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Per sviluppo si intende un processo relativamente lento di cambiamento progressivo negli

organismi multicellulari. Anche in alcuni organismi unicellulari coloniali ci sono delle

modalità di sviluppo concertato. Lo sviluppo di un topo avviene in 20 giorni di gestazione,

e dopo 5 settimane ha raggiunto l'età adulta.

Lo Zigote è una singola cellula, l'uovo fecondato, che si divide mitoticamente per produrre

tutte le cellule dell'organismo. È il punto di inizio dello sviluppo. Il processo delle prime

divisioni dello zigote è un processo molto rapido seguito dall'inizio della differenziazione.

L'embriologia: è lo studio dello sviluppo dallo zigote alla nascita. Anche dopo la nascita

tuttavia lo sviluppo continua per vario tempo, a seconda della specie.

Questo corso si occuperà di affrontare lo studio dei seguenti argomenti: Differenziamento,

Morfogenesi degli organi, Crescita, Riproduzione, Evoluzione e Integrazione Ambientale.

Gli approcci con cui si effettua lo studio di questi viene fatto dal punto di vista anatomico,

sperimentale e genetico/molecolare. Verranno studiati in questo corso le tipologie di

sviluppo delle principali classi di organismi triblastici.

MAPPE PRESUNTIVE

le mappe presuntive illustrano quale sia il destino delle singole cellule dell'embrione in

sviluppo della specie considerata. Per esempio, tramite diversa colorazione, ci indicano i 3

diversi foglietti embrionali: blu l’ectoderma, rosso il mesoderma e giallo l’endoderma. Le

tecniche per arrivare ad una mappa presuntiva sono:

• Osservazione dei viventi. Alcuni organismi hanno il vantaggio di essere trasparenti,

composti di poche cellule le figlie delle quali rimangono in posizioni adiacenti, quindi

“facilmente” individuabili. La mappa presuntiva del tunicato Styela partita è stata

tracciata da EG Conklin nel 1905 che seguì il destino dei singoli blastomeri grazie

alla loro peculiarità d’essere colorati in modo differente (presenza di pigmento) a

seconda del destino.

• Marcatura con coloranti vitali. Coloranti vitali (es. blu Nilo, rosso neutro) colorano le

cellule senza ucciderle. Se ne può quindi seguire il destino anche sezionando

l’embrione.

• Marcatura con coloranti fluorescenti. Simile alla marcatura con coloranti vitali ma,

essendo fluorescenti, non è necessario sezionare l’embrione.

• Marcatura genetica. Costruzione di embrioni “chimera” nel quale le cellule sono

geneticamente (quindi fenotipicamente) differenti. Trapianto di cellule di quaglia in

embrione di pollo. Trattando poi l’embrione con anticorpi anti molecole di quaglia

possiamo poi seguire l’intero sviluppo di una determinata regione.

TECNICHE DIAGNOSTICHE MOLECOLARE

Un gene reporter è un gene la cui attività è facilmente monitorabile mediante istochimica o

metodi immunologici; esso codifica per un prodotto genico che può essere utilizzato per

studiare l’attività di sequenze regolatrici di un altro gene di interesse. 2 esempi di geni

reporter sono: GAL (β-galattosidasi). La β-galattosidasi è un enzima idrolitico che catalizza

nei polisaccaridi noti come beta-galattosidi tramite la rottura dei legami beta-glicosidico.

Questo enzima provoca la colorazione delle cellule che lo esprimono quando esse si

trovano in un terreno contenente X-Gal (X-galattosio) che idrolizzato genera un prodotto di

colore blu. Il problema è che per usare questa gene bisogna uccidere l’embrione e

sezionarlo; GFP (Green fluorescent protein). La GFP deriva dalla medusa Aequorea

victoria. Data la sua capacità di emettere luce dopo esposizione UV, viene usata come

marcatore per individuare la locazione di particolari proteine o per studiare l’espressione

genica all’interno delle cellule. La sua struttura è organizzata in 11 foglietti β con

disposizione a barile che circonda il fluoroforo. Il GFP è compatibile con la vita, non c’è

bisogno di distruggere l’embrione. Per attivare questi geni reporter si trasferiscono

promotori minimi ed enhancer a monte del gene reporter.

Ibridazione in situ

Questa metodica si basa sull’ibridazione di sonde marcate direttamente su cellule o

tessuti. Si può ibridare su sezioni istologiche o su materiale non sezionato come un

embrione in toto (in quest’ultimo caso si parla whole-mount). E’ l’unica tecnica che

permette di localizzare l’espressione di un dato mRNA a livello delle singole cellule. È

Ideale per studiare i geni espressi in un gruppo ristretto di cellule all’interno di un tessuto,

o i geni la cui espressione è modulata nel tempo e nello spazio (estremamente utilizzata

negli studi di biologia dello sviluppo). L’ibridazione in situ ci mostra esattamente in quale

cellula o tessuto un certo gene viene trascritto in mRNA. Le sonde sono marcate con

digossigenina. Una volta trattato l’embrione con la sonda marcata si lava e si tratta con

anticorpi anti digossigenina marcati con la fosfatasi alcalina. Si risciacqua e si aggiunge un

substrato fosforilato. A questo punto avremo la colorazione solo dove le sonde si saranno

ibridate al mRNA. Però il fatto di avere un mRNA non vuol dire che esso venga poi tradotto

in una proteina. Per cercare una determinata proteina in una cellula o in un tessuto usiamo

la tecnica dell’immunoistochimica.

Immunoistochimica

L’immunoistochimica è una tecnica che riveste un ruolo molto importante nella routine del

laboratorio di anatomia patologica; è in grado infatti di individuare specifiche molecole o

strutture del compartimento intra ed extra cellulare. La tecnica immunoistochimica si basa

sul principio di coniugazione antigene-anticorpo in addizione poi con sistemi di rivelazione

(enzimatici, fluorescenti) che ne rendono visibile l’avvenuta reazione al microscopio.

