Biologia dello Sviluppo - Appunti

Introduzione alla biologia dello sviluppo

Per sviluppo si intende un processo relativamente lento di cambiamento progressivo negli organismi multicellulari. Anche in alcuni organismi unicellulari coloniali ci sono delle modalità di sviluppo concertato. Lo sviluppo di un topo avviene in 20 giorni di gestazione, e dopo 5 settimane ha raggiunto l'età adulta.

Lo zigote è una singola cellula, l'uovo fecondato, che si divide mitoticamente per produrre tutte le cellule dell'organismo. È il punto di inizio dello sviluppo. Il processo delle prime divisioni dello zigote è un processo molto rapido seguito dall'inizio della differenziazione.

L'embriologia è lo studio dello sviluppo dallo zigote alla nascita. Anche dopo la nascita tuttavia lo sviluppo continua per vario tempo, a seconda della specie.

Questo corso si occuperà di affrontare lo studio dei seguenti argomenti: differenziamento, morfogenesi degli organi, crescita, riproduzione, evoluzione e integrazione ambientale.

Gli approcci con cui si effettua lo studio di questi viene fatto dal punto di vista anatomico, sperimentale e genetico/molecolare. Verranno studiati in questo corso le tipologie di sviluppo delle principali classi di organismi triblastici.

Mappe presuntive

Le mappe presuntive illustrano quale sia il destino delle singole cellule dell'embrione in sviluppo della specie considerata. Per esempio, tramite diversa colorazione, ci indicano i 3 diversi foglietti embrionali: blu l’ectoderma, rosso il mesoderma e giallo l’endoderma.

Tecniche per arrivare ad una mappa presuntiva

• Osservazione dei viventi. Alcuni organismi hanno il vantaggio di essere trasparenti, composti di poche cellule le figlie delle quali rimangono in posizioni adiacenti, quindi “facilmente” individuabili. La mappa presuntiva del tunicato Styela partita è stata tracciata da EG Conklin nel 1905, che seguì il destino dei singoli blastomeri grazie alla loro peculiarità d’essere colorati in modo differente (presenza di pigmento) a seconda del destino.
• Marcatura con coloranti vitali. Coloranti vitali (es. blu Nilo, rosso neutro) colorano le cellule senza ucciderle. Se ne può quindi seguire il destino anche sezionando l’embrione.
• Marcatura con coloranti fluorescenti. Simile alla marcatura con coloranti vitali ma, essendo fluorescenti, non è necessario sezionare l’embrione.
• Marcatura genetica. Costruzione di embrioni “chimera” nel quale le cellule sono geneticamente (quindi fenotipicamente) differenti. Trapianto di cellule di quaglia in embrione di pollo. Trattando poi l’embrione con anticorpi anti molecole di quaglia possiamo poi seguire l’intero sviluppo di una determinata regione.

Tecniche diagnostiche molecolari

Un gene reporter è un gene la cui attività è facilmente monitorabile mediante istochimica o metodi immunologici; esso codifica per un prodotto genico che può essere utilizzato per studiare l’attività di sequenze regolatrici di un altro gene di interesse.

Due esempi di geni reporter sono:

• GAL (β-galattosidasi). La β-galattosidasi è un enzima idrolitico che catalizza nei polisaccaridi noti come beta-galattosidi tramite la rottura dei legami beta-glicosidico. Questo enzima provoca la colorazione delle cellule che lo esprimono quando esse si trovano in un terreno contenente X-Gal (X-galattosio) che idrolizzato genera un prodotto di colore blu. Il problema è che per usare questo gene bisogna uccidere l’embrione e sezionarlo.
• GFP (Green fluorescent protein). La GFP deriva dalla medusa Aequorea victoria. Data la sua capacità di emettere luce dopo esposizione UV, viene usata come marcatore per individuare la locazione di particolari proteine o per studiare l’espressione genica all’interno delle cellule. La sua struttura è organizzata in 11 foglietti β con disposizione a barile che circonda il fluoroforo. Il GFP è compatibile con la vita, non c’è bisogno di distruggere l’embrione. Per attivare questi geni reporter si trasferiscono promotori minimi ed enhancer a monte del gene reporter.

