dannosissimi nel caso dei

follicoli delicati.

 PEG, glicolpolietilenico, unica matrice sintetica utilizzata. Essa viene utilizzata per tanti scopi, il PEG

ha delle proprietà di degradazione molto buone, perché viene degradato automaticamente dalle

p oteasi he ve go o se ete dal folli olo i oltu a, ui di uest’ulti o escendo secerne delle

proteasi che rosicchiano la matrice che sta attorno e quindi si creano da soli lo spazio per

espandersi, andando a limitare così le forze compressive della matrice in maniera naturale.

 alcool polivinilico, ha le stesse proprietà di degradazione però non è stato ancora provato.

So o tutti lavo i p eli i a i, essu a di ueste at i i ha dato dei isultati otti ali, u po’ pe la

diffe e za t a spe ie e spe ie, u po’ pe la diffi oltà ell’utilizzo, u po’ pe h so o delle uove

frontiere. Per quanto riguarda il collagene, molecola della matrice extracellulare, flessibile ed

elastica, dalla classica forma a tripla elica, è il primo biomateriale che è stato utilizzato per la

folli oli già egli a i ’80. Essendo

coltura dei stato utilizzato per tanti anni sono state già

sviluppate tre tecniche per il suo utilizzo, può essere utilizzato come un unica matrice in cui le

cellule vengono incapsulate, come una matrice arricchita di proteina della matrice extracellulare,

oppure come micro gocce. Nel caso del protocollo di coltura stessa sono state fatte dello

otti izzazio i, ad ese pio l’aggiu ta di o o i o e ad ese pio l’FSH u po’ pe

che però vale

oppu e l’aggiu ta di ole ole he e a o di a te e e l’a esto

tutti i tipi di coltura, meiotico.

Quando è in vivo, la cellula, mantiene il suo arresto meiotico anche per anni, perché dalla prima

fi o all’ulti a ovulazio e della do a hissà ua ti a i passa o, ui di uelle ellule so o

dall’ova io le ellule e i folli oli,

rimaste in metafase per tutto il tempo. Quando si estraggono si

danno degli stimoli, e lo stesso stimolo meccanico porta alla ripresa della meiosi, per cui bisogna

esse e si u i he ueste ellule a te ga o l’a esto eioti o pe tutta la oltu a e lo ip e da o

solo quando sono mature al punto giusto per poter andare avanti con la meiosi. Per questo

ve go o aggiu te delle ole ole o e l’i i ito e della fosfodiesterai di tipo 3 e il BMX che

a te e e l’a esto eioti o. Queste

cercano di sono molecole che possono essere aggiunte a

tutti i tipi di coltura. Con l’idrogel di collagene si ottiene una buona crescita del follicolo, il quale

atu a, a tie e l’a hitettu a t idi e sio ale, mantiene i contatti cellula-cellula, cresce e

a tie e l’a esto eioti o. Però ’è

la preparazione non è standardizzata, infatti, chi estrae il

topoli o, o hi lo o p a dall’azie da he lo p odu e, e ui di ’ u a va ia ilità

collagene dal

altissima. Le temperature per la polimerizzazione non sono fisiologiche, quindi gli sbalzi di

temperatura danneggiano le cellule. Importante è anche la rimozione dei follicoli dalla matrice, in

questo caso si tolgono degradando la matrice con la collagenasi, che è un trattamento enzimatico

molto semplice, però, visto che il collagene è presente anche nel follicolo, per cui la collagenasi

o fa diffe e za t a ollage e e doge o e ollage e esoge o, deg ada iò he ’ da deg ada e,

rischiando quindi di rompere il follicolo. Da qui nasce la necessità di un materiale più maneggevole

l’

e di più semplice utilizzo, Alginato di Calcio, materiale utilizzato per 10 anni. Questo è un

polisaccaride prodotto dalle alghe brune, quindi lo si può isolare, è biocompatibile, molto affine

all’a ua e fa ile da aneggiare, ed è stato utilizzato per tanti scopi, dalla cucina molecolare alle

apsulate e oltivate, ed stato utilizzato a he i edi i a. L’

cellule staminali, che vengono in

Alginato è facilissimo da polimerizzare perché è una catena formata da unità di acido glucuronico e

a livello dell’acido

acido beta glucuronico, alfa glucuronico vi sono dei gruppi carbossilici con le due

cariche negative, se si aggiunge uno ione bivalente positivo, ad esempio il Calcio, si ha un crosslink

fra questi due gruppi di due molecole di acido glucuronico e di due molecole di Alginato di Sodio

vicine e in pochi minuti si polimerizza. Se è maggiore la concentrazione di polimero la

polimerizzazione sarà più veloce. A livello teorico ogni ione bivalente è positivo, quindi può essere

io, i lette atu a l’

anche il Magnesio o il Ba Alginato è stato utilizzato da due/tre gruppi nel mondo

he, t a l’alt o, olla o a o, e il p oto ollo è questo: vengono isolati i follicoli pre-antrali immaturi,

vengono posti su gocce di Alginato di Sodio, di soluzione liquida, su una mesh di polipropilene.