CICLI DELLA VITA A CONFRONTO

Ogni animale, dal più semplice al più complesso, passa attraverso stadi di sviluppo simili.

Gli stadi compresi tra la fecondazione e la nascita (o schiusa) vengono definiti

embriogenesi. Vediamo con particolarità due cicli di 2 organismi modello:

IL CICLO DEL DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM

Questa ameba aploide (detta

mixameba) vive sul legno

marcescente dove si nutre e si

divide per scissione binaria.

Quando finiscono le risorse

alimentari decine di mixamebe

rilasciano una sostanza chemio

attrattiva (AMP ciclico) che

richiamano altri dictyostelium

che si aggregano dando vita ad

un organismo pluricellulare

chiamato lumaca o

pseudoplasmodio. La lumaca

comincia a migrare con la parte

anteriore leggermente

sollevata. Questa parte

anteriore è ricca di cellule che espongono sulla superficie molti chemio e foto recettori.

Raggiunto il luogo adatto, la migrazione cessa e il pseudoplasmodio si differenzia in un

corpo fruttifero in cui le cellule delle comunità si differenziano in: un piede, uno stelo, una

teca delle spore e delle cellule quiescenti all’interno della teca pronte per la sporulazione.

La teca si romperà e libererà le spore che a loro volta daranno vita alle amebe.

CICLO DEGLI ANFIBI: vedremo più precisamente in seguito

GAMETOGENESI

La gametogenesi comprende i processi di formazione dello spermatozoo e dell’uovo. Oltre

a formare il proprio corpo un animale deve mettere da parte le cellule che forniranno il

materiale e le istruzioni per generare una prole. Le cellule germinali assicurano la

continuità della vita. In molti animali, come insetti, nematelminti e vertebrati si ha una

separazione netta e precoce delle cellule germinali dalle cellule somatiche. In questi tipi di

organismi le cellule germinali non si originano nelle gonadi ma, i loro precursori, le cellule

germinali primordiali (PGC), hanno origine altrove e migrano nelle gonadi dopo il loro

sviluppo. La gametogenesi è divisa in varie tappe:

• la formazione del plasma germinale e determinazione delle cellule precursori (PGC)

• la migrazione delle PGC nelle gonadi

• Meiosi

• Differenziamento in spermatozoi ed oociti

• Controllo ormonale sulla maturazione dei gameti

Il plasma germinale, negli insetti e nei nematodi, è un insieme di proteine e mRNA presenti

nell’oocita.

Formazione cellule germinali nei Nematodi

Il piano di segmentazione della prima divisione è equatoriale e separa il blastomero

animale (sopra) da quello vegetativo contenente il plasma germinale (sotto). Le estremità

dei cromosomi del blastomero animale si frammentano in dozzine di parti prima che la

cellula si divida (riduzione cromosomica). Quando il blastomero animale si dividerà lungo

l’asse meridionale formerà 2 cellule che avranno solo una parte del cromosoma originale.

Il blastomero vegetale invece si dividerà lungo lasse equatoriale e quando si verranno a

formare 4 blastomeri solo uno (quello situato al polo vegetale) manterrà il plasma

germinale. L’altro blastomero vegetativo, quello senza plasma germinale, subirà riduzione

cromosomica. Il blastomero vegetativo contenente il plasma germinale, invece, con le

divisioni successive, darà origine alla linea germinale. L’unico blastomero dei 4 formati

inizialmente che darà origine al tessuto germinale quindi non è soggetto a riduzione

cromosomca. Studiando la segmentazione del C. elegans si è scoperto che il

differenziamento di quel blastomero con il plasma germinale è dovuto alla presenza di

granuli P citoplasmatici in cui vi è conservata una proteina (PIE-1) che inibisce la RNApol

II impedendo l'espressione di tutti i geni, tra cui anche quelli legati alla riduzione

cromosomica.

Formazione cellule germinali negli Insetti

All’inizio dell’oogenesi una cellula germinale si divide quattro volte per produrre 16 cellule,

una delle quali diventa oocita e le altre 15 diventano cellule nutrici. L’insieme dell’oocita e

delle cellule nutrici è circondato dalle cellule del follicolo ovario per formare la camera

dell’uovo. Le cellule follicolari hanno origine somatica. Le cellule nutrici esportano grandi

quantità di RNA e di proteine nell’oocita che diventa polarizzato negli assi antero-

posteriore e dorso-ventrale. A seguito della fertilizzazione si ha un periodo di rapide e

sincrone divisioni nucleari senza “cleavage”: si forma cioè un sincizio con tutti i nuclei che

condividono lo stesso citoplasma. Dopo le prime otto divisioni si formano le cellule polari al

polo posteriore dell’embrione e da esse si formeranno le cellule germinali. Dopo la nona

divisione i nuclei migrano alla periferia per formare il blastoderma sinciziale che dura per

altre quattro divisioni cellulari. Quindi i circa 6000 nuclei cellularizzeranno per formare il

blastoderma cellulare (vedi più avanti). Un ruolo importante in questo meccanismo è

quello dell'mRNA del gene germ cell-less (gcl) che è trascritto dalle cellule nutrici e

trasportato nell'uovo, dove si posiziona nella parte più caudale. Qui viene tradotto in

proteina e nelle prime fasi della segmentazione porterà al blocco dell’espressione dei geni

delle cellule germinali. La proteina Oskar fa si che tutti gli mRNA e le proteine che

andranno a formare il plasma germinale si trovino nella porte caudale della cellula uovo. Al

termine gastrulazione le cellule si vengono a trovare nell'intestino embrionale, da cui

vengono respinte dal fattore espresso dal gene wunen per affossarsi nel mesoderma, e

attratte dal mesoderma mediante il fattore columbus. Wunen e Columbus sono i 2 fattori

che regolano la migrazione delle PGC negli insetti.