Ibridazione in situ

Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato come un embrione in toto (in quest’ultimo caso si parla whole-mount). È l’unica tecnica che permette di localizzare l’espressione di un dato mRNA a livello delle singole cellule. È ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all’interno di un tessuto, o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata negli studi di biologia dello sviluppo). L’ibridazione in situ ci mostra esattamente in quale cellula o tessuto un certo gene viene trascritto in mRNA. Le sonde sono marcate con digossigenina. Una volta trattato l’embrione con la sonda marcata si lava e si tratta con anticorpi anti digossigenina marcati con la fosfatasi alcalina. Si risciacqua e si aggiunge un substrato fosforilato. A questo punto avremo la colorazione solo dove le sonde si saranno ibridate al mRNA. Però il fatto di avere un mRNA non vuol dire che esso venga poi tradotto in una proteina. Per cercare una determinata proteina in una cellula o in un tessuto usiamo la tecnica dell’immunoistochimica.

Immunoistochimica

L’immunoistochimica è una tecnica che riveste un ruolo molto importante nella routine del laboratorio di anatomia patologica; è in grado infatti di individuare specifiche molecole o strutture del compartimento intra ed extra cellulare. La tecnica immunoistochimica si basa sul principio di coniugazione antigene-anticorpo in addizione poi con sistemi di rivelazione (enzimatici, fluorescenti) che ne rendono visibile l’avvenuta reazione al microscopio.

Cicli della vita a confronto

Ogni animale, dal più semplice al più complesso, passa attraverso stadi di sviluppo simili. Gli stadi compresi tra la fecondazione e la nascita (o schiusa) vengono definiti embriogenesi. Vediamo con particolarità due cicli di 2 organismi modello:

Il ciclo del Dictyostelium discoideum

Questa ameba aploide (dettamixameba) vive sul legno marcescente dove si nutre e si divide per scissione binaria. Quando finiscono le risorse alimentari decine di mixamebe rilasciano una sostanza chemioattrattiva (AMP ciclico) che richiamano altri dictyostelium che si aggregano dando vita ad un organismo pluricellulare chiamato lumaca o pseudoplasmodio. La lumaca comincia a migrare con la parte anteriore leggermente sollevata. Questa parte anteriore è ricca di cellule che espongono sulla superficie molti chemio e foto recettori. Raggiunto il luogo adatto, la migrazione cessa e il pseudoplasmodio si differenzia in un corpo fruttifero in cui le cellule delle comunità si differenziano in: un piede, uno stelo, una teca delle spore e delle cellule quiescenti all’interno della teca pronte per la sporulazione. La teca si romperà e libererà le spore che a loro volta daranno vita alle amebe.

Ciclo degli anfibi: vedremo più precisamente in seguito

Gametogenesi

La gametogenesi comprende i processi di formazione dello spermatozoo e dell’uovo. Oltre a formare il proprio corpo un animale deve mettere da parte le cellule che forniranno il materiale e le istruzioni per generare una prole. Le cellule germinali assicurano la continuità della vita. In molti animali, come insetti, nematelminti e vertebrati si ha una separazione netta e precoce delle cellule germinali dalle cellule somatiche. In questi tipi di organismi le cellule germinali non si originano nelle gonadi ma, i loro precursori, le cellule germinali primordiali (PGC), hanno origine altrove e migrano nelle gonadi dopo il loro sviluppo.

Tappe della gametogenesi

• La formazione del plasma germinale e determinazione delle cellule precursori (PGC)
• La migrazione delle PGC nelle gonadi
• Meiosi
• Differenziamento in spermatozoi ed oociti
• Controllo ormonale sulla maturazione dei gameti

Il plasma germinale, negli insetti e nei nematodi, è un insieme di proteine e mRNA presenti nell’oocita.

Formazione cellule germinali nei nematodi

Il piano di segmentazione della prima divisione è equatoriale e separa il blastomero animale (sopra) da quello vegetativo contenente il plasma germinale (sotto). Le estremità dei cromosomi del blastomero animale si frammentano in dozzine di parti prima che la cellula si divida (riduzione cromosomica). Quando il blastomero animale si dividerà lungo l’asse meridionale formerà 2 cellule che avranno solo una parte del cromosoma originale. Il blastomero vegetale invece si dividerà lungo l'asse equatoriale e quando si verranno a formare 4 blastomeri solo uno (quello situato al polo vegetale) manterrà il plasma germinale. L’altro blastomero vegetativo, quello senza plasma germinale, subirà riduzione cromosomica. Il blastomero vegetativo contenente il plasma germinale, invece, con le divisioni successive, darà origine alla linea germinale. L’unico blastomero dei 4 formati inizialmente che darà origine al tessuto germinale quindi non è soggetto a riduzione cromosomica. Studiando la segmentazione del C. elegans si è scoperto che il differenziamento di quel blastomero con il plasma germinale è dovuto alla presenza di granuli P citoplasmatici in cui vi è conservata una proteina (PIE-1) che inibisce la RNA polII impedendo l'espressione di tutti i geni, tra cui anche quelli legati alla riduzione cromosomica.