Ogni singolo follicolo viene posizionato in una goccia di circa 2 o 3 microlitri, la mesh viene ribaltata

nella soluzione crosslinkante e dopo circa due minuti si ottengono delle sferette con i singoli

follicoli incapsulati, quindi le singole goccine si polimerizzano. In un altro lavoro, degno di nota,

hanno coltivato questi follicoli immaturi in beads di Alginato hanno ottenuto una prole viva e

fertile, hanno seguito lo stesso procedimento, utilizzando la mesh di polipropilene, hanno coltivato

le beads per otto giorni circa a 37° con 5% di CO2 in aria e hanno ottenuto dei coks, che in realtà

sarebbero dei follicoli antrali. Anche in questo caso, recuperandoli dai beads, la rimozione è

e zi ati a, pe ò l’ u ’

Alginato non è presente nel follicolo, per cui se si usa Alginatoliasi si è sicuri

che non viene danneggiato il follicolo ma solo la matrice. Sono stati isolati i complessi cumulo-

ovocita, e sono stati denudati e maturati a metafase 2 per circa 16 ore, sono stati fecondati in vitro

e ottenuti embrioni di due cellule che sono state impiantate in topoline pseudo-gravide, e da lì

sono nati dei cuccioli vivi e fertili. Hanno quindi ricreato lo step che nel lavoro di Science era stato

bypassato. Il risultato è ottimo anche perché vengono mantenute le strutture in tre dimensioni dei

follicoli. Questi sopravvivono, crescono e si espandono in tutte le direzioni, mantengono inoltre

l’a esto eioti o, pe ò la pe e tuale di fe o dazio e elativa e te assa, solo u 68% o t o

l’82% del o t ollo i vivo, ui di degli ovulati che vengono isolati direttamente in questo stadio.

La percentuale di nascite è ancora più bassa, con solo un 20%. Da qui è partito Schulz che ha fatto

all’i te o dei

questo lavoro nel 2011, concentrandosi sulla comprensione di ciò che accade

follicoli. Il processo è sempre lo stesso però le rese di fecondazione furono ancora più basse del

lavoro precedente, quindi solo un 20% contro il 91% dei maturati in vivo, e lo sviluppo blastocisti è

bassissimo, ovvero solo del 18%, la competenza allo sviluppo è quindi fortemente compromessa.

i due o i t e di e sio i ell’

Se si coltiva Alginato a livello di maturazione a metafase II, quasi

non ci sono differenze, ma nel vedere quanti se ne fecondano si ha una buona fecondazione di

quelli cresciuti in due dimensioni, ma quelli cresciuti in tre dimensioni calano a picco, quindi a

prescindere dal controllo in vivo anche il controllo in due dimensioni fa capire che succede

ual osa a livello dell’ he ’ u a

Alginato. Grazie a delle analisi più specifiche hanno notato

maggiore incidenza di piastre meiotiche male organizzate o male allineate negli ovociti coltivati in

Alginato, si ha una disfunzione dei granuli corticali non uniforme, come sono invece negli ovociti

maturati in vivo. Hanno fatto anche delle analisi a livello di espressione genica e hanno visto che

virtualmente i follicoli hanno qualcosa che non va a livello molecolare.

E’ stato fatto lo step dopo, e a e di i ost ui e l’i te o ova io i vit o, ed stato fatto o

ovvero

I p ati a ha o pe sato he olt e a i ost ui e l’a ie te ova i o, ette e i

follicoli umani.

follicoli, far mantenere il rapporto cellula-cellula e la loro funzionalità a livello ormonale, devono

mantenere tutte e tre le componenti, perché è possibile che coltivando in vitro venga persa la

componente più esterna, ovvero quella delle cellule della teca, che sono le ultime che si

sta po di aga a ido d’ape, ha o est atto delle

differenziano. Per fare ciò hanno costruito uno

cellule della teca, le hanno coltivate in vitro a creare questi micro tessuti e le hanno messe

all’i te o di uesti u hetti, lo stesso p o edi e to stato utilizzato pe le ellule della

granulosa, manca solo il complesso cumulo-ovocita. Hanno dunque preso tre complessi cumulo-

essi all’i te o di uesto sta po,

ovocita umani, li hanno ottenendo dei pezzettini di tessuto

ovarico ricostruito, e un terzo degli ovociti ha raggiunto la metafase II, ovvero il 33%. Una volta

otte uto uesto isultato ha o a he e ato di iosezio a e l’ova io per fare delle analisi di

immunocitochimica, ma non è stato possibile perché le adesioni intracellulari che si erano formate

tra le cellule erano troppo deboli, avendo separato le tre componenti, in più le cellule della

granulosa e le cellule della teca hanno delle funzioni steroidogeniche, che sono fondamentali, ed è

quindi giusto provare ad aggiungerle per vedere se riescono a produrre gli stessi ormoni che

producono in vivo, però in questo caso la produzione ormonale non è stata valutata. I metodi

tradizionali rompono le connessioni tra teca-granulosa-cumulo, di conseguenza ovocita. Se si ricrea

l’ova io a tifi iale, si mantengono i tre strati di cellule somatiche, e si ha quindi una migliore

comunicazione paracrina ed endocrina. Lo step dopo è stato cercare di capire se in coltura le

l’

cellule della granulosa e della teca svolgono la loro funzione. Quindi, hanno analizzato Alginato di

Calcio e hanno fatto delle diverse beads, hanno provato a farne alcune con le cellule della teca,

altre con le cellule della granulosa e le hanno coltivate assieme, e volevano vedere se riuscivano a

produrre ormoni. In seguito hanno fatto delle beads mischiate e la terza tecnica che hanno testato

è una beads doppia, la prima interna con le cellule della granulosa e la seconda più esterna con le

cellule della teca. Hanno analizzato la produzione ormonale nei tre tipi di coltura, il tutto vs il

sistema di coltura in due dimensioni. In questo caso la situazione è più complessa, perché pur non

esse do i l’ovo ita, so o ellule diffi ili da oltiva e i vit o, pe h i oltu a va o

spontaneamente in contro a morte. Hanno visto che sopravvivono le cellule capsulate non

andando in degenerazione subito, hanno una miglior secrezione ormonale nei sistemi in tre

dimensioni, e quella che ha dato risultati migliori è la microcapsula a più strati.