Formazione delle PGC negli anfibi

A differenza dei precedenti le uova di anfibio hanno una buona quantità di tuorlo, ma

anche esse presentano il plasma germinale. Nel polo vegetativo delle uova fecondate si

forma il plasma germinale che determinerà la formazione delle PGC. Anche in questo caso

ci sono dei granuli, che contengono RNA, proteine a altri fattori analoghi a quelli

precedenti, che interferiscono nella trascrizione silenziando la linea germinale. Dopo la

gastrulazione le PGC si concentrano nella regione posteriore dell’intestino larvale. Da qui

migreranno, seguendo la concentrazione delle chemochine rilasciate dalle gonadi, lungo il

lato dorsale dell’intestino finché non raggiungeranno le gonadi. Il percorso delle cellule

germinali è costituito da una matrice extracellulare orienta contenente fibronectina. Mentre

le PGC migrano si dividono 3 volte.

Formazione delle PGC negli uccelli

Anche in questo caso le PGC si formano dall'ipoblasto e si vengono a trovare nell'intestino

primitivo. Si formano in una regione Extra-embrionale, nella semiluna germinale. Da

questa regione a un certo punto migrano, con una particolare modalità. A differenza degli

altri organismi si vanno a inserire nel sistema circolatorio primordiale. Man mano che i vasi

sanguigni si formano loro attraversano le pareti dei capillari e entrano nel flusso per un

certo tratto, finché non giungono nelle creste germinali. In questo punto percepiscono dei

segnali chemiotattici rilasciati dalle creste genitali, oltrepassano l'endotelio dei vasi, i

tessuti e si vanno a stabilire tra le cellule delle creste genitali.

Formazione delle PGC nei mammiferi

Nei mammiferi non è presente un plasma germinale evidente. Le cellule germinali sono

indotte nell’embrione e si formano nella regione posteriore dell’epiblasto; da qui

migreranno verso l’intestino. Dal 9° giorno all'11 si muovono emettendo i filopodi lungo la

matrice di fibronectina, e durante il percorso in questo caso sembra che vi siano dei gruppi

di cellule che le aiutano meccanicamente e chimicamente, con la secrezione di un fattore

proteico (SCF, fattore delle cellule staminali), necessario per la mobilità e la sopravvivenza

delle PGC. All'11° giorno entrano nelle creste genitali. Si osserva proliferazione da 10/100

iniziali germinali a 2500/5000 già al 12° giorno di sviluppo. Le PGC devono mantenere la

totipotenza. Sembra che questa dipenda dall'espressione di almeno 2 fattori: OCT4 e

Nanog. Oct4 è un fattore di trascrizione ed è espresso in tutti i blastomeri durante la

segmentazione e durante la gastrulazione la sue espressione sarà limitata solo nelle

cellule della regione posteriore dell’epiblasto. In seguito, Oct4, si osserva solo nelle PGC.

Nanog, invece, è fondamentale per mantenere la pluripotenza.

MATURAZIONE DEI GAMETI

Una volta arrivate nelle gonadi, le cellule germinali devono produrre gameti aploidi e quindi

andranno incontro a meiosi. Riguardare bene le 5 fasi della meiosi 1.

Come organismo modello per studiare la meiosi si è usato il C. elegans. Nella sua gonade

c’è una zona di cellule che fanno meiosi, una zona di transizione e una zona di mitosi.

Queste zone sono controllate da un'unica cellula; la cellula dell’estremo distale, situata

all’estremità di ogni gonade. Questa cellula presenta dei lunghi filamenti che penetrano

nella gonade e che rilasciano un fattore, GLP-1, che promuove la mitosi e non la meiosi.

Quindi questo spiega perché cellule germinali più lontane dalla cellula dell’estremo distale

andranno in meiosi mentre quelle più vicine in mitosi. Inoltre in base alla localizzazione

queste cellule sono anche destinate a diventare spermatociti o oociti. Le cellule vengono

influenzate dal tessuto della gonade stessa a diventare uova maschili o femminili. Questo

dipende dalla presenza di determinati fattori proteici, come FEM e GLD-1.

Maturazione dei gameti nell’uomo

Spermatogenesi: una volta che le PGC arrivano alla gonade maschile vengono

incorporati nei cordoni sessuali, diventano gonociti e, raggiunta la pubertà, si avvia la

spermatogenesi. Anche in questo caso ci sono proteine segnale, come BMP8 che, quando

raggiungono un valore soglia, danno il via al processo di spermatogenesi. Lo sviluppo

dello spermatozoo va di pari passo con lo sviluppo del tubulo seminifero, in cui sono

presenti cellule nutrici e cellule del sertoli, che accompagnano lo sviluppo del gamete. I

gonociti si differenziano in spermatogoni di tipo A1. Questi sono cellule staminali si

dividono producendo un altro A1 e uno spermatogonio di tipo A2. Gli A2 di divideranno in

A3 e poi in A4. L’A4 si differenzia in spermatogonio intermedio, che a sua volta si divide

producendo spermatogoni di tipo B. Questi ultimi (quando cala la concentrazione del

fattore GDNF) si differenziano in spermatociti primari ovvero le prime cellule che

entreranno in meiosi. La prima divisione meiotica porterà la produzione di spermatociti

secondari che a loro volta completeranno la meiosi II producendo spermatidi. Perché si

formi lo spermatozoo vero e proprio è necessario che lo spermatide vada incontro a

modificazioni altamente specializzate per arrivare a una forma in cui è composta solo da

un nucleo, una vescicola acrosomica, mitocondri e un flagello. Bisogna aggiungere che in

tutte queste fasi di specializzazione, le cellule di ogni corte sono unite tra loro da ponti

citoplasmatici che renderanno possibile il passaggio di sostanze nutritive e rendono

sincrona la maturazione. Nell'uomo ogni ciclo di spermatogenesi dura 65g 100.000.000 al

giorno. Negli spermatozoi i cromosomi sessuali non vengono trascritti.