Formazione cellule germinali negli insetti

All’inizio dell’oogenesi una cellula germinale si divide quattro volte per produrre 16 cellule, una delle quali diventa oocita e le altre 15 diventano cellule nutrici. L’insieme dell’oocita e delle cellule nutrici è circondato dalle cellule del follicolo ovario per formare la camera dell’uovo. Le cellule follicolari hanno origine somatica. Le cellule nutrici esportano grandi quantità di RNA e di proteine nell’oocita che diventa polarizzato negli assi antero-posteriore e dorso-ventrale. A seguito della fertilizzazione si ha un periodo di rapide e sincrone divisioni nucleari senza “cleavage”: si forma cioè un sincizio con tutti i nuclei che condividono lo stesso citoplasma. Dopo le prime otto divisioni si formano le cellule polari al polo posteriore dell’embrione e da esse si formeranno le cellule germinali. Dopo la nona divisione i nuclei migrano alla periferia per formare il blastoderma sinciziale che dura per altre quattro divisioni cellulari. Quindi i circa 6000 nuclei cellularizzeranno per formare il blastoderma cellulare. Un ruolo importante in questo meccanismo è quello dell'mRNA del gene germ cell-less (gcl) che è trascritto dalle cellule nutrici e trasportato nell'uovo, dove si posiziona nella parte più caudale. Qui viene tradotto in proteina e nelle prime fasi della segmentazione porterà al blocco dell’espressione dei geni delle cellule germinali. La proteina Oskar fa si che tutti gli mRNA e le proteine che andranno a formare il plasma germinale si trovino nella porte caudale della cellula uovo. Al termine gastrulazione le cellule si vengono a trovare nell'intestino embrionale, da cui vengono respinte dal fattore espresso dal gene wunen per affossarsi nel mesoderma, e attratte dal mesoderma mediante il fattore columbus. Wunen e Columbus sono i 2 fattori che regolano la migrazione delle PGC negli insetti.

Formazione delle PGC negli anfibi

A differenza dei precedenti le uova di anfibio hanno una buona quantità di tuorlo, ma anche esse presentano il plasma germinale. Nel polo vegetativo delle uova fecondate si forma il plasma germinale che determinerà la formazione delle PGC. Anche in questo caso ci sono dei granuli, che contengono RNA, proteine a altri fattori analoghi a quelli precedenti, che interferiscono nella trascrizione silenziando la linea germinale. Dopo la gastrulazione le PGC si concentrano nella regione posteriore dell’intestino larvale. Da qui migreranno, seguendo la concentrazione delle chemochine rilasciate dalle gonadi, lungo il lato dorsale dell’intestino finché non raggiungeranno le gonadi. Il percorso delle cellule germinali è costituito da una matrice extracellulare orienta contenente fibronectina. Mentre le PGC migrano si dividono 3 volte.

Formazione delle PGC negli uccelli

Anche in questo caso le PGC si formano dall'ipoblasto e si vengono a trovare nell'intestino primitivo. Si formano in una regione extra-embrionale, nella semiluna germinale. Da questa regione a un certo punto migrano, con una particolare modalità. A differenza degli altri organismi si vanno a inserire nel sistema circolatorio primordiale. Man mano che i vasi sanguigni si formano loro attraversano le pareti dei capillari e entrano nel flusso per un certo tratto, finché non giungono nelle creste germinali. In questo punto percepiscono dei segnali chemiotattici rilasciati dalle creste genitali, oltrepassano l'endotelio dei vasi, i tessuti e si vanno a stabilire tra le cellule delle creste genitali.