Conclusione seconda parte

folli oli ua do es o o i vit o se a o es iuti o al e te e l’espressione

I genica è

virtualmente identica a quella dei follicoli maturati in vivo, però la qualità degli ovociti è scarsa per

le rese basse, quindi si va avanti in parallelo su linee diverse. Prima di tutto bisogna continuare a

all’a uisizio e della o pete za allo sviluppo, poi

capire quali sono i meccanismi che portano

bisogna continuare ad ottimizzare i sistemi di coltura in due dimensioni, che sono i sistemi che ad

oggi vanno meglio, ma anche ottimizzare quelli a tre dimensioni, e a svilupparne di nuovi. Inoltre

continuare ad identificare marcatori che ci permettono di seguire la qualità dei follicoli.

Nel loro laboratorio hanno provato a coltivare i follicoli in tre dimensioni, sviluppando un sistema di

nebulizzazione, se su una Petri si mette uno strato di Alginato liquido si nebulizza sopra il crosslinker, le

molecole di Calcio vanno ad intercalarsi nella soluzione. Nebulizzando il Calcio si ottengono dei lipidi di

ua do l’

matrice molto sottili. Il tempo di nebulizzazione è molto lungo, circa 20 minuti, Alginato è liquido

si possono incapsulare le cellule, lasciando a temperatura ambiente per 20 minuti in cui le cellule sono

bombardate dal Calcio. Quindi meglio fare uno strato più spesso e poi mettere le cellule con la pipetta,

anche se poi finiranno per galleggiare nel medium. Hanno lasciato stare questo e hanno ripreso le beads,

facendo gocciolare la soluzione di Alginato dentro la soluzione cross linkante in movimento, così vengono

delle beads rotonde e perfette. Importante è la concentrazione del polimero, che essendo alta non darà mai

le forme desiderate. In letteratura hanno fatto un lavoro in cui dicono che tra le varie concentrazioni per la

coltura del follicolo murino 0.25% è quella ideale e la matrice sarà delicatissima. Per i follicoli umani serve

un 2-3% quindi più semplice. Hanno anche pensato di utilizzare del Bario per avere delle capsule e non dei

beads, perché la capsula si ottiene facendo gocciolare la soluzione di cross linkante con dentro la cellula

ella soluzio e di poli e o, ua do cade la goccia si poli e izza la supe ficie, all’i te o i a e u co e

liquido dove stanno le cellule. Così hanno delle strutture grandissime, circa mezzo centimetro di diametro, in

follicolo si pe de e l’espe i e to

un sarà più difficoltoso. Facendo invece le beads si fa gocciolare da una

pipetta, alla concentrazione di 0.25% di Alginato con dentro il follicolo nella soluzione di Cloruro di Calcio

(50 millimolare) e nel giro di poco si ottengono strutture, che non sono proprio beads ma più piccole delle

capsule. I risultati dei controlli in due dimensioni dimostrano che già al giorno 3 i follicoli si appiccicano fino

al giorno 9 che sono totalmente appiccicati e sono come morti. Viceversa nei follicoli incapsulati al giorno 5

le cellule hanno proliferato, fino al giorno 7 sono perfette, per poi morire al giorno 10. Quindi è importante

trovare tecniche che impediscono ai follicoli di appiccicarsi. Inoltre sapendo che le cellule follicolari sono

diverse, S e N, hanno provato a separarli e a coltivarli in maniera incrociata: S con S ed N con N e N con S e S

con N. Hanno preso gli ovociti, gli hanno classificati, hanno recuperato le cellule del cumulo S e quelle N, le

hanno riunite e hanno messo sopra il follicolo, cioè gli ovociti, nelle quattro condizioni, due canoniche e due

incrociate. Dopo 15 ore di maturazione gli ovociti in metafase II e le cellule del cumulo hanno proliferato e

sono espanse, così utilizzando i marcatori, a livello della metafase II, si analizza in RT-PCR i geni che sono

marcatori della competenza allo sviluppo e a livello delle cellule del cumulo, si utilizzano due dei marcatori

indentificati in precedenza. Ad esempio si è visto che il gene era più espresso nelle cellule

PDGF2

co pete ti, ge e dell’espa sio e del cu ulo, ui di se le cellule si coltivano con gli ovociti S è molto

espresso, con ovociti N anche, se però si prendono le cellule del cumulo N e si coltivano con ovociti N lo

au e ta o l’espressione.

esprimono pochissimo, con ovociti S invece, Nonostante non sia connesso con le

l’ovocita S ha dato degli sti oli alle cellule follicola i di p odu e uesto ge e, a che se o

gap junction,

sono strettamente connesse. 3/11/14

L’epididimo è una struttura in cui si completa la maturazione del gamete maschile derivante dal dotto di Wolf costituita

da una serie di canalicoli di numero decrescente e di dimensione crescente che partono dalla testa fino alla coda

dell’epididimo e continuano con il dotto L’epididimo è un organo di transito per la fuoriuscita degli

deferente.