Oogenesi: nei mammiferi sono prodotte un numero limitatissimo di cellule uovo. Nei primi

mesi dopo il concepimento c'è un picco in quantità di oogoni (7M) c'è però poi un brusco

crollo del numero dovuto all'apoptosi. Nell'ovogenesi, inizialmente, una cellula chiamata

ovogonio, tra il II e il V mese di vita intrauterina fetale, va incontro a divisione mitotica,

proliferando e quindi aumentando il suo numero. Tra il V e il VII mese gli ovogoni entrano

nella Profase I MEIOTICA dando origine a un ovocita primario. Gli Ovociti primari

rimarranno in Profase I ,non completando la loro prima divisione Meiotica, fino al

raggiungimento della Pubertà. La meiosi I , di carattere riduzionale, genera due cellule

aploidi, l’ovocita secondario e il globulo polare primario; la meiosi II, equazionale, divide il

globulo polare primario in due globuli polari secondari e l'ovocita secondario in un ovotidio

e un terzo globulo polare secondario. Nel complesso, il processo dà origine ad un ovotidio,

che va in corso a maturazione, e a tre globuli polari, i quali sono più piccoli di dimensioni

rispetto all'ovotidio e hanno il solo scopo di permettere la meiosi; alla fine del processo

essi vengono riassorbiti. Nel ciclo di 28 giorni (nella specie umana) avviene una sola volta

l'ovogenesi, dopodiché, se non viene fecondato, l'ovulo è espulso con la mestruazione.

Finché non avviene la fecondazione da parte dello spermatozoo, l'ovocita primario svolge

solo la meiosi I; quando avviene la fecondazione, l'ovocita secondario e il corpuscolo

polare svolgono la meiosi II dando vita ai tre globuli polari e all'ovotidio. L’ovotidio o oocita

è molto attivo nella trascrizione perché alle prime fasi dello zigote questo rimane inerte per

quanto riguarda la trascrizione e vengono trascritti solo gli mRNA materni.

Nella donna il rilascio dell’oocita è controllato dall’ormone ipotalamico GRH. Questo

stimolerà l’ipofisi e il rilascio di FSH (follicolo stimolante) ed LH (luteinizzante). Vedere

regolazione del ciclo mestruale.

Maturazione dei gameti nelle rane

Nei primi 2 anni, l’oocita si accresce in modo molto graduale. Nel terzo anno, invece, il

rapido accumulo di tuorlo nell’oocita determina un aumento dimensionale. La componente

principale del tuorlo è la Vitellogenina, una proteina di 470kd prodotta nel fegato della

madre che viene trasportata nella cellula uovo. Durante la vitellogenesi si moltiplicano

anche i mitocondri e altri organelli. Al termine il citoplasma è stratificato. La maturazione

dell’oocita si arresta alla fase di diplotene nella prima profase meiotica. Il progesterone,

tramite una cascata di fosforilazioni, attiva la proteina MPF che a sua volta riattiva la

meiosi producendo un oocita e un corpo polare. Alla fine della prima meiosi avviene

l’ovulazione. La maturazione dell’oocita tuttavia incontra un altro blocco e si interrompe

nella seconda metafase meiotica. CSF è la proteina che blocca la seconda miosi e questa

proteina viene degradata una volta avvenuta la fecondazione. Una volta entrato lo

spermatozoo, il calcio rilasciato dal RE, attiverà una calmodulina che degraderà il CSF

riattivando la meiosi. LA FECONDAZIONE

La fecondazione è un fenomeno della riproduzione sessuata anfigonica, che consiste nella

unione di due gameti di sesso diverso e nella fusione dei loro nuclei. Il risultato della

fecondazione è una nuova cellula, diversa dai gameti e unica nella sua specie, chiamata

zigote. La fecondazione può essere di due tipi: esterna e interna. Esterna: solo in acqua;

l'ambiente acquatico consente all'individuo di rilasciare i gameti in modo che il partner al

momento opportuno sia in grado di raccoglierli. La fecondazione in ambiente acquatico

richiede una notevole emissione di gameti e un dispendio di energie molto alto con

conseguente rischio di insuccesso. Interna: i gameti maschili vengono rilasciati

direttamente nell'apparato femminile. Basso dispendio energetico, alte probabilità di

successo. Altro tipo di fecondazione: interna indiretta. Questa è molto comune nei

crostacei, negli anfibi e nei cefalopodi. Le spermatofore (una sacca contenente gli

spermatozoi dell'individuo) vengono asportate dal corpo del maschio e traslocate nel

corpo della femmina, la quale le conserverà finché non ne avrà bisogno per la

fecondazione.