Formazione delle PGC nei mammiferi

Nei mammiferi non è presente un plasma germinale evidente. Le cellule germinali sono indotte nell’embrione e si formano nella regione posteriore dell’epiblasto; da qui migreranno verso l’intestino. Dal 9º giorno all'11 si muovono emettendo i filopodi lungo la matrice di fibronectina, e durante il percorso in questo caso sembra che vi siano dei gruppi di cellule che le aiutano meccanicamente e chimicamente, con la secrezione di un fattore proteico (SCF, fattore delle cellule staminali), necessario per la mobilità e la sopravvivenza delle PGC. All'11º giorno entrano nelle creste genitali. Si osserva proliferazione da 10/100 iniziali germinali a 2500/5000 già al 12º giorno di sviluppo. Le PGC devono mantenere la totipotenza. Sembra che questa dipenda dall'espressione di almeno 2 fattori: OCT4 e Nanog. Oct4 è un fattore di trascrizione ed è espresso in tutti i blastomeri durante la segmentazione e durante la gastrulazione la sue espressione sarà limitata solo nelle cellule della regione posteriore dell’epiblasto. In seguito, Oct4, si osserva solo nelle PGC. Nanog, invece, è fondamentale per mantenere la pluripotenza.

Maturazione dei gameti

Una volta arrivate nelle gonadi, le cellule germinali devono produrre gameti aploidi e quindi andranno incontro a meiosi. Riguardare bene le 5 fasi della meiosi 1. Come organismo modello per studiare la meiosi si è usato il C. elegans. Nella sua gonade c’è una zona di cellule che fanno meiosi, una zona di transizione e una zona di mitosi. Queste zone sono controllate da un'unica cellula; la cellula dell’estremo distale, situata all’estremità di ogni gonade. Questa cellula presenta dei lunghi filamenti che penetrano nella gonade e che rilasciano un fattore, GLP-1, che promuove la mitosi e non la meiosi. Quindi questo spiega perché cellule germinali più lontane dalla cellula dell’estremo distale andranno in meiosi mentre quelle più vicine in mitosi. Inoltre in base alla localizzazione queste cellule sono anche destinate a diventare spermatociti o oociti. Le cellule vengono influenzate dal tessuto della gonade stessa a diventare uova maschili o femminili. Questo dipende dalla presenza di determinati fattori proteici, come FEM e GLD-1.

Maturazione dei gameti nell’uomo

Spermatogenesi: una volta che le PGC arrivano alla gonade maschile vengono incorporati nei cordoni sessuali, diventano gonociti e, raggiunta la pubertà, si avvia la spermatogenesi. Anche in questo caso ci sono proteine segnale, come BMP8 che, quando raggiungono un valore soglia, danno il via al processo di spermatogenesi. Lo sviluppo dello spermatozoo va di pari passo con lo sviluppo del tubulo seminifero, in cui sono presenti cellule nutrici e cellule del sertoli, che accompagnano lo sviluppo del gamete. I gonociti si differenziano in spermatogoni di tipo A1. Questi sono cellule staminali si dividono producendo un altro A1 e uno spermatogonio di tipo A2. Gli A2 di divideranno in A3 e poi in A4. L’A4 si differenzia in spermatogonio intermedio, che a sua volta si divide producendo spermatogoni di tipo B. Questi ultimi (quando cala la concentrazione del fattore GDNF) si differenziano in spermatociti primari ovvero le prime cellule che entreranno in meiosi. La prima divisione meiotica porterà la produzione di spermatociti secondari che a loro volta completeranno la meiosi II producendo spermatidi. Perché si formi lo spermatozoo vero e proprio è necessario che lo spermatide vada incontro a modificazioni altamente specializzate per arrivare a una forma in cui è composta solo da un nucleo, una vescicola acrosomica, mitocondri e un flagello. Bisogna aggiungere che in tutte queste fasi di specializzazione, le cellule di ogni corte sono unite tra loro da ponti citoplasmatici che renderanno possibile il passaggio di sostanze nutritive e rendono sincrona la maturazione. Nell'uomo ogni ciclo di spermatogenesi dura 65g 100.000.000 al giorno. Negli spermatozoi i cromosomi sessuali non vengono trascritti.

Oogenesi: nei mammiferi sono prodotte un numero limitatissimo di cellule uovo. Nei primi mesi dopo il concepimento c'è un picco in quantità di oogoni (7M) c'è però poi un brusco crollo del numero dovuto all'apoptosi. Nell'ovogenesi, inizialmente, una cellula chiamata ovogonio, tra il II e il V mese di vita intrauterina fetale, va incontro a divisione mitotica, proliferando e quindi aumentando il suo numero. Tra il V e il VII mese gli ovogoni entrano nella Profase I meiotica dando origine a un ovocita primario. Gli Ovociti primari rimarranno in Profase I, non completando la loro prima divisione meiotica, fino al...