spermatozoi, ed è l’unica porzione delle vie genitali maschili in cui gli spermatozoi posso essere anche accumulati. Gli

spermatozoi maturi presenti nel testicolo vengono liberati dal tubulo seminifero e possono essere accumulati

nell’epididimo; e una che lasciamo l’epididimo vengono eliminati con l’eiaculazione.

volta Gli spermatozoi liberi

testicolari non sono capaci di muoversi perché il loro flagello è immobile ma una volta che gli spermatozoi attraversano

dell’epididimo il flagello acquisisce la motilità ponendo fine alla maturazione degli spermatozoi. Riassumento:

la coda

1)Acquisizione della motilità del flagello 2)Gli spermatozoi che lasciano i tubuli seminiferi

presentano un residuo citoplasmatico chiamato goccia citoplasmatica che accumula tutta

la componente citoplasmatica non funzionale per la cellula; la goccia citoplasmatica viene

gli spermatozoi attraversano l’epididimo(termine della

scartata nel momento in cui

maturazione dello spermatozoo).Uno dei parametri esaminati in un eiaculato è la presenza

o l’assenza della goccia citoplasmatica .Nel passaggio attraverso l’epididimo i gruppi SH

residui degli spermatozoi vengono ossidati in S-S con un ulteriore condensazione della

cromatina.

Le cause dell’infertilità maschile sono molti, possono riguardare tutte le fasi della maturazione del gamete maschile e

l’entità sarà diversa a seconda del tipo cellulare danneggiato. Quindi la condizione patologica dello spermatozoo è data

da un’alterazione della spermatogenesi o della spermatoistogenesi.

INFERTILITA’ MASCHILE

Quadro clinico delle malformazioni degli spermatozoi descritte nella nostra specie.

Le tipologie di malformazioni vengono

divise in due o tre categorie: la prima

categoria riguarda l’anomalià della testa dello

spermatozoo ,la seconda categoria riguarda la

coda e l’ultima categoria riguarda l’anormalità

sull’infertilità

sia della testa che della coda. Dati maschile che risalgono all’anno 2012: nel

mondo orientale il 10-15% delle coppie sono affette da ridotta fertilità. Le cause: maschi non

producenti di un numero sufficiente di spermatozoi, maschi non producenti

Il basso numero o l’assenza

spermatozoi(azoospermia). di spermatozoi può essere dovuto a

molteplici cause: endocrine,infettive,genetiche,ostruzione delle vie genitali, disfunzione

erettile, ambiente, sistemiche, criptorchidismo. Il 15-20% è un difetto cromosomico

(delezioni o microdelezioni) che riguarda il braccio lungo del cromosoma y umano e come risultato finale non si ha

produzione di spermatozoi. Una volta analizzato lo spermiogramma le diagnosi suggerite sono: verificare il cariotipo

poiché ci possono essere condizioni come ad es. un cromosoma y in più (xyy) o (xxy); e la presenza di cromosomi

L’ambiente ha un’

sopranumerari comporta un alterazione nella spermatogenesi per cui il danno sarà a livello meiotico.

influenza sia sui processi di sviluppo che di differenziamento;infatti la spermatogenesi è sensibile alle condizioni

ambientali ed agli xenobionti. Altre cause sono l’elevata temperatura , pesticidi,metalli

pesanti(piombo, cadmio etc.).I test utilizzati in laboratorio per studiare la

basano sull’analisi morfologica

spermatogenesi si e numerale degli spermatozoi e

sull’analisi istologica del testicolo. L’analisi istologica del testicolo consiste nel valutare

la frequenza di cellule picnotiche, e nel verificare la fase in cui viene fermata la

spermatogenesi( se ci sono cellule post-meiotiche,spermatogoni, cellule meiotiche etc).

Dall’analisi della morfologia dell’acrosoma e dell’associazione cellulare si può

assegnare uno stadio ad ogni sezione del tubulo seminifero. La frequenza degli stadi del

seminifero, ci dà un idea della bontà della spermatogenesi.slide(topo

ciclo dell’epitelio

trattato con pesticidi)le colonnine in cui sono presenti degli* indicano che la frequenza

di questi stadi è significativamente diversa dal controllo; per cui si ci concentra nello

studio degli stadi presentanti una frequenza diversa. Un altro test molto utilizzato è il

COMET ASSAY per valutare se la cellule presenta rotture del DNA a singola o a doppia elica. Inoltre il test della

cometa ci permette di quantificare il danno in base alla lunghezza

della cometa e all’intensità delle fluorescenza e la frequenza delle

cellule presentanti la cometa. Se si vuole studiare la meiosi, si

applica una tecnica chiamata sinaptinemale complex simple per

preparare gli spermatozoi in tutti gli stadi mettendo in evidenzia il

complesso sinaptinemale degli spermatozoi bivalenti. Il complesso

sinaptinemale è una struttura proteica che si forma durante la

profase meiotica tra i due cromosomi omologhi in modo da

favorire il loro appaiamento per il crossing-over. Analizzando

come si organizza il complesso sinaptinemale, è possibile risalire

in quale momento della meiosi si trova la cellula.