ESEMPIO DI FECONDAZIONE ESTERNA: gli echinodermi (riccio di mare)

Lo spermatozoo è formato da un flagello, un collo ricco di mitocondri e una testa nel quale

troviamo un nucleo, l’actina e l’acrosoma. L’uovo è invece circondato da uno strato

gelatinoso, subito dopo troviamo la membrana vitellina e poi la membrana plasmatica

dell’uovo. In acqua gli spermatozoi sono attratti dalle uova della loro specie per

chemiotassi, vale a dire seguendo il gradiente di concentrazione di una sostanza. Questa

sostanza è principalmente ricca di piccoli peptidi chiamati Resact che vengono rilasciati

dalle uova. Resact è specie specifico. Quando lo spermatozoo raggiunge lo strato

gelatinoso i recettori posti sulla sua testa legano speciali zuccheri presenti nella gelatina e

questo contatto, anch’esso specie specifico, da il via alla reazione acrosomale. La

reazione acrosomale ha 2 componenti: la fusione della vescicola acrosomale con la

membrana dello spermatozoo e la formazione del processo acrosomale. La fusione della

vescicola causa il rilascio di speciali enzimi che scavano un percorso all’interno dello

strato gelatinoso fino alla superficie dell’uovo. Il processo acrosomale invece non è altro

che la polimerizzazione dell’actina all’interno della testa che, allungandosi, espone solo

sulla testa delle specifiche proteine chiamate bindine. Le bindine si trovavano inizialmente

all’interno, sul fondo, della vescicola acrosomale. Una volta che lo spermatozoo raggiunge

la membrana vitellina le bindine verranno legate da recettori specie specifici posti appunto

sulla membrana e questo legame darà inizio alla fusione dello spermatozoo con la

membrana cellulare dell’uovo. L’actina all’interno del processo acrosomale tirerà all’interno

dell’uovo il nucleo dello spermatozoo.

ESEMPIO DI FECONDAZIONE INTERNA: i mammiferi (topo)

L’uovo è avvolto da una zona pellucida (o membrana vitellina) e dal cumulo ooforo. Lo

spermatozoo è formato da un flagello, un collo contenente i mitocondri e una testa

contenente il nucleo e l’acrosoma. La testa non è arrotondata come i protozoi del riccio di

mare ma è a punta di freccia.

Lo spermatozoo con l’acrosoma ancora integro passa attraverso lo strato del cumulo

ooforo e si lega alla zona pellucida, che è più spessa della membrana vitellina del riccio di

mare. A contatto con la zona pellucida avviene la reazione acrosomale; lo spermatozoo si

apre un passaggio nella zona pellucida e aderisce all’uovo e le membrane cellulari si

fondono.

la capacità di traslocazione è uno dei requisiti della cellula di spermatozoo. Lo

spermatozoo dei mammiferi deve arrivare al terzo medio dell'ovidotto, dove avviene la

fecondazione. Deve avere quindi un'ottima motilità flagellare, aiutata dall'attività muscolare

uterina. L’insieme di modificazioni fisiologiche che permettono alla cellula spermatica di

essere competente alla fecondazione prendono il nome di capacitazione. Appena le cellule

spermatiche raggiungono l'ampolla dell'ovidotto, acquisiscono la competenza ma, se si

trattengono troppo nei dintorni, la perdono. Gli eventi di modificazione di tipo capacitativo

sono: modificazioni della fluidità della membrana, date dall’aumento di colesterolo del

doppio strato fosfolipidico; rimozione di molecole di superficie, come alcune che bloccano

l'accesso all'oocita dello spermatozoo (non ancora provato). Se si rimuovessero troppo

presto tuttavia lo spermatozoo non raggiungerebbe il tasso di fluidità opportuno per la

fusione. Questa propensione alla fusione è anche garantita da una perdita di potenziale

mediante fuoriuscita di ioni K, altro fattore che facilita la fusione. Infine la fosforilazione

delle molecole di superficie aiuta la fusione delle membrane gametiche. Le pareti

dell'ovidotto femminile secernono dei fattori solubili che attivano gli spermatozoi. In più

l’oocita secerne sostanze chemiotattiche che attraggono lo spermatozoo; queste sostanze

sono dei peptidi molto simili ai Resact del riccio di mare.

Nei mammiferi la zona pellucida è quella attraversata dallo spermatozoo sfruttando la

reazione acrosomale. Sulla zona pellucida è stata scoperta una proteina codificata dal

gene Zp3. Insieme alla proteina Zp3 vi sono le Zp2, e Zp1. Sono molecole che formano

polimeri associati a catene molto attorcigliate fra loro, costituiti da monomeri globulari Zp2

e Zp3 alternati a formare catene, le quali sono unite da proteine fibrose Zp1. La Zp3 è

dotata di molti residui saccaridici antigenici. Si è immaginato infatti che una certa

specificità vi fosse anche per i mammiferi, data dalla presenza di questi residui glicosidici

presenti sulle proteine in questione. Si crede che questi residui glicosidici siano essenziali

per l'interazione dello spermatozoo sull'oocita. Zp3 è quindi il recettore, che attraverso i

residui, riconosce i ligandi esposti sulla superficie dello spermatozoo. Mediante un saggio

di inibizione si è visto che del complesso Zp, è la proteina Zp3 quella maggiormente

coinvolta nel riconoscimento e in particolare sono proprio i residui glicosidici a mediare il

riconoscimento. Nei mammiferi, non essendoci il processo acrosomale, è molto importante

che l'adesione dello spermatozoo avvenga con la disposizione più efficace, cioè

lateralmente, per garantire una maggior superficie di contatto, e non di punta.

BLOCCO DELLA POLISPERMIA

Se per caso dovessero entrare 2 spermatozoi nell'oocita invece che uno avverrà uno

sviluppo aberrante che impedisce la normale distribuzione cromosomica e porta alla morte

dell'embrione. Quando (18n) in un oocita di riccio di mare entrano 2 pronuclei (con i 2

centrioli associati) si formano 2 fusi mitotici. Quando avverrà la prima divisione e poi le

successive divisioni, le cellule figlie avranno tutti cromosomi diversi portando alla morte

dell’embrione. Il primo blocco alla polispermia è un aumento del potenziale di membrana

di 90mV quando il primo spermatozoo riesce a penetrare nell’oocita. Dopo circa 60s il

potenziale di membrana comincia a tornare verso valori negativi. Gli ioni sodio entrano

nell'oocita e causano un gradiente osmotico. Questa situazione, molto critica, dev'essere

bloccata in breve tempo per consentire all'oocita di recuperare il potenziale netto negativo

di membrana. Guardando con il SEM la superficie di un oocita di riccio di mare si potrà

vedere che questa è puntinata per via della presenza di vescicole subito sotto la

membrana molto ricche di elementi proteici, sovrastate anche da microvilli. Le strutture

vescicolari sono chiamati “granuli corticali”. Questi granuli corticali sono responsabili del

secondo blocco alla polispermia, più lento ma più strutturato rispetto al primo. In ogni

oocita ce ne sono circa 10k sotto la superficie di membrana. Affinché avvenga qualche

reazione tra questi granuli e l'ambiente, che porti alla formazione di un nuovo rivestimento

che impedisca l'accesso di tutti gli altri spermatozoi dopo che il primo è entrato, ci vuole un

minuto. Si tratta di un meccanismo di esocitosi che porta al rilascio di una buona quantità

di sostanze che consentiranno un cambio di destinazione chemiotattico e meccanico a tutti

gli spermatozoi circostanti. La reazione avviene in un minuto esatto, e si può osservare il

repentino allontanamento di tutti gli spermatozoi presenti sull'oocita che cercano di

entrarvi. La reazione dei granuli corticali avviene nel minuto necessario a ricostituire il

potenziale di membrana dell'oocita. I granuli corticali sfruttano un particolare meccanismo

chimico per andare a costituire rapidamente il nuovo involucro. I granuli corticali

contengono:

• proteasi: tagliano le proteine che connettono la membrana vitellina alla m.

plasmatica. Inoltre taglia tutti i recettori della bindina impedendo a tutti gli

spermatozoi di riconoscerla.

• Mucopolisaccaridi: sono sostanze molto dense e vischiose che per osmosi

richiamano acqua. Questo fa si che avvenga l'elevazione della membrana vitellina

che si stacca.

• enzima perossidasi: questo enzima induce dei legami trasversali sui residui

tirosinici di molte delle proteine componenti la membrana di fecondazione

aumentando la resistenza

• proteina ialina: provvede al rivestimento più interno e vicino all'ovulo, rendendo

omogenea la superficie dell'oocita compensando i dislivelli dati dai microvilli.

Questa regione è molto importante nel conferire la giusta rigidità (o plasticità) alla

membrana nello sviluppo.

Anche nei mammiferi si assiste alla formazione di una membrana di fecondazione, in cui

interviene l'enzima N-acetilglucosamminasi

Il rilascio delle vescicole (granuli corticali) è stimolato dall'onda di depolarizzazione di

membrana dovuta all'ingresso degli ioni sodio a livello del poro di entrata del primo

spermatozoo. Le propaggini più esterne del reticolo endoplasmatico mediano il rilascio di

grandi quantità di calcio (stimolata dalla depolarizzazione di membrana) nel citoplasma. Il

calcio si diffonde quindi lungo la regione corticale stimolando il rilascio dei granuli.

L'involucro di fecondazione diventa la struttura protettiva dell'intero embrione e perdurerà

fino a un grado di sviluppo tale da consentire il nutrimento autonomo dell'embrione, che

romperà l'involucro e uscirà nell'ambiente esterno. Una seconda ondata di rilascio del

calcio gioca un ruolo essenziale nell'accompagnare il nucleo spermatico verso il centro,

per la cariogamia. Infatti gli ioni calcio presenti nel citoplasma rimuoveranno gli inibitori

posti sugli mRNA materni presenti nell’oocita. Questi, tradotti, daranno il via alla fusione

dei 2 pronuclei aploidi e alla segmentazione. Nel riccio di mare una volta che lo

spermatozoo è entrato nell’oocita perderà il flagello e il suo centriolo comincerà a produrre

dei microtubuli che si allungheranno fino ad avere contatto con il pronucleo femminile. A

questo punto i 2 pronuclei migrano l’uno verso l’altro unendosi in uno zigote. Nei

mammiferi, quando lo spermatozoo penetra, il nucleo dell’oocita è bloccato nella metafase

della seconda divisione meiotica. L’ingresso dello spermatozoo fa si che si attivino delle

chinasi che riavvieranno la meiosi portandola al completamento e alla formazione di un

pronucleo femminile. Nei mammiferi i 2 pronuclei che si incontrano non si fonderanno

subito in uno zigote, ma il vero e proprio zigote lo avremmo alla stadio di 2 blastomeri.

Nell’oocita dell’anfibio xenopus possono essere ben distinti il polo vegetativo e il polo

animale in quanto quest’ultimo ha una pigmentazione scura rispetto al colore grigiastro del

polo vegetativo. Quando uno spermatozoo penetra nell’oocita e dopo che si avviano tutti i

movimenti citoplasmatici per la fusione dei 2 pronuclei e per la prima divisione dello zigote,

la calotta scura del polo animale ruota di 30° lasciando, nella parte opposta al punto di

penetrazione dello spematozoo, una semiluna grigia.

SEGMENTAZIONE E GASTRULAZIONE

SEGMENTAZIONE: processo durante il quale, mediante una serie di divisioni mitotiche,

l’enorme volume del citoplasma dell’uovo si divide in numerose piccole cellule nucleate, i

blastomeri. Il risultato finale è una blastula

GASTRULAZIONE: processo di movimento cellulare e tissutale mediante il quale le cellule

della blastula sono riarrangiate in modo drammatico.