L’EFFETTO DELLA TRASLOCAZIONE CROMOSOMICA

(TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA su modello di topo domestico)

NELLA SPERMATOGENESI

Le traslocazioni cromosomiche sono la causa di molte sindromi anche nella nostra specie, e spesso sviluppano effetti

negativi in processi gametogenetici sia maschili che femminili. Nel laboratorio della professoressa Garagna stanno

studiando in particolare la spermatogenesi di una specie di topo domestico chiamato il cui

Mus musculus domesticus

cariotipo è 2n=40 e tutti i cromosomi sono telocentrici. I cromosomi telocentrici si fondono a livello centromerico per

dare origine ad un cromosoma metacentrico questa tipologia di traslocazione cromosomica è chiamata traslocazione

Robertsoniana. Una volta formato il cromosoma metacentrico può succedere che i due cromosomi omologhi restano

telocentrici (condizione di eterozigosità) oppure può avvenire un altro evento di fusione in cui tutti i cromosomi

diventano metacentrici(condizione di omozigosi).Le diverse popolazioni di topi con cariotipo e cromosomi metacentrici

differenti appartengono ad un’unica specie di topo che è quella del Mus musculus domesticus(domesticus indica una

in tutta l’area occidentale. della specie

All’interno fanno parte i topi distribuiti

sottospecie)distribuita Mus musculus

nell’area dell’ Europea occidentale che sono i topi distribuiti nell’area Orientale fino

i e

Mus musculus domesticus

all’Asia che sono i La differenza tra queste due sottospecie è che la sottospecie Mus musculus

Mus musculus musculus.

musculus ha sempre un cariotipo 2n=40. Il numero e la varietà della sottospecie Mus musculus domesticus è dovuta ad

una diversa composizione e organizzazione molecolare del centromero che permette la fusione dei centromeri tra

cromosomi telocentrici. Es. di un topo nato da un incrocio tra una topolina avente cromosomi metacentrici con un topo

avente come cromosomi omologhi cromosomi acrocentrici(esempio di incrocio tra un 2n=40 per un 2n=24).Tutto ciò

comporta una vera e propria deregolazione della divisione meiotica, per cui si avrà un aumento del tasso di anaploidia

nelle cellule figlie e il blocco della spermatogenesi allo stadio meiotico con morte cellulare.

MODELLO PER LO STUDIO DELLA DEREGOLAZIONE

MEIOTICA.

In un topo ad es. 2n=40 sono presenti tutti i cromosomi omologhi

perfettamente appaiati senza alterazioni. Nel bivalente sessuale il

.Nell’uomo le due

cromosoma X appare più grande del cromosoma

regioni di omologia si trovano nelle regioni terminali del

cromosoma Y, mentre nel topo la regione di appaiamento di

Quindi dall’ incrocio

omologia con il cromosoma X si trova nella regione terminale del braccio del cromosoma Y. di

un 2n=24 per un 40 si ottengono dei cromosomi trivalenti perché ogni cromosoma metacentrico possiede i due

per cui al termine dell’appaiamento viene prodotta una struttura filiforme perfettamente appaiata.

telocentrici omologhi

Esistono però nella regione centromerica delle regioni di non omologia definite aperte in cui i cromosomi non si

appaiano correttamente perché i due cromosomi telocentrici sono diversi dal metacentrico. Tutto questo porta

all’incapacità di risolvere l’appaiamento e successivamente la divisione. Tabella che descrive il numero di trivalenti che

non sono riusciti ad entrare in perfetta sinapsi(appaiamento) distribuiti con una frequenza in cui sono rappresentati

delle sottoclassi del pachitene iniziale medio tardivo e diplotene e diplotene tardivo. Con l’avanzare della meiosi la

perché c’è la capacità

frequenza dei trivalenti in non sinapsi diminuisce chiamata di appaiare anche

meiotic abjustment

le regioni che non sono omologhe e questo avviene attraverso uno streaching della regione centromerica. Durante il

pachitene si manifesta il tentativo di appaiare le regioni non omologhe. Esistono nelle cellule in meiosi, dei checkpoint

delle sinapsi che si attivano quando le sinapsi non avvengono correttamente determinando l’eliminazione delle cellule.

Es. nel caso di topi derivanti da un incrocio 2n=24 per 40 pochi sono gli spermatociti che si trovano in non sinapsi, per

cui i checkpoint delle sinapsi vengono passati e la maggior parte delle cellule che si trovano in pachitene riesce a

raggiungere la metafase(le cellule si accumulano in metafase) ma non sopravvivono perché in metafase i checkpoint

della metafase innescano la loro morte cellulare. Il Mus Musculus Domesticus(modello di speciazione cromosomica)

può essere utilizzato come modello animale per studiare i meccanismi molecolari e citologici del danno cromosomico

alla spermatogenesi. Quando due topolini con un numero cromosomico diverso si accoppiano, originano dei

sterili o ipofertili. Nel momento in cui la sterilità e l’ipofertilità

topolini(ibridi) che possono essere diventano importanti,

con il passare del tempo, queste due popolazioni sono destinate a separarsi ed eventualmente ad andare incontro a

fenomeni di tipo speciativo. Se il numero di cromosomi in

è basso, l’ibrido che si

eterozigosi(diversi) genera sarà un ibrido

fertile; mentre se il numero di cromosomi tra le due popolazioni

differisce moltissimo gli ibridi risultano ibridi sterili non in grado di

contribuire al flusso genico. MA GLI IBRIDI FERTILI ORIGINATISI QUANTO

CONTRIBUISCONO AL FLUSSO GENICO?