Dal punto di ingresso dello spermatozoo (che ricordiamo è in una regione predeterminata)

è parte un riarrangiamento vistoso del citoscheletro che in qualche modo fa ruotare la

parte più corticale del citoplasma su un lato della cellula. Negli embrioni di anfibio questo

movimento consente di scoprire una zona di citoplasma mediana rispetto ai poli (animale e

vegetativo) con una pigmentazione intermedia definita “semiluna grigia”. La comparsa

della semiluna grigia indica l'avvenuta fecondazione. Attualmente si è capito che la

regione di semiluna grigia (sito opposto rispetto alla fecondazione) è la regione di maggior

importanza dei processi di sviluppo: da li comincia lo sviluppo dell'embrione. Si crea una

fascia di citoscheletro (accompagnato dal flusso di calcio) lungo tutto il percorso che il

nucleo maschile dovrà compiere per arrivare a fondersi con quello femminile. La semiluna

grigia marca la regione dello zigote nella posizione opposta al sito di ingresso dello

spermatozoo, in cui avviene il rimescolamento di segnali citoplasmatici tali da lasciare in

quella porzione, le indicazioni che verranno lette dal blastomero che andrà a contenere

quella porzione di citoplasma e che gli consentiranno di dare il via a tutte le divisioni e

movimenti della gastrulazione. La fase iniziale di sviluppo embrionale è infatti la

segmentazione, seguita dalla complessa fase di gastrulazione, in cui non c'è un

esponenziale aumento di cellule (come nella segmentazione) ma c'è un generale aumento

di complessità delle cellule già presenti, che vanno a effettuare una prima specializzazione

e andranno a dare luogo ai movimenti gastrulari. È nella fase di gastrulazione che

comincia la trascrizione degli mRNA embrionali e non materni.

Le segmentazioni si di 2 tipi:

OLOBLASTICA: le divisioni riguardano tutto l'embrione suddividendolo in tanti blastomeri

completando tutte le divisioni. La segmentazione oloblastica è appannaggio di: 1) uova

isolecitiche; cioè quelle uova in cui il tuorlo è disposto uniformemente nel citoplasma e

non vi è una netta distinzione tra polo animale e vitellino (nucleo al centro). La

segmentazione qui può essere radiale, se avviene con 3 piani principali di divisione,

spirale, come per anellidi molluschi e platelminti, bilaterale per i tunicati, rotazionale per

mammiferi e nematodi (convergenza evolutiva). 2) uova mesolecitiche: con un moderato

polo vitellino derivato dalla prima segmentazione sul piano equatoriale che avviene in una

porzione più vicina al polo animale.

MEROBLASTICA: Il solco di segmentazione non penetra nella regione ricca di vitello: 1)

uova telolecitiche: la segmentazione avviene alle estremità dei primi setti di divisione, i

quali non portano a completamento la separazione di primi blastomeri (segmentazione

bilaterale). Nei cefalopodi questa porzione indivisa rimane come una capsula che circonda

l'embrione che si sviluppa al centro. In pesci uccelli e rettili le divisioni del polo animale

vengono portate a termine mentre quelle del polo vitellino no (segmentazione discoidale);

2) uova centrolecitiche: il tuorlo si dispone attorno al nucleo e il citoplasma attivo è

spostato in periferia. Negli insetti avviene il contrario rispetto ai cefalopodi, lasciando un

tuorlo centrale con una segmentazione “superficiale”.

Nella gastrulazione, invece, riconosciamo 5 movimenti principali: invaginazione

(ripiegamento all’interno di una regione di cellule); embolia o involuzione ( introflessione

di uno strato cellulare esterno in espansione, che scivola e si distribuisce lungo la

superficie interna); ingresso (migrazione di singole cellule dallo strato superficiale verso

l’interno); delaminazione (divisione di una lamina cellulare in 2 o più lamine parallele);

epibolia (movimenti di lamine di cellule epiteliali che si distendono in gruppo unito a

racchiudere gli starti interni).

SEGMENTAZIONE E GASTRULAZIONE NEGLI ECHINODERMI

Dopo la fecondazione lo zigote è pronto per entrare nel successivo stadio del ciclo vitale.

La segmentazione. Le uova dell'echinoderma riccio di mare sono isolecitiche, quindi

vanno incontro a segmentazione oloblastica radiale, cioè la formazione del solco di

segmentazione coinvolgerà completamente lo zigote. Il primo piano di segmentazione è

meridiano e attraversa il polo animale-vegetativo, il fuso mitotico è disposto all'equatore

della cellula ed è orientato perpendicolarmente all'asse animale vegetativo, lo zigote viene

suddiviso in due cellule (blastomeri) di uguali dimensioni. Il secondo piano di

segmentazione è sempre meridiano ma perpendicolare al precedente, ciò porta alla

formazione di quattro blastomeri di uguali dimensioni. Il terzo piano di segmentazione è

equatoriale, portando così alla formazione di otto blastomeri; quattro al polo animale e

quattro al polo vegetativo. Durante la quarta divisione, i blastomeri del polo animale si

dividono secondo un piano meridiano portando alla formazione di otto blastomeri di media

grandezza noti come mesomeri (daranno vita all’ectoderma). I fusi mitotici dei blastomeri

dell'emisfero vegetativo sono invece fortemente spostati vero il margine del polo

vegetativo, e il piano di segmentazione è equatoriale, portando alla formazione di

blastomeri di grandezza diversa che chiameremo macromeri (daranno vita all’endoderma)

quelli più grandi e micromeri (daranno vita al mesoderma e saranno importantissimi per i

movimenti gastrulatori) quelli più piccoli. Durante la quinta divisione di segmentazione, i

blastomeri del polo animale si dividono sempre secondo un piano di divisione meridiano

portando alla formazione di due file di bastomeri noti come an1 e an2. I macromeri si

dividono invece secondo un piano di divisione meridiano portando alla formazione di una

fila di otto macromeri; i micromeri si dividono equatorialmente e in maniera diseguale

portando alla formazione di micromeri di grandezza diversa, noti come grandi micromeri e

piccoli micromeri. La sesta divisione di segmentazione porterà alla formazione di un