Sono stati studiati gli eventi di ricombinazione. (Figura)

Immunofluorescenza (tripla

reazione) utilizzando un

anticorpo contro una proteina

MLH1 che marca il sito di

ricombinazione di giallo un Ab

contro il complesso

sinaptinemale che dà il colore

rosso, e un Ab che marca il centromero di giallo. I

due segnali di colore giallo si distinguono in base alla

dimensione perché il centromero risulta essere più

grosso rispetto al sito di ricombinazione. In questo

modo è possibile per ogni singolo cromosoma sia

contare quanti eventi di ricombinazione ci sono stati che mappare i siti di ricombinazione.

Come risultato si ottiene che la frequenza di ricombinazione diminuisce in modo

significativo nella regione prossimale del centromero ciò significa che la porzione di

cromosoma che viene scambiata è molto più limitata nel momento in cui la frequenza

di ricombinazione prevede che il punto di ricombinazione si trova nella regione centromerica distale o intermedia. Se

invece, il sito di ricombinazione si trova nella regione prossimale del centromero tutto il braccio cromosomico viene

scambiato mentre se è intermedio viene scambiato un pezzo più corto del cromosoma e se è distale un pezzo del

cromosoma ancora più corto. Queste frequenze di

a seconda dell’incrocio

ricombinazione possono variare

che viene fatto. (figure :vedi figura sotto ).

meiotiche

Se l’incrocio produce delle figure meiotiche trivalenti la

frequenza di ricombinazione totale non cambia ma

cambia nella regione prossimale del centromero. Ma se le

figure meiotiche sono più complesse, nelle regioni di non

appaiamento il crossing-over non avviene ciò significa

che gli ibridi, derivati dall’incrocio tra le due popolazioni

hanno delle frequenze di ricombinazione più basse

l’ibrido è fertile o

rispetto ai parentali. Quindi anche se

contribuisce comunque all’alterazione del flusso genico tra le popolazioni perché le frequenze di

subfertile in cui si verifica l’evento di ricombinazione.

ricombinazione variano o in numero o in posizione La regione geografica

è stata l’Italia

in cui questo evento di riarrangiamento nel cariotipo si è verificato per primo perché ha un alto numero

c’è stato uno spreading diretto verso

di popolazioni con il cariotipo più riarrangiato e successivamente il Nord Europa,

l’Europa Occidentale la Costa Nord dell’

e Africa. Alcuni ricercatori hanno ipotizzato che i topi siano stati portati in

Europa durante l’espansione dell’Impero Romano.

INTRODUZIONI SULLO STUDIO CONDOTTO SULLE CELLULE STAMINALI MIRATA

ALL’INDIVIDUAZIONE DELLO SPERMATOGONE CON CARATTERISTICHE STAMINALI.

studi si basano principalmente sull’identificazione

Gli della cellula staminale mediante marker staminali e della nicchia

in cui si trova la cellula staminale. Ed è proprio nella nicchia che si trova la cellula staminale che permette di mantenere

l'omeostasi dell’organo, e un’ alterazione della nicchia può determinare il

processo tumorale. (Slide dello spermatogoni e delle cellule germinali).Si parte

cellule dell’epiblasto che vengono determinate

dalle nel diventare delle

Primordial Germ Cells, queste migrano a livello delle creste genitali dove

aumentano in numero. Alla nascita nel tubulo seminifero sono presenti

le cellule del Sertoli e gli Spermatogoni che vanno incontro ad un ciclo di

replicazione e si fermano fino al momento della pubertà. Alla pubertà,

saranno presenti delle cellule Spermatogoniali che accompagnano

l’individuo per tutta la vita mentre le cellule staminali daranno origine ad altre popolazioni di spermatogoni

indifferenziati che in un secondo momento diventano differenziati e la divisione di questi spermatogoni differenzianti

è quello proposto nell’71 da Huckins

darà origine agli spermatozoi. Il modello di studio ancora oggi seguito e Oakberg

(vedi slide)in cui si afferma che deve esistere una popolazione di spermatogoni chiamati AS(stem),i quali vanno

incontro ad una mitosi bivalente danno origine a degli spermatogoni ancora indifferenziati (16) collegati tra loro da

ponti citoplasmatici e si dividono. Oggi si vuole studiare la natura molecolare degli spermatogoni. Attraverso un analisi

dei parametri molecolari condotti sulla nostra specie, è stato ipotizzato che non viene mantenuta una linearità come se

fosse un’unica possibilità definita (one way street) in cui segue l’altra

ci una popolazione di spermatogoni popolazione

di spermatogoni. Nei Roditori fintanto che gli spermatogoni appartengono alla categoria di cellule indifferenziati

organizzati a formare dei ponti citoplasmatici di 16 spermatogoni, quello che si sa è che non è il sedicesimo

spermatogone ad entrare nel compartimento differenziante ma possono entrare anche nel compartimento differenziante

spermatogoni che si trovano in momenti precedenti ( es. allo stadio di 8 cellule che non completano la successiva

divisione per diventare gruppi di 16 spermatogoni).Quindi questa strada che è a senso unico presenta delle vie di uscita

nel momento in cui si verifica un’ insulto alla

laterali per entrare nel compartimento differenziante che si sviluppano

spermatogenesi. Quando si verifica un insulto tossico alla spermatogenesi gli spermatogoni appartenenti al

compartimento staminale che non hanno completato il numero delle mitosi possono dare origine ad una mitosi

ripopolando la spermatogenesi perché nell’individuo

simmetrica entrare direttamente nel compartimento differenziante

adulto la divisione dello spermatogonio è asimmetrica. Quindi la cellula staminale dà origine ad un’altra cellula

staminale che resta nel compartimento staminale e ad una cellula che entra nel compartimento differenziante. Il

passaggio da una tipologia di divisione simmetrica ad una tipologia di divisione asimmetrica e viceversa, determina lo

tipo di compartimento. L’analisi dell’espressione genica degli spermatogoni

schift di spermatogoni verso un altro

appartenenti al compartimento indifferenziato ha confermato il modello anatomico proposto negli anni 70’; attraverso

l’analisi dell’espressione genica si è scoperto che esiste una gerarchia di espressione i cui geni marcatori sono gfra1