embrione di 60 cellule. Durante tale divisione le cellule del polo animale si dividono

secondo piani di divisione meridiani, i macromeri del polo vegetativo si dividono secondo

piani di divisione equatoriali, portando alla formazione di due file di blastomeri che

chiameremo veg1 e veg2; i micromeri più grandi andranno incontro a divisione cellulare

mentre i piccoli micromeri salteranno questo ciclo di divisione cellulare. Con il proseguire

delle divsioni l'embrione raggiungerà lo stadio di blastula (128 blastomeri) caratterizzata

dalla presenza di un ampia cavità nota come blastocele una cavità piena di fluido proteico

che rappresenta la prima cavità dell'embrione. Con il proseguire delle divisioni le cellule

del polo animale si dispongono in un unico strato portando alla formazione del

blastoderma che delimita il blastocele. In seguito sulla superficie dei blastomeri del polo

animale si vengono a creare numerose ciglia particolarmente lunghe che danno la

possibità all'embrione di ruotare all'interno della membrana di fecondazione, le cellule del

polo vegetativo invece iniziano ad ispessirsi portando alla formazione di una piasta

vegetativa. Inoltre le cellule dell'emisfero animale iniziano a sintetizzare e rilasciare

specifici enzimi che avranno la funzionalità di degradare la membrana di fecondazione,

una volta che ciò sarà avvenuto l'embrione sarà libero di nuotare nell'ambiente marino

circostante e continuare il suo sviluppo.

La capacità induttrice dei micrometri

Il destino dei blastomeri del riccio di mare allo stadio di blastula è acquisito per

specificazione condizionata. Le uniche cellule che sono specificate in modo autonomo

sono i micromeri, che formano lo scheletro. Infatti se vengono isolati, posti in provetta e

lasciati sviluppare formeranno delle spicole scheletriche. I micromeri hanno anche notevoli

capacità induttrice. Se vengono trapiantati nella regione animale della blastula essi

inducono un sito secondario di gastrulazione, si invaginano nel blastocele formando una

nuova serie di cellule di mesenchima primario e inducono le cellule animali con cui sono in

contatto a diventare cellule endodermiche della piastra vegetativa. In conclusione

inducono un asse secondario. Se la metà animale di un embrione di riccio di mare viene

isolata e lasciata sviluppare non gastrula e dà origine ad un embrione di forma sferica

costituito da cellule ectodermiche ciliate, privo di strutture endodermiche e mesodermiche,

che prende il nome di blastula animalizzata (dauerblastula). Se si ricombinano micromeri

isolati con la calotta animale isolata, i micromeri inducono le cellule della calotta animale a

formare strutture endodermiche e mesodermiche; si svilupperà quindi una larva quasi

normale.

Al centro della piastra vegetativa neoformata della blastula, piccole cellule, che derivano

dai micromeri, cominciano a mostrare movimenti pulsanti sulla loro superficie, che

espande e ritrae lunghi e sottili processi chiamati fillopodi, successivamente esse si

isolano l'una dall'altra e migrano all'interno del blastocele, andando a formare il

mesenchima primario; quindi si localizzano nella regione ventrale del blastocele, danno

origine a delle spicole scheletriche e si fondono in un cordone sinciziale che formerà l'asse

dello scheletro di carbonato di calcio del pluteo. Quando le cellule del mesenchima

primario perdono il contatto con il blastoderma i microtubuli si distribuiscono

disordinatamente, successivamente penetrano nei fillopodi delle cellule migranti e più tardi

si troveranno nei cordoni sinciziali. Dopo l'ingressione delle cellule mesenchimali la piastra

vegetativa si appiattisce sempre più, successivamente si piega e si estende verso l'interno

per un terzo dello spazio disponibile. Quindi l'invaginazione cessa improvvisamente. La

regione invaginata è chiamata archenteron e l'apertura dell'archenteron blastoporo. Dopo

una breve pausa comincia la seconda fase della formazione dell'archenteron. Si formano

le cellule del mesenchima secondario sulla cupola dell'archenteron. Da queste cellule si

sviluppano dei fillopodi che si allungano nel liquido del blastocele fino a prendere contatto

con la superficie interna della parete del blastocele. I fillopodi si ancorano prima, in zone

specifiche del blastocele, alla parete delle giunzioni fra le cellule, quindi si accorciano. Nel

punto di contatto dell'archenteron con la parete si formerà la bocca, mentre il blastoporo

marca la posizione dell'ano, secondo la caratteristica dei deuterostomi. La β-catenina è

una proteina disposta nel nucleo dei micromeri che attiva determinati geni che mediano

l'invaginazione. Attivando la β-catenina in tutte le cellule dell'embrione si vede che tutte

cercheranno di invaginarsi nel blastocele.

SEGMENTAZIONE E GASTRULAZIONE NEGLI ANFIBI

Segmentazione oloblastica mesolicitica con simmetria radiale. La fecondazione avviene

ovunque nell’emisfero animale dell’embrione degli anfibi. Il sito d’ingresso determina

l’orientamento dorso-ventrale del girino. Il sito d’ingresso contrassegnerà il lato ventrale

mentre il lato opposto ne segnerà il lato dorsale. Il sito opposto al sito d’ingresso sarà

riconosciuto da una mezzaluna grigia e sarà proprio qui che avrà inizio la gastrulazione.

Ricordiamo che l’uovo dell’anfibio è ricco di tuorlo concentrato nell’emisfero vegetativo. La

prima divisione inizia nel polo animale e si estende lentamente verso il basso. Mentre il

primo solco sta ancora dividendo il citoplasma ricco di tuorlo è già comparso il secondo


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Nelaymi

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Nelaymi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia dello sviluppo e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Tor Vergata - Uniroma2 o del prof Cecconi Francesco.

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