Nanog e neurogenina3.Man mano che gli spermatogoni si duplicano fino ad arrivare a 16(numero di spermatogoni),

l’espressione dei geni gfra1 e Nanog si fa via via sempre meno rilevante rispetto al gene per la neurogenina3 la cui

espressione risulta essere più rilevante e a questo punto gli spermatogoni possono entrare nel compartimento

A1 che rappresenta l’ultimo stadio).Ma situazioni di alterazione

differenziante diventando( 16 spermatogoni della

spermatogenesi hanno messo in evidenzia che in realtà ognuno di questi spermatogoni può entrare nel compartimento

alterazione della nicchia all’interno della quale si trova la cellula

differenziante; quindi a seconda della condizione di

staminale e i suoi derivati, gli spermatogoni mantengono una certa plasticità per cui saranno in grado di entrare in

massa nel compartimento differenziante, o di contribuire alla ripopolazione del compartimento staminale; ciò significa

che queste cellule ancora non sono state committed to (non sono state molecolarmente determinate)ad intraprendere una

via di non ritorno perché una volta intrapresa la via di non ritorno le cellule non saranno più sensibili all’ambiente nella

quale si trovano ed è proprio questa la differenza tra una cellula staminale e una cellula determinata; e la differenza sta

nella capacità di modulare i messaggi che vengono dall’ambiente rispondendo in modo tale da cambiare la propria

natura. Nel compartimento indifferenziato ci sono sia gli spermatogoni considerati spermatogoni staminali che gli

spermatogoni connessi tra loro in un contesto sinciziale e solo gli spermatogoni che non hanno subito un alterazione

della spermatogenesi andranno a popolare il compartimento differenziante. Da un ipotesi di lavoro si è dedotto che il

rientro degli spermatogoni nel compartimento staminale possa essere successivo alla frammentazione dei sincizi; perchè

si frammentano si ha la rottura dell’organizzazione tissutale e ognuno

nel momento in cui i sincizi degli spermatogoni

e riacquista la staminalità. Un’altra

precedentemente legati mediante ponti citoplasmatici diventa spermatogone libero

caratteristica delle cellule staminali è il cambiamento della popolazione derivante da un singolo spermatogone mediante

il meccanismo dello scivolamento tra compartimenti poiché ogni popolazione di spermatozoi deriva da un singolo

spermatogonio. Nel caso in cui lo spermatogonio anziché andare incontro a mitosi asimmetrica si divide in modo

simmetrico la popolazione che ne deriva si esaurisce. A questo punto interviene un meccanismo fisiologico in cui lo

dall’altro

spermatogonio staminale colonizza lo spazio lasciato libero spermatogonio. Una serie di studi condotti da

Yoshiba nel 2012 hanno messo in evidenza in un contesto fisiologico che, non è che ogni cellula staminale dà origine

alla sua popolazione di cellule differenziate, ma c’è un continuo rimpiazzamento definito (stem cells reflesment) di

spermatogoni là dove uno spermatogone staminale per qualche motivo è andato incontro ad una mitosi simmetrica

mantenendo il numero di cellule staminali invariato. Molti ricercatori hanno cercato di localizzare gli spermatogoni

staminali definiti spermatogoni A e di definire il contesto dalle nicchie nella quale essi si trovano. Oggi si è al corrente

che gli spermatogoni staminali si trovino nel compartimento basale al di sotto della barriera ematotesticolare e sono a

diretto contatto con le cellule del Sertoli. Le cellule dei vasi sanguigni , del laiding, e quelle mioidi peritubulari insieme

alle cellule del Sertoli contribuiscono a definire la nicchia riccamente vascolarizzata e inoltre mandano dei segnali alla

cellula spermatogoniale. Gli spermatogoni prendono diretto contatto con le laminine della membrana basale mediante

le integrine alfa6 beta1. Ci sono delle molecole come CSF1, GONF, BMP4 FGF2 etc.. che svolgono ruoli diversi; CSF1

è implicato nel self renewal dello spermatogonio altri come FGF2…? sono implicati nella proliferazione e

sopravvivenza degli spermatogoni presenti nel compartimento basale e due fattori in particolare BMP4 e

NEUREGULINA sono importanti nel determinare il transito dalla popolazione Stem che si trova nel compartimento

indifferenziato alla popolazione differenziata presente nel compartimento differenziato. Il testosterone è coinvolto sia

dell’espressione di CSF1

nella maturazione del gamete maschile che nella modulazione in particolare nelle cellule

mioidi anche se è espresso nelle cellule del Sertoli.

Un’ opportunità per lo studio della

spermatogenesi è lo sviluppo di topi

transgenici in modo da creare degli

ibridi in cui all’interno del testicolo siano presenti sia cellule transgeniche che non

transgeniche. A questo punto ci sono due vie di studio: la prima via prevede la disgregazione

di tutto il tessuto testicolare dalla quale si ottiene la generazione di sospensioni cellulari che

l’ individuazione

vengono coltivate in vitro e tra le tante cellule delle cellule ritenute

spermatogoni ; una volta individuate queste cellule vengono trapiantate nel testicolo del topo

e successivamente si verifica nel topo non transgenico se le cellule trapiantate hanno dato

Ma è possibile lavorare direttamente con l’organo coltivandolo

origine alla spermatogenesi.

in vitro in un contesto 3D: che consiste nel costruire dei pezzi di tubulo seminifero o di tubuli

e verificare se all’interno del topolino il

seminiferi in vitro, impiantarli in un topo accettore,

pezzo di organo costruito in vitro darà origine a popolazioni di spermatozoi.

La selezionano degli

spermatogoni dagli altri tipi cellulari avviene mediante frazionamento

(es. con gradiente di ficoll), oppure si incubano tutte le cellule in capsula Petri per 10 minuti in modo che nella capsula

di Petri restano presenti le cellule più pesanti spermatociti e spermatogoni mentre in superficie si depositeranno gli

spermatozoi. Gli spermatogoni una volta selezionati vengono impiantati nel testicolo di un topolino non transgenico si

se c’è stata una colonizzazione

marcano, e si verifica se sono spermatogoni di natura staminale osservando dei tubuli

seminiferi. I tubuli colorati derivano dal topo transgenico e le cellule trapiantate sono spermatogoni staminali perché

sono stati in grado di colonizzare i tubuli seminiferi. In questo esperimento hanno voluto dimostrare se la capacità di

colonizzazione dei tubuli seminiferi da parte degli spermatogoni impiantati dipendesse dal numero delle cellule del

Sertoli.

(SLIDE di un topo in cui il numero di cellule del Sertoli è superiore del 50% rispetto al topo con un numero di cellule

del Sertoli normale). Ciò conferma che la quantità di cellule germinali presenti nel testicolo è in relazione numerica con

le cellule del Sertoli. Un gruppo di ricercatori della Svezia ha sviluppato degli studi dividendo la lunghezza del tubulo

seminifero in quattro zone chiamate :dark spot zone, dark zone, pale zone e

weak spot zone. Con un bisturi hanno tagliato ogni zona di colore diverso

(corrispondono a gradi di maturazione diversa) le hanno disgregate, hanno

verificato che tipi di cellule fossero presenti, e si sono accorti che nella dark spot

zone erano presenti tutte le cellule nello stadio di maturazione 2-6, nella dark zone le

cellule nello stadio di maturazione 3-7-8,nella pale zone le cellule allo stadio di

maturazione finale 9-11 e nella weak spot zone il primo e ultimo stadio di

maturazione 1-12. Quindi si può fare una classificazione delle cellule del tubulo

seminifero in spermatogoni elongated spermatid e spermatid.., spermatociti,

semplicemente con una disgregazione del tubulo seminifero senza colorarle in modo

da selezionare le cellule ritenute spermatogoni.Se si selezionano gli spermatogoni

agli stadi differenziativi es. 9-1-2-4-5-8,con il sistema della transilluminazione(che sfrutta il colore diverso dovuto agli

stadi di maturazione diversi delle cellule del tubulo),e si verifica la frequenza di tubuli seminiferi marcati quello che

emerge( espresso in termini di efficienza di colorazione) è che le cellule staminali in tutti gli stadi di maturazione hanno

una buona capacità di colonizzazione per cui appaiono distribuiti in tutti e 12 gli stadi di maturazione. Anzichè contare

il numero di cellule staminali si misura la lunghezza

della porzione di tubuli colorati, poiché esiste una

differenza statisticamente significativa in termini

numerici tra gli stadi compresi tra il 9 e il 4 rispetto

agli stadi compresi tra il 5 e lo stadio 8, cioè gli

spermatogoni isolati da questi stadi 9-4 danno origine

a una colonia di cellule che possiede una lunghezza

(in termini di capacità di colonizzazione) maggiore

rispetto agli spermatogoni prelevati negli stadi 5 e 8.Una volta selezionati gli spermatogoni ai vari stadi di maturazione,

si coltivano e si verifica la loro capacità nel produrre colonie; come risultato si ottiene che il numero di colonie prodotte

è maggiore se gli spermatogoni selezionati appartengono agli ultimi stadi di maturazione. Nella slide si osservano gli

seminifero.

spermatogoni A distribuiti in tutti e 12 gli stadi di maturazione dell’epitelio In questi stadi gli spermatogoni

differiscono perché nel passaggio tra i vari stadi si passa da una condizione indifferenziata a differenziata in particolare

negli stadi compresi tra il 5 e lo stadio 8.Il passaggio da una condizione indifferenziata

a differenziata è dovuto alla produzione di molecole come il GDNF molecola

Nell’avanzare degli stadi di maturazione l’ambiente

importante del self renewal.

attorno alla cellula cambia, e nello stadio tra il 5 e 8 le cellule del Sertoli mediano il

retinoico che agisce sulle cellule staminali determinando

messaggio dovuto all’acido

un aumento di espressione del gene Stra8.L’aumento dell’espressione di Stra8 insieme

alla neuregulina 3 induce la determinazione dello spermatogone indifferenziato verso

lo spermatogone differenziato. Quindi gli spermatogoni staminali sono tutti presenti,

ma la loro potenzialità cambia a seconda delle associazioni cellulari che si presentano

nell’epitelio e tali associazioni cellulari in particolare i segnali mediati dalle cellule


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226

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76.46 MB

AUTORE

dynasty

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8 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher dynasty di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia dello sviluppo e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof Garagna Silvia.

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